Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации. Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Схема постановки РТГА для определения типовой принадлежности вируса гриппа А Ингредиенты Номера лунок, разведения иммунной сыворотки РТГА 1 2 3 4 5 6 7 в мл 1: 10 1: 20 1: 40 1: 80 1: 160 1: 320 Контр. противогриппозные сыворотки 0, 25 Диагностические 0, 25 в вылить разведении 1: 5 Физиологический раствор 0, 25 0, 25 0, 25 — 0, 5 Вируссодержащая аллантоисная жидкость в 0, 25 разведении 1: 40 Взвесь эритроцитов кур 1% Выдерживание 1 час при комнатной температуре 0, 5 0, 5 Возможный результат Диагности- А(Н 1 N 1) +++ +++ +++ ++ — ческие А(Н 2 N 2) +++ +++ +++ — сыворотки А(Н 3 N 2) — — ++ — —

РТГА в парных сыворотках используют для серодиагностики вирусных инфекций и типирования неизвестных вирусов. В первом варианте к сериям двукратных разведении сывороток больного, взятых в начале болезни и спустя 10 -14 дней в объеме 0, 25 мл, добавляют по 0, 25 мл стандартного вирусного диагностикума.

После часовой экспозиции при комнатной температуре в каждую пробирку (лунку) доливают по 0, 5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Через 30 — 60 мин в обоих рядах определяют последние разведения сывороток, в которых отмечено торможение (отсутствие) Гемагглютинации.

В случае нарастания титра в 4 раза и более дают положительный ответ, в остальных случаях — отрицательный.

Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген – антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать.

Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами. В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции.

Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов.

На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться.

Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.

При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах.

Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

Лабораторная диагностика сифилиса

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Сифилис — это дерматовенерологическая патология, основной путь передачи которой — половой. Микроорганизм, который приводит к заболеванию — бледная трепонема. В результате её проникновения в организм, происходит медленное прогрессирование патологии с бессимптомными первыми стадиями и отягощенным течением на поздних этапах процесса. Болезнь поражает весь организм: сифилитические изменения затрагивают внутренние органы и нервную систему, проявляются на слизистых и кожных покровах, нарушают работу опорно-двигательных структур. Помимо полового способа передачи, трепонема может передаваться в быту.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Существует несколько стадий течения сифилиса, каждая из которых имеет свои симптомы и требует соответствующего лечения.

Чем проявляется болезнь?

Первичный период патологии — это общая интоксикация, высокая температура, головная боль, лимфаденопатия.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

При сифилисе происходит формирование шанкра — специфического симптома болезни. Это безболезненное повреждение кожи, плотное на ощупь с ровным, опущенным дном. Он находится в том месте, где произошел контакт с носителем бактерии и заболевание проникло в организм.

Повреждение проходит самостоятельно, через 1-1,5 месяца. После того, как шанкр появился и самостоятельно прошел, наступает вторичная стадия.Она сопровождается головной болью, высыпанием, гипертермией и недомоганием. Периоды обострений сменяются ремиссиями.

Далее следует третья стадия, при которой поражения достигают внутренних органов и нервной системы.

Когда показан анализ на сифилис?

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Необходимо подтвердить или исключить наличие патологии в таких случаях:

  • случайные половые контакты;
  • этап подготовки к оперативному лечению;
  • планирование зачатия ребенка;
  • появление симптомов сифилиса — для дифференциальной диагностики;
  • профилактический осмотр;
  • получение медицинской документации перед выходом на работу.

Перейти к анализам

Виды диагностики сифилиса

Ниже представлены различные методы определения заболевания и их описание.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Нетрепонемные тесты

Данный вид диагностики основан на определении антител, которые организм пациента вырабатывает в ответ на липиды, которые являются участками оболочки трепонемы. Эти антитела могут появиться в организме через 1-2 недели после того, как на коже образовался шанкр, что соответствует 4-5 неделям после поступления микроорганизма во внутреннюю среду.

Метод является скрининговым, то есть экспресс-диагностикой, которая не требует особых затрат времени и денег. Это как первичное определение необходимости дальнейшей диагностики, а не подтверждение сифилиса.

Также, данные тесты используют для динамической диагностики в процессе лечения — чтобы подтвердить факт успешного лечения.

Нетрепонемные тесты часто дают ложноотрицательный результат. Метод не имеет высокую чувствительность на некоторых стадиях процесса. Также, могут наблюдаться ложноположительные реакции, поэтому такая диагностика в любом случае требует дообследования.

Трепонемные методы

Методика основана на том же принципе, что и предыдущая. Отличие заключается в том, антиген в данном случае — трепонема. Для анализа берется инактивированный возбудитель, очищенный или ультраозвученный. Методика более затратная и длительная в применении. Есть модификации: иммунофлюоресценция, агглютинация, иммуноферментная реакция, иммуноблоттинг.

Данный вид исследований более точный, чем предыдущая группа тестов. Они используются для подтверждения диагноза, но среди них также есть те, которые дают ложный результат.

Иммуноферментные анализы основаны на создании комплекса из антигенов и антител. Носитель сифилиса при этом находится на специфическом носителе, а на них наносится сыворотка крови. Если антитела в сыворотке есть — формируется комплекс. Используется методика специальной маркировки, благодаря которой количество антител определяется по цвету реактива.

Метод иммунофлюоресценции основан на свойстве возбудителя светиться при наличии антител в препарате крови.

Метод иммуноблоттинга имеет высокую точность диагностики, это один из наиболее современных трепонемных тестов. Его используют для исключения или подтверждения диагноза.

Можно определить не только сам факт наличия, но и вид антител, что важно для определения стадии процесса. Методику применяют при бессимптомном течении и она показывает реальные результаты.

Для контроля состояния в динамике методика не применяется — её используют для подтверждения диагноза.

Серологические реакции

Данный вид диагностики применяется в широких целях. С его помощью можно проводить профилактические обследования, постановка диагноза на разных стадиях, определение факта выздоровления, динамическое наблюдение и контроль терапии. Особенность серологических методик — изучение иммунных изменений и характера антител.

Метод основан на антигенном строении возбудителя.

Есть антигены протеиновой природы, они общие для нескольких видов трепонем. Соответственно, против них формируются групповые антитела, а также отдельные — специфические. Антитела против протеиновых антигенов появляются на ранних стадиях: в конце инкубационного периода и в течении 6-7 дней после образования шанкра.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Антитела к полисахаридным антигенам не так информативны и важны в диагностике, поэтому мало учитываются при постановке диагноза.

Есть и третья группа антигенов — липидная. Их можно определить на 5-6 неделе болезни. Как видим, разные антитела позволяют примерно определить стадию процесса и подходят для диагностики на разных сроках.

Первыми вырабатываются антитела группы M, они соответствуют острой стадии процесса. В разгар инфекционного процесса меняется тип антител с М на G. Есть также антитела А, которых вырабатывается не так много. В зависимости от стадии процесса вырабатываются те или иные антитела, которые важны в проностическом плане.

Есть специфические и неспецифические антитела — их называют реагины и противотрепонемные, соответственно. Именно по причине наличия реагинов случается ложная реакция на сифилис.

Также различают антитела, специфичные для отдельных видов и групп возбудителя. Есть реакции, разные по специфичности и чувствительности. Их используют комплексно и несколько раз.

Есть реакции липидные, связывания комплемента и осадочные.

Есть экспресс-реакции для массового определения сифилиса. Их проводят в стационарах и амбулаториях, однако не используют для контроля процесса и перед беременностью.

Есть микрореакции, которые проводят на стекле — тест высокочувствительный и быстрый. Метод быстрый, эффективный, требуется небольшой объем крови — несколько капель.

Также применяется гемагглютинация, которая имеет высокую чувствительность на разных стадиях, при леченных и нелеченных случаях.

Реакция Вассермана

Стандартная серологическая реакция, разработанная еще в 1906 году. Первая реакция в истории диагностики сифилиса, которая используется и в наше время. Представляет собой определение связывания комплемента. Есть модификации с противолипидными и трепонемнымианитгенами.

Реакция нечувствительна в самом начале заболевания, а также в третичной стадии. Есть остальные сомнительные моменты насчет ее достоверности в зависимости от стадии и наличия лечения. Осадочные реакции проводятся по тому же методу, но при других концентрациях.

Что такое ложноположительные реакции? Это позитивная реакция у тех, кто не болел и не болеет в момент обследования.

Определить, что реакция ложная можно по тому, что в крови обнаруживаются реагины, но при этом отсутствуют иммобилизины.

Ложной реакция может быть при инфекционной патологии, воспалениях разной природы, обменных нарушениях, отравлениях, беременности, онкопатологии. Проблема также может крыться в технических недостатках проведения реакций.

Реакция иммунофлюоресценции

Данный анализ построен на принципе использования флюоресцирующих маркеров, которые проявляются при формировании комплексов антиген-антитело. К лабораторному материалу добавляют среду с содержанием антигенных штаммов. Если в организме есть инфекция, сыворотка содержит антитела. Они формируют иммунные комплексы и это проявляется в виде реакции.

Читайте также:  Транспортировка новорожденных с патологией сердечно-сосудистой системы.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Подготовка к анализу стандартная — ограничение еды и употребления жидкости за 12 часов до сдачи. Реакция проводится в 2 фазы. Положительной считается при наличии флуоресцирующих комплексов.

Реакция иммунного прилипания

Методика основана на реакции между возбудителем заболевания и сывороткой крови пациента. Если у человека есть сифилис, тканевые рецепторы трепонем адсорбируются на поверхности эритроцитов.

Образуется характерная взвесь, которую легко определить при постановке реакции. Метод умеренно сложный, так как необходимо придерживаться количественных расчетов и временных рамок постановки анализа.

При некачественном осуществлении анализа, могут формироваться недостоверные результаты.

Реакция иммобилизации бледных трепонем

Реакция относится к серологическим методам. Основана на свойстве сыворотки пациента с патологией тормозить движение возбудителя сифилиса. У здорового человека сыворотка не обладает такими свойствами.

Можно применять для различия результатов у тех, кто сдал анализы и получил ложноположительные результаты. Открывает возможность диагностики скрытой формы заболевания. Имеет широкое применение в современном мире.

Положительным тест считается при обездвиживании трепонем.

Реакция иммунофлюоресценцией адсорбцией бледных трепонем

Это модификация реакции иммунофлюоресценции, при которой используется сыворотка и капиллярная кровь. Сопровождается прикреплением трепонем к поверхности клеток, что подтверждает положительный результат и говорит о наличии заболевания.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Реакция гемагглютинационная

Основа метода заключается в свойстве скопления конгломератов из эритроцитов, на поверхности которых накапливаются антитела к трепонеме. Постановка происходит только в присутствии выработанных антител, то есть, у тех пациентов, кто является носителем возбудителя и в чьем организме произошла иммунная реакция на него.

Анализ довольно чувствителен и обладает высокой точностью. Широко применяется в современной диагностике сифилиса, а также для контроля течения болезни. Подготовка — ограничение приема пищи за 12 часов до процедуры, отказ от курения и алкоголя, крепкого чая и кофе.

Если наблюдается агглютинация, результат считается положительным.

Иммуноферментный анализ

Наиболее часто используется при диагностике заболевания. Задача анализа — определить наличие иммунных комплексов, которые состоят из антител и антигенов. Применяется твердый носитель, на котором в лабораторных условиях собраны антигены сифилиса.

Эти реактивы стандартные и используются при данной методике. Если в сыворотке есть антитела, которые образуются при болезни, реакция образуется и ее можно определить под микроскопом.

Модификация реакции использование специфических ферментов, которые ускоряют реакцию и делают результаты более явными.

Полимеразная цепная реакция

Современная методика, которая построена на обнаружении элементов нуклеиновой кислоты микобактерии. Отдельные цепи генетического материала возбудителя можно программировать и создавать проекцию ДНК возбудителя.

Относится к генетико-молекулярным исследованиям. Особой подготовки не требуется. Для анализа берется кровь из вены, которая транспортируется в лабораторию с соблюдением соответствующих правил.

Процедура проходит в условиях асептики и антисептики.

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Разнообразие лабораторных методов диагностики сифилиса позволяет выбрать вариант, наиболее соответствующий особенностям конкретного пациента, а также целям диагностики. Единственное, что объединяет эти методы — необходимость качественных реактивов, современных условий лаборатории и хорошей подготовки сотрудников учреждения.

Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 9Следующая ⇒

Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген – антитело.

С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать.

Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами.

В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов.

На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться.

Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов.

Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов.

При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур).

Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах.

Для снятия ингибиторного действия вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

2.2.1. Техника постановки РГА

На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведения в объёме 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала , начиная с 1:10 и до 1:1280. в луночки с разведениями добавляют равные объёмы 1% взвеси эритроцитов кур.

Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учёт результатов проводят по трёхкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемагглютинации на «+++» осадок имеет форму зонтика и занимает всё дно лунки.

При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

Титром вируса называется то наибольшее его разведение, при котором ещё наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В нашем примере титр вируса 1:320 (табл. 4).

Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемагглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320).

Определение этой величины необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы.

Таблица 4

Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа

Ингре- диенты РГА (в мл) Номера лунок разведения вируссодержащего материала
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 К
Вирус- содержащий материал   0,1   0,5   0,5 вылить
Физиоло- гический раствор   0,9   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5
1% взвесь эритроцитов 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Возможный результат +++ +++ +++ +++ +++ ++ титр +

Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию.

Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам.

Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА.

2.2.2. Техника постановки РТГА

РТГА с целью идентификации вируса гриппа рода А. На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающих разведений (в объёме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сывороток А(Н1N1), А(Н2N2) и А(Н3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток).

Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содержится 4 гемагглютинирующие единицы (табл. 5). После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Учёт результатов проводят через 30-40 минут.

В примере торможение произошло сывороткой А(Н3N2), следовательно выделен вирус гриппа, принадлежащий к подтипу А(Н3N2).

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

  • Таблица 5
  • Схема постановки РТГА для определения типовой принадлежности
  • вируса гриппа А
Ингредиенты РТГА в мл Номера лунок, разведения иммунной сыворотки
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 Контр.
Диагностические противогриппозные сыворотки в разведении 1:5   0,25   0,25   0,25   0,25 вылить
Физиологический раствор 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5
Вируссодержащая аллантоисная жидкость в разведении 1:40   0,25   0,25   0,25   0,25   0,25   0,25   —
Взвесь эритроцитов кур 1% Выдерживание 1 час при комнатной температуре
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Возможный результат Диагности- А(Н1N1) +++ +++ +++ +++ +++ ++ — ческие А(Н2N2) +++ +++ +++ +++ +++ +++ — сыворотки А(Н3N2) — — — — — ++ — (нейтрализация)

РТГА ставят и для определения наличия и титра антител в сыворотке больного.

Для этого готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в объёме 0,25 мл и соединяют их с 0,25 мл известного антигена (содержащего 4 гемагглютинирующие единицы), чтобы произошла нейтрализация вируса.

Затем в пробирки вносят по 0,5 мл взвеси эритроцитов. За титр сыворотки принимают то наибольшее её разведение, в котором ещё наблюдается торможение гемагглютинации (1:160).

2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo

Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая:

  1. 1) предварительный контакт вируссодержащего материала с соответствующей иммунной сывороткой (один из этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется);
  2. 2) введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам);
  3. 3) учёт наличия или отсутствия нейтрализации.

Сыворотки получают либо от больных людей, либо применяют диагностические сыворотки от иммунизированных животных. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют, прогревая при температуре 56-600С.

Читайте также:  Прямой синус мозга. затылочный синус. синусный сток. поперечный синус. сигмовидный синус. пещеристый синус головного мозга.

Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности.

Биологические объекты выбирают с учётом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования.

Постановка реакции нейтрализации (I вариант)

Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным.

В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного.

Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10-1, 10-2, 10-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл.

Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 370С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов.

За заражёнными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей.

Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD50, проводя подсчёт по Риду и Менчу.

Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:

  • Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой
  • ИН = ———————————————————————
  • Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой
  • ИН менее 10 – отрицательный;
  • ИН – 11-49 – сомнительный;
  • ИН равный 50 и выше – положительный.

Заражённые эмбрионы инкубируют при температуре 35-370С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации.

Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.

Постановка реакции нейтрализации (II вариант)

Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса.

Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD50 вируса).

Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.

При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.

Дата добавления: 2015-04-15; просмотров: 214; Нарушение авторских прав

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒ Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Реакция торможения гемагглютинации(РТГА)

Реакция гемагглютинации (РГА).

Гемагглютинация – это феномен склеивания эритроцитов вследствии воздействия на них различных микроорганизмов.

Механизм гемагглютинации заключается в склеивании эритроцитов(животных или человека), на поверхности которых адсорбировались микроорганизмы; последние являются мостиками, соединяющими соседние эритроциты.

Возможно также, что микроорганизмы, адсорбированные на поверхности эритроцитов, меняют их заряд, вследствие чего эритроциты приобретают способность склеиваться, оседая на дно пробирки или лунки планшета тонкой плёнкой в виде перевёрнутого зонтика (картина полной гемагглютинации).

Отношение разных видов микроорганизмов к агглютинации эритроцитов животных того или иного вида (или человека) устанавливают эмпирическим путём. Как правило, микроорганизмы, составляющие одну таксономическую группу, агглютинируют эритроциты одних и тех же видов животных. Видовая принадлежность агглютинируемых эритроцитов нередко используется для индикации микроорганизмов.

Реакция торможения гемагглютинации(РТГА).

Гемагглютинация – обратимый процесс. О специфичности микробной гемагглютинации судят по эффекту торможения или подавления её соответствующими антимикробными антителами. Это явление лежит в основе РТГА. Механизм РТГА заключаеться в том, что противомикробные антигемагглютинины препятствуют микроорганизмам агглютинировать эритроциты чувствительных видов животных.

В зависимости от цели постановки РТГА её результатом являеться либо идентификация изолированного штамма, гемагглютинацию которого подавила известная сыворотка, либо обнаружение специфических противомикробных антител в исследуемой сыворотке крови.

4. Реакция связывания комплемента (РСК) — это сложная реакция, которая протекает в две фазы. Для её постановки необходимы следующие ингредиенты: антиген, антитело, комплемент, эритроциты барана, гемолитическая иммунная сыворотка.

В РСК принимают участие две системы антиген — антитело: специфическая и гемолитическая. Специфическая система представляет собой:

а) известный антиген (диагностикум) и сыворотку крови больного или переболевшего данной инфекцией (содержащую соответствующие этому антигену антитела);

б) или неизвестный антиген и известную диагностическую иммунную сыворотку крови реконвалисцента. Если антиген и антитело гомологичны, они образуют специфический невидимый комплекс, который сорбирует на себе комплемент.

Адсорбция комплемента на специфическом комплексе может быть выявлена лишь с помощью гемолитической системы, которая состоит из антигена (эритроциты барана) и иммунной сыворотки (антисыворотки к нему). Гемолиз эритроцитов в гемолитической системе наступает лишь в присутствии свободного комплемента.

В случае образования специфического комплекса он адсорбирует коплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов не происходит (положительный результат).

Если антиген и антитело гетерологичны, комплемент находится в свободном виде, так как отдельно ни антигеном, ни антителом он не сорбируется.

При добавлени гемолитической системы происходит гемолиз эритроцитов (отрицательный результат).

РСК, как и все серологические реакции, универсальна. Она может быть использована для выявления вирусных антигенов в заразном материале, а также для обнаружения антител в сыворотке крови больных и переболевших.

5.Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) или непрямой гемагглютинации (РНГА), широко используется в вирусологической практике при диагностике кори, респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, заболеваний, вызываемых вирусами группы Коксаки В, клещевого энцефалита, бешенства, гепатита В, аденовирусами и др.

Суть реакции заключается в том, что эритроциты (чаще всего человека или барана), сенсибилизированные антигеном (или антителом) в присутствии гомологичного антитела (или антигена) склеиваются, т.е. дают феномен пассивной гемагглютинации.

  • Так как все антигены (антитела) хорошо сорбируются на эритроцитах, последние предварительно обрабатывают танином, после чего их способность сорбировать белки резко увеличивается.
  • Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют эритроцитарными диагностикумами, эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют антительными диагностикумами.
  • РПГА обладает более высокой чувствительностью, чем реакции связывания комплемента и встречного иммуноэлектрофореза.

Имунохроматографический анализ (ИХА) – это метод определения наличия определённых концентраций веществ в биологическом материале (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.) и основывается на реакции между антигеном и соответствующим ему антителом.

Данный метод анализа осуществляется с помощью индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-касет, которые обеспечивают скорость проведения тестирования. ИХА – сравнительно молодой метод анализа, он часто описывается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ.

Эти названия связаны со скоростью проведения этого метода анализа.

Принцип действия иммунохроматографического теста заключаеться в том, что при опускании теста в физиологическую жидкость, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Движущей фазой в данном случае являеться физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью двигаются и антитела с красителем.

Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), осуществляется его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что уже является иммунологическим методом анализа.

При этом осуществляется накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизированных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой тёмной полосы. Несвязанные антитела с красителем мигрируют дальше вдоль полоски и взаимодействуют с второстепенными антителами в контрольной зоне, где и проявляется вторая тёмная полоса.

Взаимодействие (и тёмная полоса) в контрольной зоне выявлятся всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения.

Принцип РИФоснован на определении флюоресцирующих антител. Адсорбированный антиген соеденяют с иммунной сывороткой, после чего, образуемый комплекс антиген-антитело обрабатывают γ-глобулином, соединённым с флюорисцин — изотиоцианатом.

Так как меченые флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с антигеном и тем самым обуславливают свечение препаратов в сине — фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа. Этот метод даёт возможность поставить диагноз уже через 2-48 часов от начала заболевания.

Материалами для проведения исследования могут быть смывы с носоглотки, кровь, спинномозговая жидкость и другие биологические жидкости, где может находиться возбудитель.

Реакция латекс агглютинацииявляется одним из видов реакции агглютинации, в которой в качестве носителя антигена или антитела используют синтетические полимерные частички-латексы. Эта реакция используется с целью выявления наличия антител в сыроватке крови обследуемых людей, идентификации возбудителя заболевания.

Растворимые мелкодисперсные антигены бактериальной клетки белковой или полисахаридной природы адсорбируют на поверхности монодисперсного латекса. Такие латексные частички с бактериальными антигенами под действием имvунной сыворотки склеиватся, что приводит к образованию характерного осадка — тонкой плёночки с неровными краями.

Реакцию оценивают визуально («+» по осадку плёнки на дне лунки).

Иммуноблотинг – качественный метод, который позволяет с высокой достоверностью определять Аg или Аt в любой биологической среде организма. Специфичность и чувствительность метода — 99-100 %.

Метод иммуноблотинга похожий на ИФА, однако финальный этап исследования заключается в переносе и иммобилизации биополимера (Аg или Аt) на пористую мембрану, где биополимер анализируют с помощью иммуносорбентов.

Иммуноблотинг благодаря своей специфичности относится к референс-тестам (подтверждающим).

Читайте также:  Ангиокератомы. виды ангиокератом. диагностика и лечение ангиокератом.

Иммуноферментный анализ (ИФА) или, точнее, ферментныйиммуносорбентный анализ (англ. enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) — иммунологический метод для обнаружения определенных антигенов, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело. Широко используется в лабораторной диагностике.

Существует целый ряд подходов, которые позволяют определить, состоялось ли связывание антитела с антигеном-мишенью. Один из них — это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используется для диагностики разнообразных антигенов. Процедура анализа включает такие этапы:

Реакция торможения гемагглютинации ( РТГА ). Реакции иммобилизации. Реакции иммунного лизиса. Методика реакции торможения гемагглютинации.

Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью.

Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, с помощью которых потом и выявляют данную мишень.

Раньше использовались первые антитела, которые были по своей природе поликлональными. Разработка и применение моноклональных антител дало возможность значительно улучшить специфичность иммуноферментного анализа.

Ферментный иммуносорбентный анализ широко применяется для диагностики разнообразных инфекционных заболеваний, онкопроцессов (в основном благодаря специфическим белкам и пептидам), определения разнообразных низкомолекулярных соединений, таких как токсины, лекарственные средства и т.п.

Date: 2015-05-19; view: 1386; Нарушение авторских прав

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакция нейтрализации (PH)

Это универсальная реакция служит эталоном при оценке других серологических реакций.

Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является чувствительная к вирусу живая система: животные, куриные эмбрионы или культура клеток.

  • При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через соответствующий срок учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:
  • 1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах и тканях лабораторных животных;
  • 2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;
  • 3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток. [2]
  • Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно ставить в двух вариантах:
  • 1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В этом варианте определяют титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, показателем которого служит разведение сыворотки, защищающее от действия вируса 50 % зараженных биологических систем;

2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последовательных 10-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки (обычно в разведениях 1 : 10 или 1 : 20).

При постановке данного варианта PH кроме исследуемой (или специфической) сыворотки используют и нормальную (отрицательную) сыворотку.

В этом случае определяют индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная (специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по сравнению е нормальной сывороткой.

  1. Достоинствами PH являются ее универсальность и высокая специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; относительная длительность биопробы и необходимость проведения математических расчетов. [3]
  2. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
  3. Широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов.
  4. Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.
  5. Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного.

Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса. [4]

  • РТГА можно ставить в двух вариантах:
  • 1) к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);
  • 2) к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки.
  • Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам:
  • • титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;
  • • приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);
  • • ставят главный опыт РТГА;
  • • учитывают результаты.

Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию. [5]

  1. РГТА позволяет решить следующие диагностические задачи:
  2. • обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса;
  3. • идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).

Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов. [4]

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА)

Эта реакция относится к серологическим реакциям иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (АТ). Детерминанта АГ связывается с активным центром АТ.

Соединение АГ и АТ осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил.

Прочность соединения АГ с АТ обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной стерической адаптацией активного центра АТ к АГ-детерминанте.

Серологические реакции протекают в две фазы. Первая – специфическая невидимая, — заключается во взаимодействии АГ с АТ. Вторая фаза – видимая, — проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, АТ и другими ингридиентами реакций.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА; син. реакция пассивной гемагглютинации) — метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены.

Серологический метод. Сыворотка крови обследуемого пациента (содержит неизвестные (искомые) АТ). Эритроцитарный диагностикум – содержит известный антиген, адсорбированный на поверхности эритроцита.

Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать.

Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ-АТ, служат для укрупнения корпускула и соответственно являются индикаторами наличия комплекса АГ-АТ. РНГА более чувствительна, чем РА.

РНГА может использоваться как экспресс-метод, например при диагностике чумы или газовой гангрены. Ингредиенты: исследуемый материал – неизвестный АГ, диагностикум эритроцитарный антительный (содержит известные АТ адсорбированные на поверхности эритроцита). Образование комплекса АГ-АТ влечет за собой и склеивание эритроцитов, что легко учитывать.

Реакция задержки гемагглютинации.

Реакция задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА, РТГА) широко применяется в практике как для выявления и определения титра антител в сыворотке крови больных и вакцинированных животные, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию можно только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирующими свойствами.

Агглютинация эритроцитов при вирусных инфекциях обнаруживается в результате прямого взаимодействия вируса с поверхностью эритроцитов (реакция гемагглютинации — РГА).

РГА наступает непосредственно в смеси гемагглютинирующего вируса с эритроцитами.

РГА может быть нейтрализована, если перед взаимодействием с эритроцитами к гемагглютинирующему вирусу добавить специфическую иммунную сыворотку (реакция торможения, задержка гемагглютинации — РТГА, РЗГА).

 РГА и РТГА впервые были предложены для обнаружения вируса гриппа и титрования противогриппозных антител.

Вскоре появились сообщения о гемагглютинирующей активности вирусов осповакцины, ложной чумы кур, паротита, оспы, пневмонии мышей, кори, арбо-, адено- и парагриппозных, а также кишечных вирусов.

Миксовирусы агглютинируют эритроциты многих видов животных и птиц, вирусы оспы и вакцины — эритроциты петухов, арбовирусы и вирус кори — эритроциты обезьян и гусей, большинство неполиомиелитных кишечных вирусов — эритроциты человека.

Реакция гемагглютинации визуально видна в виде хлопьев красного цвета («зонтик») – положительная реакция. При этом осадок эритроцитов – это отрицательная реакция.

Реакция торможения гемагглютинации визуализируется в виде осадка эритроцитов («пуговка») – положительная реакция. При этом хлопья агглютинации – это отрицательная реакция.

Определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом индикаторных дисков.

Важное значение в лечении и профилактике инфекционных заболеваний принадлежит химиотерапии и химиопрофилактике, эффективность которых в значительной степени зависит от чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Среди химиотерапевтических средств, используемых для лечения больных с гнойно-септическими инфекциями, ведущее место занимают антибиотики.

Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам широко используется диско-диффузионный метод. Исследуемую культуру суспензируют в стерильном физиологическом растворе приготовляя 1-миллиардную взвесь по стандарту мутности.

Бактериальную взвесь (1 мл) стерильной пипеткой наливают на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри и равномерно распределяют шпателем. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Шпатель и пипетки помещают в стакан с дезраствором.

На засеянную поверхность стерильным пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга и отступя 2 см от края чашки бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируюшим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин).

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector