Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

Самым распространенным и информативным диагностическим тестом является общий клинический анализ крови. Благодаря развитию технологий стало возможным проводить диагностику автоматическим методом, используя специальные приборы – гематологические анализаторы.

Рассмотрим физику процессов на примерах моделей LABSTAR 50 и LABSTAR 100, которые предлагает компания Медика Групп.

Основные параметры анализов

Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

  • Лейкоциты. Обеспечивают иммунную защиту организма.
  • Тромбоциты. Отвечают за свертываемость крови.
  • Эритроциты. Отвечают за транспортировку кислорода и выведение углекислого газа.

Данные виды клеток имеются в крови в определенных количествах, которые зависят от пола, возраста и состояния организма. Выработка клеток регулируется костным мозгом, который учитывает потребности и условия. Поэтому, по количеству, виду и форме клеток можно определить, как работают органы и системы человека. В общем клиническом анализе крови учитываются:

  • Количество клеток;
  • Их форма;
  • Качественные параметры.

Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

  • Нейтрофилы. Обеспечивают нейтрализацию инфекций.
  • Эозинофилы. Защищают организм от многоклеточных паразитов.
  • Базофилы. Принимают участие в аллергических реакциях.
  • Моноциты. Участвуют в фагоцитозе и утилизации.
  • Лимфоциты. Поддерживают местный иммунитет.

Нейтрофилы в зависимости от степени зрелости делятся на такие виды:

  • Палочкоядерные.
  • Сегментоядерные.
  • Миелоциты.
  • Метамиелоциты.

В лейкоцитарной формуле указывается количество каждого вида лейкоцитов в общем объеме. Это исследование позволяет определить различные патологии:

  • Увеличение нейтрофилов в лейкоцитарной формуле свидетельствует о бактериальном воспалительном процессе.
  • На тяжесть бактериальной инфекции указывает разная степень зрелости нейтрофилов.
  • О крайней тяжести бактериальной инфекции можно судить по наличию миелоцитов и метамиелоцитов.
  • При вирусных заболеваниях увеличивается количество лейкоцитов.
  • Эозинофилы повышаются при возникновении аллергических реакций.

Морфология клеток также позволяет определить состояние организма. При некоторых патологических процессах изменяются размеры и форма клеток.

Важным показателем крови является количество гемоглобина. Этот сложный белок обеспечивает органы и ткани кислородом и обеспечивает выведение из них углекислого газа. При диагностике анемий количество гемоглобина в крови играет решающее значение.

Еще одним важным параметром является скорость оседания эритроцитов или СОЭ. При возникновении в организме воспалительного процесса эритроциты слипаются друг с другом и образуют сгустки, это способствует их скорейшему оседанию по сравнению с одиночными клетками.

Как выполнялся анализ крови раньше

Забор биоматериала проводили, используя скарификатор и стеклянную трубку. Для получения крови выполнялся прокол подушечки безымянного пальца.

Это палец выбран не случайно, так как его анатомия обеспечивает минимальную угрозу возникновения сепсиса при травмировании и инфицировании.

Забор венозной крови считался более опасным в плане развития сепсиса и выполнялся только в крайнем случае в стационарных условиях.

Капли выжатой крови лаборант помещал на стеклышко, или отправлял в разные пробирки, так как для подсчета разных клеток использовали разные емкости. При помощи стеклышка подсчитывали лейкоцитарную формулу. При помощи пробирок с физраствором – эритроциты, с раствором уксусной кислоты – лейкоциты, а с соляной кислотой – определяли гемоглобин.

Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

Для подсчета клеток в лабораториях использовался специальный оптический прибор – камера Горяева. Он определял число клеток в заданном объеме.

В приборе использовалось толстое предметное стекло, в котором имелось прямоугольное углубление – камера с микроскопической сеткой. Сверху камера накрывалась тонким стеклом.

Сетка содержала 225 квадратов, 25 из которых были разделены еще на 16 квадратов.

В диагонально расположенных квадратах камеры подсчитывали эритроциты, с учетом формулы, выбранной в соответствии с пропорциями разведения и числа квадратов в сетке. Подсчет лейкоцитов проводили в больших квадратах.

Из-за маленького размера тромбоцитов, их подсчет при помощи камеры Горяева отличался высокой трудоемкостью и требовал окрашивания мазков крови.

Для подсчета лейкоцитарной формулы изучались мазки крови на стеклах. Специалист визуально определял различные виды лейкоцитов в поле зрения. Для упрощения подсчетов использовались специальные счетчики.

Что самое удивительное – уровень гемоглобина определялся визуально, с учетом цвета крови, смешанной с уксусной кислотой.

Современные методы диагностики

Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

Помимо смены технологии забора крови, изменились и методы анализа. Скарификаторы и стеклянные капилляры вместе с пробирками устарели, а им на смену пришли вакуумные контейнеры. При этом сам процесс забора крови стал менее травматическим и более унифицированным, что позволило сократить процент неточностей в исследованиях. Вакуумные емкости с антикоагулянтами и консервантами обеспечивают высокое качество образцов при хранении и транспортировке в лабораторию. Новы технологии позволяют оперативно проводить анализ биоматериала независимо от места и времени.

Для подсчета клеток крови их анализа используются современные приборы – гематологические анализаторы, принцип работы которых основан на простых законах физики. Технологию подсчета клеток запатентовали в 1953 году Джозеф и Уоллес Культеры, а принцип такого анализа носит название кондуктометрического или метод Культера.

Особенности метода

При кондуктометрическом методе подсчитывается количество импульсов, которые возникают при прохождении клеток через апертуру (отверстие с малым диаметром). С двух сторон отверстия расположено по электроду. При каждом прохождении клетки возникает электрический импульс.

Для определения концентрации определенного вида клеток через канал пропускают определенный объем биоматериала и подсчитывают число импульсов.

Для концентрации раствора имеется ограничение – она должна обеспечивать прохождение через апертуру только одной клетки в определенный момент времени.

Гематологические анализаторы прошли определенный путь развития.

Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.

  • Первый класс. Представляли собой простые счетчики, позволяющие определить от 8 до 10 параметров.
  • Второй класс. Приборы определяющие до 20 параметров крови. Они позволяют выделять популяции гранулоцитов, лимфоцитов и другие популяции клеток.
  • Третий класс. Самые современные и технологичные приборы. Их можно использовать для определения более чем сотни различных параметров. Кроме того, такие устройства часто снабжены системами приготовления мазков и предусматривают возможность вывода результатов на монитор.

Гематологические анализаторы серии Юнона LABSTAR 50 и LABSTAR 100 относятся к последнему поколению диагностических приборов. Они используют при проведении исследований метод усиления гомогенной оптической среды, определяя количество бактерий благодаря интенсивности отраженного света.

В данной серии анализаторов представлены два прибора – на 50 и на 100 флаконов, которые производят культивирование в непрерывном режиме, а также мониторят динамику бактериального роста, выдавая результаты в виде кривых роста.

Для предотвращения ошибок в результатах, в анализаторах используется автоматическая система распознавания флаконов. Кроме того, в приборах реализована опция самодиагностики, исключающая проведение исследований при нарушениях в работе – открытой дверце, неправильной установке флаконов, несоответствие температуры и т.д.

В зависимости от типа анализов, приборы позволяют выбирать время для культивирования микроорганизмов. В памяти анализатора может сохраняться неограниченное число данных об образцах.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой:

Проточная цитометрия в диагностике лимфопролиферативных заболеваний

Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.

По данным канцер-регистра Республики  Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.

Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.

Под термином «лимфома» понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ).

Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина.

Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу.

Читайте также:  Токи через одиночные натриевые (Na) - каналы.

Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.

За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.

Этиология неходжкинских лимфом недостаточно ясна. Установлена роль вируса Эпштейна–Барр в возникновении одной из редких форм — лимфомы Беркитта. Риск развития НХЛ значительно повышается при ВИЧ-инфекции, первичных и вторичных иммунодефицитах. В настоящее время установлено, что НХЛ — злокачественная опухоль из клеток иммунной системы клонального характера.

Изучается роль человеческого Т-клеточного лимфотропного вируса I-го типа и вируса герпеса. Наследственные факторы в возникновении НХЛ не имеют существенного значения. Отмечено увеличение заболеваемости НХЛ при длительном контакте с пестицидами. Лимфома Ходжкина — название введено Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2001г., — это опухолевое  заболевание  лимфатической системы.

Впервые описано  Томасом Ходжкиным в 1832 г. Хотя риск развития лимфомы Ходжкина достаточно низок – 0,24% среди мужчин и 0,2% среди женщин, около 15% всех случаев приходится на молодой возраст – от 15 до 24 лет.

Лимфома Ходжкина имеет  уникальную бимодальную (иногда трёхмодальную) возрастную кривую — заболеваемость имеет два пика — первый приходится на возраст 15-40 лет, а второй постепенно нарастает после 50 лет.

Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов.

Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:

  • собственно лейкозы, всегда протекающие с вовлечением периферической крови;
  • лейкемическая стадия (лейкемизация) лимфомы, при которой источником заболевания является периферическая лимфоидная ткань, но клинические проявления, ответ на ХТ и прогноз соответствуют лейкозу;
  • лимфоматозные формы, при которых кровь крайне редко вовлекается в патологический процесс.

Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:

  • при выходе в системный кровоток опухолевых (трансформированных) лимфоцитов зрелоклеточной морфологии (пролимфоцитарный, лимфоцитарный, волосатоклеточный лейкозы);
  • при лейкемизации лимфомы, когда происходит экспансия опухолевых клеток в периферическую кровь и костный мозг (фолликулярная лимфома, лимфома клеток маргинальной зоны, лимфомы скоплений лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, лимфома селезенки с отросчатыми (ворсинчатыми) лимфоцитами, лимфома кожи.

Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х109/л [74] до 5х109/л.

С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.

Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация.

Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров.

Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах.

Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн.

Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе.

Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами.

Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.

При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.

Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации.

С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла.

Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.

Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.

Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови.

Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток.

Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.

Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.

Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку.

Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.

Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.

Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.

Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.         Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.

Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.  

Читайте также:  Ультразвуковая диагностика пороков развития плода в перинатальном центре.

Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:

  • необработанные данные интенсивности флюоресценций в формате, определяемым программным обеспечением прибора;
  • относительное содержание (%) различных клеточных популяций по оценке врача, проводящего анализ биологического материала;
  • информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, CD34+ при исследованиях в области гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)).

Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.

Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика.

Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ.

При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках.

Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания.

К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.

Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов.

За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом.

Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.

Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ.

Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования.

Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток.

Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.

Литература

  1. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. // Под ред. Хайдукова С.В., Зурочки А.В. Челябинск. Издательство «Челябинская государственная медицинская академия». 2008, 196 С.
  2. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицин Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов, Кафедра КЛД, Москва, 2005.
  3. Immunobiology, 6-th edition, Garland Science, New York and London, 2005.
  4. Ярилин А.А. Основы иммунологии, Москва, «Медицина», 1999.
  5. Kretowski A, Mysliwiec J, Turowski D, Wysocka J, Kinalska I. Analysis of recently activated, memory and naive lymphocyte T subsets in the peripheral blood of patients with Graves' disease and insulin-dependent diabetes mellitus. Rocz Akad Med Bialymst. 1999; v.44: 226-34.
  6. Зуева Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов, Российский
  7. Биомедицинский Журнал, 2003, т.4, ст.132, стр. 471-478.
  8. Чередеев А.Н., Горлина Н.К., Козлов И.Г. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий, Клиническая лабораторная диагностика, 1999, №6, c.25-31.
  9. Laurence J. T-Cell Subsets in Health, Infectious Disease, and Idiopathic CD4+T Lymphocytopenia, Annals of Internal Medicine, 1993; 119 (1), p.55-62
  10. Reichert T, De Bruyere M, Deneys V, Totterman T, Lydyard P, Yuksel F, et al. Lymphocyte subset reference ranges in adult Caucasians. Clin Immunol Immunopathol.1991; 60:190-208.
  11.  Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека, пособие для врачей-лаборантов, Москва 2001.
  12. Поддубная И.В. Иммунодиагностика гемобластозов. Клиническая онкогематол. М.: Медицина, 2001; c. 336-75.

Микроскопия мазка крови

  • Микроскопия мазка крови – исследование под микроскопом препарата, приготовленного из капли крови.
  • Выполнение микроскопии мазка крови является опциональной частью общего анализа крови или лейкоцитарной формулы и отдельно не производится.
  • Синонимы русские
  • Микроскопическое исследование мазка крови, мазок крови, микроскопия крови, ручной подсчет лейкоцитарной формулы, мазок периферической крови.
  • Синонимы английские
  • Blood Smear, Peripheral smear, Manual differential, Red blood cell morphology, White Blood cell morphology, Peripheral blood smear, Blood Film Examination, Blood Film
  • Какой биоматериал можно использовать для исследования?
  • Венозную или капиллярную кровь.
  • Общая информация об исследовании

Исследование позволяет морфологически оценить клетки (форменные элементы) крови, а также выполнить их подсчет. Клетки крови образуются и созревают в красном костном мозге и затем выбрасываются в общий кровоток. У каждой разновидности клеток свои функции. В физиологических условиях количество и морфологические признаки клеток крови стабильны и не выходят за рамки референсных значений. При различных заболеваниях количество и свойства (форма, объем, цвет, наличие включений, их количество и пр.) закономерно изменяется. По этой причине оценка клеточных элементов в мазке крови является универсальным тестом при диагностике многих патологических состояний и широко применяется в практике врача практически любой специализации.

Мазок периферической крови – это «моментальный снимок» клеток крови в том виде, в каком они находятся в момент взятия образца. Для выполнения исследования венозную или капиллярную кровь помещают на предметное стекло, которое должно быть тщательно обезжирено.

Затем другое стекло ставят на предметное стекло под углом 45' и проводят вдоль капли крови так, чтобы она растеклась тонким слоем по ширине шлифованного стекла. Затем мазок фиксируют, чтобы форменные элементы крови были более устойчивы.

После этого мазок окрашивают специальным красителем, который делает клетки и их элементы более яркими, и высушивают. После чего врач в лаборатории изучает мазок под микроскопом.

Для чего используется исследование?

Пока не появились автоматические анализаторы, каждый раз, когда выполнялся общий анализ крови, проводилось микроскопическое исследование мазка крови, так как определить процентное соотношение различных форм лейкоцитов (лейкоцитарную формулу) по-другому было нельзя.

В современных анализаторах подсчет лейкоцитарной формулы осуществляется автоматически.

Однако при подозрении на наличие патологических форменных элементов крови микроскопия мазка крови опытным врачом по-прежнему является лучшим способом выявления и оценки атипичных и незрелых клеток.

Читайте также:  Бульбоуретральные железы. Анатомия простаты (предстательной железы). Кровоснабжение, иннервация, лимфатический отток от простаты

Когда назначается исследование?

Существует достаточно широкий круг заболеваний и расстройств, при которых могут изменяться свойства клеток, циркулирующих в кровяном русле. В норме в кровь из костного мозга попадают только зрелые клетки, однако при ряде заболеваний, например при лейкозах, в кровь могут попадать незрелые клетки – бласты.

При некоторых состояниях, например при массивной инфекции, в лейкоцитах могут появляться характерные примеси, сами клетки могут становиться атипичными, как при инфекционном мононуклеозе.

Обнаружение в мазке патологических клеток в большом количестве позволяет заподозрить вызвавшее их заболевание и назначить дополнительное обследование.

  1. Мазок крови может регулярно назначаться пациентам с онкологическими заболеваниями костного мозга, лимфоузлов для наблюдения за динамикой состояния и контроля за эффективностью лечения.
  2. Что означают результаты?
  3. Референсные значения

Нейтрофилы — палочк.: 0 — 5 %.

Нейтрофилы — сегмент.

Возраст Референсные значения
До 1 года 16 — 45 %
1-2 года 28 — 48 %
2-5 лет 32 — 55 %
5-7 лет 38 — 58 %
7-8 лет 41 — 60 %
8-12 лет 43 — 60 %
12-16 лет 45 — 60 %
Больше 16 лет 47 — 72 %

Лимфоциты, %

Возраст Референсные значения
До 1 года 45 — 75 %
1-2 года 37 — 60 %
2-4 года 33 — 55 %
4-6 лет 33 — 50 %
6-8 лет 30 — 50 %
8-10 лет 30 — 46 %
10-16 лет 40 — 45 %
Больше 16 лет 19 — 37 %

Моноциты, %

Возраст Референсные значения
До 1 года 4 — 10 %
1-2 года 3 — 10 %
Больше 2 лет 3 — 12 %

Эозинофилы, %

Возраст Референсные значения
До 1 года 1 — 6 %
1-2 года 1 — 7 %
2-4 года 1 — 6 %
Больше 4 лет 1 — 5 %

Базофилы, %: 0 — 1 %.

Причины изменения показателей

Изменения в мазке крови не всегда позволяют поставить диагноз. Как правило, они указывает на наличие некоего заболевания, что предполагает дальнейшее обследование в целях постановки точного диагноза.

  • Также рекомендуется
  • Кто назначает исследование?
  • Врач общего профиля, терапевт, хирург, инфекционист, гематолог.

Методы измерения в клинической биохимии

Биохимия:

30.11.2009

Дылдин Д.Р. — директор ООО «Юнимед-Сервис»

Шибанов А.Н. — генеральный директор А/О Юнимед, член правления Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, генеральный секретарь РАМЛД

Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.

В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.

При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.

Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения.

Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа.

Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.

Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения. 

Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.

Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).

Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются.

Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими).

От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.

Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax).

Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу.

Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.

Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата.

В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически.

Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни.

Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.

Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.

Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать.

Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей).

Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.

Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.

Рисунок 1. Принципиальная схема фотометрического анализа

Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).

Определение по конечной точке

 После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs).

По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается.

Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.

Рисунок 2.

Остановимся на этом моменте подробнее.

При калибровке по стандарту, выполняется замер оптической плотности реакционной смеси, где концентрация искомого вещества заведомо равна нулю (бланк). Затем, измеряется оптическая плотность реакционной смеси, где концентрация искомого вещества известна с высокой точностью (калибратор или, как еще говорят – стандарт), и химическая реакция подошла к концу (т.е.

время инкубации закончилось). Калибратор обычно прилагается к набору реагентов. Допустим, что 250 – это оптическая плотность бланка, 700 – это оптическая плотность стандарта.

 Получив эти величины, мы можем построить график, где на горизонтальной оси — концентрация, а по вертикальной – оптическая плотность, причем оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации.

Рисунок 3.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector