Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов. : 29 Сен 2014 , Мой НГУ , том 57/58, №3/4

Вирусы являются чрезвычайно малыми объектами, имеющими размер от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров. Первым и на несколько десятилетий единственным методом их визуализации стала электронная микроскопия, позволившая не только подробно изучить строение самих вирусных частиц, называемых вирионами, но и исследовать процессы, происходящие в зараженной клетке – репликацию вируса. «Монополия» электронной микроскопии была нарушена появлением в начале 1980-х годов принципиально нового класса приборов – сканирующих зондовых микроскопов.

Относящийся к данному классу атомно-силовой микроскоп оказался инструментом, подходящим для исследования биологических объектов и позволил не только визуализировать наноразмерные структуры, но и манипулировать ими.

В частности, принципиально возможной оказалась манипуляция одиночными вирионами и прямое измерение сил, возникающих при их контакте с поверхностью клетки. Такие эксперименты позволяют получать подробные данные о самом первом и во многих случаях еще недостаточно исследованном этапе заражения клетки – адгезии вируса к ее поверхности.

Данные исследования представляют и значительный практический интерес, т.к. могут дать ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.

В известной песне Владимира Высоцкого поется: «не поймаешь нейтрино за бороду и не посадишь в пробирку…». Конечно, вирус – это не нейтрино, не атом и даже не молекула, но все же объект настолько малый, что его невозможно увидеть не только глазом, но и в обычный световой микроскоп.

Однако электронная микроскопия, в сотни тысяч раз увеличившая возможности нашего зрения, позволила не только увидеть эти удивительные объекты, но и рассмотреть их до мельчайших подробностей.

А атомно-силовая микроскопия, в такой же степени обострившая наше осязание, позволила осуществить прямую механическую манипуляцию вирусными частицами

Вирусы являются чрезвычайно малыми объектами – их размеры лежат в диапазоне от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров.

Первым и на долгое время единственным методом прямой визуализации наноразмерных частиц стала электронная микроскопия (ЭМ), которая начала развиваться в 1930-е гг.

Метод, оказавшийся очень информативным, позволил не только детально охарактеризовать структуру различных вирусов, но и исследовать процессы, происходящие в зараженной клетке.

Оказалось, что форма вирусных частиц отличается большим разнообразием: от правильных сфер до сложных структур, напоминающих кирпичи, обклеенные трубочками (вирус натуральной оспы), или щетинистых червей (вирус геморрагической лихорадки Эбола).

Еще большее разнообразие было обнаружено для стратегии репликации (размножения) вирусов.

Единственным фундаментальным свойством, общим для всех без исключения вирусов, оказался их статус облигатного внутриклеточного паразита.

Это означает, что для размножения вируса его генетический материал должен в обязательном порядке проникнуть в живую клетку и «захватить» ее ферментативный аппарат, переключив последний на производство копий вируса.

Вне клетки любой вирус является всего лишь молекулярным контейнером с генетическим материалом (ДНК или РНК) и вряд ли может считаться полноценным живым организмом, хотя по этому вопросу в научной среде до сих пор нет окончательной терминологической определенности.

Спецификой электронной микроскопии является изучение фиксированных, т. е. подготовленных специальным образом, объектов – по сути, она работает только с «мертвой» материей *. Имея дело только с «застывшими мгновениями», исследователь может лишь строить гипотезы о динамике изучаемых процессов, поскольку не имеет возможности наблюдать их течение в реальном времени.

Так, исследование репликации вируса методом просвечивающей электронной микроскопии на ультратонких срезах выглядит следующим образом: зараженные клетки обрабатывают фиксирующим раствором, обезвоживают спиртом и заливают специальной смолой.

После отвердевания смолы с помощью специального прибора – ультратома – делают ультратонкие (≈ 50 нм) срезы, которые затем наносят на специальную сетку и обрабатывают растворами солей тяжелых металлов.

Во время самого микроскопического исследования образец находится в вакуумной камере и подвергается действию пучка электронов с энергией в несколько десятков кэВ. Очевидно, что прижизненная визуализация в данном случае принципиально невозможна.

В течение почти полувека электронная микроскопия оставалась единственным методом визуализации наноразмерных объектов. Однако в начале 1980-х гг. эта монополия была нарушена появлением сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ).

Основным принципом СЗМ является сканирование – прецизионное (с высокой точностью) перемещение зонда вблизи исследуемой поверхности, сопряженное с отслеживанием определенного параметра, характеризующего взаимодействие между зондом и образцом.

Результатом такого сканирования является топографическая карта рельефа поверхности образца.

Первым прибором СЗМ стал сканирующий туннельный микроскоп (СТМ), который мог лишь весьма ограниченно использоваться для визуализации биологических объектов, так как для его работы требовалась высокая электрическая проводимость исследуемой поверхности.

В 1986 г. швейцарский физик Г. Бинниг и его коллеги создали новый прибор семейства СЗМ – атомно-силовой микроскоп (АСМ).

В основе его работы лежит силовое (Ван-дер-Ваальсово) взаимодействие атомов зонда и поверхности. АСМ не требуется электрическая проводимость поверхности образца, и он может осуществлять съемку в жидкой среде.

Поэтому этот прибор оказался удобным инструментом для исследования биологических объектов.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

С момента появления атомно-силового микроскопа было опубликовано огромное число работ, посвященных АСМ-визуализации самых разнообразных биологических образцов.

Следует все же признать, что в большинстве случаев в плане визуализации АСМ не дает ничего принципиально нового в сравнении с обычной электронной микроскопией, поэтому зачастую данный метод воспринимается биологами как техническая экзотика, а не как полноценный исследовательский инструмент.

Однако важнейшим, пусть и почти единственным преимуществом визуализации биологических объектов при помощи АСМ по сравнению с электронной микроскопией является возможность выполнения исследований нативных, природных образцов без какой-либо фиксации и специальной пробоподготовки, при физиологических параметрах среды.

Помимо визуализации рельефа поверхности с субнанометровым разрешением АСМ позволяет осуществлять прямое измерение сил, возникающих при взаимо¬действии одиночных наноразмерных объектов.

Проводятся такие измерения следующим образом: один объект закрепляется на острие зонда АСМ, а второй фиксируется на подложке, после чего зонд подводится к поверхности подложки до достижения механического контакта, а затем возвращается обратно. В ходе этого перемещения отслеживается деформация упругой консоли (кантилевера).

Зависимость этого параметра от расстояния между зондом и подложкой называется силовой кривой. С ее помощью можно определить величину силы, действующей между исследуемыми объектами.

Этот метод, названный атомно-силовой спектроскопией (АСС), может использоваться для исследования силовых характеристик взаимодействия самых разнообразных малых объектов: от неорганических наночастиц до вирусов и живых клеток.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Начальным этапом заражения клетки вирусом является адгезия (прилипание) вирусной частицы (вириона) к клеточной поверхности с последующим проникновением генетического материала вируса внутрь клетки.

Этот процесс, определяемый взаимодействием белковых рецепторов, расположенных на поверхности клетки, с поверхностными белками вириона, является критически важным для размножения вируса.

И, надо отметить, в большинстве случаев изучен недостаточно.

Поистине захватывающие перспективы исследований в этом направлении открывает АСС.

Зафиксировав одиночную вирусную частицу на острие зонда АСМ, можно осуществить измерение силы, возникающей при контакте вирусной частицы с поверхностью клетки, исследовать кинетические характеристики данного взаимодействия и даже «вдавить» вирион внутрь клетки, одновременно ведя наблюдение при помощи мощного светового микроскопа.

В таком эксперименте исследователь из пассивного наблюдателя превращается в активного участника процесса, осуществляя механическую манипуляцию исследуемым наноразмерным объектом – такую возможность не может предоставить ни один из других видов микроскопии.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Однако фиксация одиночной вирусной частицы на острие зонда атомно-силового микроскопа является весьма непростой задачей. Для успешного проведения эксперимента требуется большая подготовительная работа:

  • получить как можно более чистый и концентрированный препарат вируса;
  • подготовить на острие зонда площадку подходящего размера для посадки вириона;
  • химически активировать поверхность зонда для образования ковалентных связей при контакте с белками вируса;
  • убедиться в том, что на зонде закрепился действительно вирион, а не молекулы свободного белка или мелкие фрагменты клеток, всегда присутствующие в препаратах вирусов.
Читайте также:  Вирусы htlv-1 в развитии злокачествнных лимфом кожи.

Оценка концентрации и степени чистоты препарата вируса обычно проводится методом просвечивающей электронной микроскопии.

Площадку на острие АСМ-зонда, которое обычно изготавливают из кремния или его нитрида, формируют путем длительного сканирования кремниевой или сапфировой подложки при больших значениях развертки и силы прижатия зонда к поверхности.

Наиболее наглядной иллюстрацией для этого процесса служит изменение формы острия карандаша в ходе интенсивного рисования.

Главный вопрос, на который необходимо ответить при интерпретации любых результатов атомно-силовой спектроскопии, можно сформулировать следующим образом: «Силы между какими объектами были измерены?»

По меркам микроскопии, клетка высших организмов является относительно крупным (≈ 10 мкм) объектом, поэтому хорошо видна в световом микроскопе, при помощи которого на нее наводится кантилевер атомно-силового микроскопа.

Но как быть с самим зондом, на острие которого предполагается наличие вириона? Строго говоря, вместо вириона там может оказаться все, что угодно: монослой белковых молекул, фрагмент клетки или вириона, агрегат из нескольких вирионов, случайное загрязнение и т. д. Кроме того, в процессе измерения вирион может разрушиться или оторваться от зонда.

Визуализация же зонда с вирусной частицей методом электронной микроскопии до силовых измерений недопустима, так как под воздействием высушивания, вакуума и пучка электронов вирион приобретет необратимые изменения.

Наиболее эффективным методом решения данной проблемы оказалась визуализация острия зонда АСМ с помощью электронной микроскопии, осуществляемая непосредственно после силовых измерений. Если на острие будет обнаружена вирусная частица, уцелевшая в ходе эксперимента, то все сомнения развеются.

В течение последних пятидесяти лет в результате поистине титанической работы, проделанной электронными микроскопистами всего мира, накоплен огромный багаж знаний в области ультраструктурных аспектов репликации различных вирусов.

Создание атомно-силового микроскопа и техники силовой спектроскопии позволило вплотную приблизиться к произвольной механической манипуляции одиночными вирусными частицами.

Это выводит изучение взаимодействия вируса с клеткой на принципиально другой уровень – от структурных исследований к функциональным.

При этом атомно-силовая спектроскопия не является конкурентом для электронной микроскопии, а открывает новое самостоятельное направление исследований – наномеханику взаимодействия вирусной частицы с поверхностью клетки. Весьма вероятно, что в самом ближайшем будущем в данном направлении будут совершены фундаментальные открытия, соизмеримые по значимости с достижениями электронной микроскопии в середине прошлого века.

Изучение механизмов связывания вирусных частиц с поверхностью клетки вызывает значительный интерес не только с позиции фундаментальной науки, но и в контексте практических приложений. Более детальное понимание этих механизмов на молекулярном уровне может дать человечеству ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.

*Просвечивающая электронная микроскопия с использованием специальной жидкостной ячейки и сканирующая электронная микроскопия при атмосферном давлении позволяют исследовать биологические объекты без фиксации, но из-за ряда технических трудностей и относительно низкого пространственного разрешения эти методы не получили широкого распространения

Литература

Корнеев Д. В., Бессуднова Е. В., Зайцев Б. Н. Изучение взаимодействия наночастиц TiO2 и поверхности эритроцитов человека методом атомно-силовой спектроскопии // УНЖ. 2012. № 4. С. 73—77.

Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород: ИФМ РАН, 2004. 182 с.

Alsteens D., Pesavent E., Cheuvart G. et al. Controlled manipulation of bacteriophages using single-virus force spectroscopy // ACSNANO. 2009. V. 3(10). P. 3063—3068.

Alsteens D., Trabelsi H., Soumillion P., Dufrene Y. F., Multiparametric atomic force microscopy imaging of single bacteriophages extruding from living bacteria // Nature Communications. V. 4. Article number: 2926.

Binnig G., Quate C. F., Gerber Ch. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56(9). P. 930—933.

Cappella B., Dietler G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surf. Sci. Rep. 1999. V. 34. P. 1—104.

Malkin A.J., Plomp M., McPherson A. Unraveling the architecture of viruses by high-resolution atomic force microscopy // Methods Mol. Biol. 2005. V. 292. P. 85—108.

В публикации использованы фото автора

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов. : 29 Сен 2014 , Мой НГУ , том 57/58, №3/4

Вирус под микроскопом: от визуализации к манипуляции • Библиотека

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Вирусы являются чрезвычайно малыми объектами, имеющими размер от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров. Первым и на несколько десятилетий единственным методом их визуализации стала электронная микроскопия, позволившая не только подробно изучить строение самих вирусных частиц, называемых вирионами, но и исследовать процессы, происходящие в зараженной клетке — репликацию вируса. «Монополия» электронной микроскопии была нарушена появлением в начале 1980-х годов принципиально нового класса приборов — сканирующих зондовых микроскопов.

Относящийся к данному классу атомно-силовой микроскоп оказался инструментом, подходящим для исследования биологических объектов и позволил не только визуализировать наноразмерные структуры, но и манипулировать ими.

В частности, принципиально возможной оказалась манипуляция одиночными вирионами и прямое измерение сил, возникающих при их контакте с поверхностью клетки. Такие эксперименты позволяют получать подробные данные о самом первом и во многих случаях еще недостаточно исследованном этапе заражения клетки — адгезии вируса к ее поверхности.

Данные исследования представляют и значительный практический интерес, т.к. могут дать ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.

В известной песне Владимира Высоцкого поется: «…не поймаешь нейтрино за бороду / И не посадишь в пробирку…». Конечно, вирус — это не нейтрино, не атом и даже не молекула, но все же объект настолько малый, что его невозможно увидеть не только глазом, но и в обычный световой микроскоп.

Однако электронная микроскопия, в сотни тысяч раз увеличившая возможности нашего зрения, позволила не только увидеть эти удивительные объекты, но и рассмотреть их до мельчайших подробностей.

А атомно-силовая микроскопия, в такой же степени обострившая наше осязание, позволила осуществить прямую механическую манипуляцию вирусными частицами.

Вирусы являются чрезвычайно малыми объектами — их размеры лежат в диапазоне от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров.

Первым и на долгое время единственным методом прямой визуализации наноразмерных частиц стала электронная микроскопия (ЭМ), которая начала развиваться в 1930-е гг.

Метод, оказавшийся очень информативным, позволил не только детально охарактеризовать структуру различных вирусов, но и исследовать процессы, происходящие в зараженной клетке.

Оказалось, что форма вирусных частиц отличается большим разнообразием: от правильных сфер до сложных структур, напоминающих кирпичи, обклеенные трубочками (вирус натуральной оспы), или щетинистых червей (вирус геморрагической лихорадки Эбола).

Еще большее разнообразие было обнаружено для стратегии репликации (размножения) вирусов.

Единственным фундаментальным свойством, общим для всех без исключения вирусов, оказался их статус облигатного внутриклеточного паразита.

Это означает, что для размножения вируса его генетический материал должен в обязательном порядке проникнуть в живую клетку и «захватить» ее ферментативный аппарат, переключив последний на производство копий вируса.

Вне клетки любой вирус является всего лишь молекулярным контейнером с генетическим материалом (ДНК или РНК) и вряд ли может считаться полноценным живым организмом, хотя по этому вопросу в научной среде до сих пор нет окончательной терминологической определенности.

Спецификой электронной микроскопии является изучение фиксированных, т. е. подготовленных специальным образом, объектов — по сути, она работает только с «мертвой» материей. Имея дело только с «застывшими мгновениями», исследователь может лишь строить гипотезы о динамике изучаемых процессов, поскольку не имеет возможности наблюдать их течение в реальном времени.

Так, исследование репликации вируса методом просвечивающей электронной микроскопии на ультратонких срезах выглядит следующим образом: зараженные клетки обрабатывают фиксирующим раствором, обезвоживают спиртом и заливают специальной смолой.

После отвердевания смолы с помощью специального прибора — ультратома — делают ультратонкие (≈ 50 нм) срезы, которые затем наносят на специальную сетку и обрабатывают растворами солей тяжелых металлов.

Во время самого микроскопического исследования образец находится в вакуумной камере и подвергается действию пучка электронов с энергией в несколько десятков кэВ. Очевидно, что прижизненная визуализация в данном случае принципиально невозможна.

В течение почти полувека электронная микроскопия оставалась единственным методом визуализации наноразмерных объектов. Однако в начале 1980-х гг. эта монополия была нарушена появлением сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ).

Основным принципом СЗМ является сканирование — прецизионное (с высокой точностью) перемещение зонда вблизи исследуемой поверхности, сопряженное с отслеживанием определенного параметра, характеризующего взаимодействие между зондом и образцом.

Результатом такого сканирования является топографическая карта рельефа поверхности образца.

Первым прибором СЗМ стал сканирующий туннельный микроскоп (СТМ), который мог лишь весьма ограниченно использоваться для визуализации биологических объектов, так как для его работы требовалась высокая электрическая проводимость исследуемой поверхности.

В 1986 г. швейцарский физик Г. Бинниг и его коллеги создали новый прибор семейства СЗМ — атомно-силовой микроскоп (АСМ).

Читайте также:  Эндокринные железы. Основы эндокринологии. Система обратной связи

В основе его работы лежит силовое (Ван-дер-Ваальсово) взаимодействие атомов зонда и поверхности. АСМ не требуется электрическая проводимость поверхности образца, и он может осуществлять съемку в жидкой среде.

Поэтому этот прибор оказался удобным инструментом для исследования биологических объектов.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

С момента появления атомно-силового микроскопа было опубликовано огромное число работ, посвященных АСМ-визуализации самых разнообразных биологических образцов.

Следует все же признать, что в большинстве случаев в плане визуализации АСМ не дает ничего принципиально нового в сравнении с обычной электронной микроскопией, поэтому зачастую данный метод воспринимается биологами как техническая экзотика, а не как полноценный исследовательский инструмент.

Однако важнейшим, пусть и почти единственным преимуществом визуализации биологических объектов при помощи АСМ по сравнению с электронной микроскопией является возможность выполнения исследований нативных, природных образцов без какой-либо фиксации и специальной пробоподготовки, при физиологических параметрах среды.

Помимо визуализации рельефа поверхности с субнанометровым разрешением АСМ позволяет осуществлять прямое измерение сил, возникающих при взаимодействии одиночных наноразмерных объектов.

Проводятся такие измерения следующим образом: один объект закрепляется на острие зонда АСМ, а второй фиксируется на подложке, после чего зонд подводится к поверхности подложки до достижения механического контакта, а затем возвращается обратно. В ходе этого перемещения отслеживается деформация упругой консоли (кантилевера).

Зависимость этого параметра от расстояния между зондом и подложкой называется силовой кривой. С ее помощью можно определить величину силы, действующей между исследуемыми объектами.

Этот метод, названный атомно-силовой спектроскопией (АСС), может использоваться для исследования силовых характеристик взаимодействия самых разнообразных малых объектов: от неорганических наночастиц до вирусов и живых клеток.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Начальным этапом заражения клетки вирусом является адгезия (прилипание) вирусной частицы (вириона) к клеточной поверхности с последующим проникновением генетического материала вируса внутрь клетки.

Этот процесс, определяемый взаимодействием белковых рецепторов, расположенных на поверхности клетки, с поверхностными белками вириона, является критически важным для размножения вируса.

И, надо отметить, в большинстве случаев изучен недостаточно.

Поистине захватывающие перспективы исследований в этом направлении открывает АСС.

Зафиксировав одиночную вирусную частицу на острие зонда АСМ, можно осуществить измерение силы, возникающей при контакте вирусной частицы с поверхностью клетки, исследовать кинетические характеристики данного взаимодействия и даже «вдавить» вирион внутрь клетки, одновременно ведя наблюдение при помощи мощного светового микроскопа.

В таком эксперименте исследователь из пассивного наблюдателя превращается в активного участника процесса, осуществляя механическую манипуляцию исследуемым наноразмерным объектом — такую возможность не может предоставить ни один из других видов микроскопии.

Однако фиксация одиночной вирусной частицы на острие зонда атомно-силового микроскопа является весьма непростой задачей. Для успешного проведения эксперимента требуется большая подготовительная работа:

  • получить как можно более чистый и концентрированный препарат вируса;
  • подготовить на острие зонда площадку подходящего размера для посадки вириона;
  • химически активировать поверхность зонда для образования ковалентных связей при контакте с белками вируса;
  • убедиться в том, что на зонде закрепился действительно вирион, а не молекулы свободного белка или мелкие фрагменты клеток, всегда присутствующие в препаратах вирусов.

Оценка концентрации и степени чистоты препарата вируса обычно проводится методом просвечивающей электронной микроскопии.

Площадку на острие АСМ-зонда, которое обычно изготавливают из кремния или его нитрида, формируют путем длительного сканирования кремниевой или сапфировой подложки при больших значениях развертки и силы прижатия зонда к поверхности.

Наиболее наглядной иллюстрацией для этого процесса служит изменение формы острия карандаша в ходе интенсивного рисования.

Стратегия репликации вирусов. Методика репликации вирусов.

Главный вопрос, на который необходимо ответить при интерпретации любых результатов атомно-силовой спектроскопии, можно сформулировать следующим образом: «Силы между какими объектами были измерены?»

По меркам микроскопии, клетка высших организмов является относительно крупным (≈ 10 мкм) объектом, поэтому хорошо видна в световом микроскопе, при помощи которого на нее наводится кантилевер атомно-силового микроскопа.

Но как быть с самим зондом, на острие которого предполагается наличие вириона? Строго говоря, вместо вириона там может оказаться все, что угодно: монослой белковых молекул, фрагмент клетки или вириона, агрегат из нескольких вирионов, случайное загрязнение и т. д. Кроме того, в процессе измерения вирион может разрушиться или оторваться от зонда.

Визуализация же зонда с вирусной частицей методом электронной микроскопии до силовых измерений недопустима, так как под воздействием высушивания, вакуума и пучка электронов вирион приобретет необратимые изменения.

Наиболее эффективным методом решения данной проблемы оказалась визуализация острия зонда АСМ с помощью электронной микроскопии, осуществляемая непосредственно после силовых измерений. Если на острие будет обнаружена вирусная частица, уцелевшая в ходе эксперимента, то все сомнения развеются.

В течение последних пятидесяти лет в результате поистине титанической работы, проделанной электронными микроскопистами всего мира, накоплен огромный багаж знаний в области ультраструктурных аспектов репликации различных вирусов.

Создание атомно-силового микроскопа и техники силовой спектроскопии позволило вплотную приблизиться к произвольной механической манипуляции одиночными вирусными частицами.

Это выводит изучение взаимодействия вируса с клеткой на принципиально другой уровень — от структурных исследований к функциональным.

При этом атомно-силовая спектроскопия не является конкурентом для электронной микроскопии, а открывает новое самостоятельное направление исследований — наномеханику взаимодействия вирусной частицы с поверхностью клетки. Весьма вероятно, что в самом ближайшем будущем в данном направлении будут совершены фундаментальные открытия, соизмеримые по значимости с достижениями электронной микроскопии в середине прошлого века.

Изучение механизмов связывания вирусных частиц с поверхностью клетки вызывает значительный интерес не только с позиции фундаментальной науки, но и в контексте практических приложений. Более детальное понимание этих механизмов на молекулярном уровне может дать человечеству ключ к созданию эффективных противовирусных препаратов, защищающих клетки от проникновения вирусов.

В публикации использованы фото автора

Литература
1. Корнеев Д. В., Бессуднова Е. В., Зайцев Б. Н. Изучение взаимодействия наночастиц TiO2 и поверхности эритроцитов человека методом атомно-силовой спектроскопии // УНЖ. 2012. № 4. С. 73–77.
2. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород: ИФМ РАН, 2004. 182 с.
3. Alsteens D., Pesavent E., Cheuvart G. et al.

Controlled manipulation of bacteriophages using single-virus force spectroscopy // ACSNANO. 2009. V. 3 (10). P. 3063–3068.
4. Alsteens D., Trabelsi H., Soumillion P., Dufrene Y. F. Multiparametric atomic force microscopy imaging of single bacteriophages extruding from living bacteria // Nature Communications. V. 4. Article number: 2926.
5. Binnig G., Quate C. F.

, Gerber Ch. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56 (9). P. 930–933.
6. Cappella B., Dietler G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surf. Sci. Rep. 1999. V. 34. P. 1–104.
7. Malkin A. J., Plomp M., McPherson A. Unraveling the architecture of viruses by high-resolution atomic force microscopy // Methods Mol. Biol. 2005. V.

 292. P. 85–108.

Просвечивающая электронная микроскопия с использованием специальной жидкостной ячейки и сканирующая электронная микроскопия при атмосферном давлении позволяют исследовать биологические объекты без фиксации, но из-за ряда технических трудностей и относительно низкого пространственного разрешения эти методы не получили широкого распространения.

Вирусная репликация

Репликация вирусов — это образование биологических вирусов в процессе инфицирования в клетках-мишенях. Вирусы должны сначала проникнуть в клетку, прежде чем может произойти вирусная репликация.

Создавая множество копий своего генома и упаковывая эти копии, вирус продолжает заражать новых хозяев. Репликация между вирусами сильно различается и зависит от типа вовлеченных в них генов.

Большинство ДНК-вирусов собирается в ядре, в то время как большинство РНК-вирусов развиваются исключительно в цитоплазме. [1]

Производство / репликация вирусов [ править ]

Вирусы размножаются только в живых клетках. Хост — клетка должна обеспечивать энергию и синтетические машины и предшественник низких молекулярной массы для синтеза вирусных белков и нуклеиновых кислот. [2]

Репликация вируса происходит в семь стадий, а именно;

Приложение [ править ]

Это первый шаг репликации вируса. Вирус прикрепляется к мембране клетки — хозяина клетки . Затем он вводит свою ДНК или РНК в хозяина, чтобы инициировать инфекцию.

В клетках животных эти вирусы попадают в клетку в процессе эндоцитоза, который происходит путем слияния вируса и слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной животной клетки, а в клетках растений он проникает через процесс пиноцитоза, который действует на защемление. вирусов.

Запись [ править ]

Клеточная мембрана клетки-хозяина инвагинирует вирусную частицу, заключая ее в пиноцитотическую вакуоль . Это защищает клетку от антител, как в случае с вирусом ВИЧ .

Читайте также:  Гомеостатические механизмы при изоосмотической гипергидратации. болезнь кушинга. изоосмотическая гипердегидратация.

Удаление покрытия [ править ]

Клеточные ферменты (из лизосом ) снимают белковую оболочку вируса . Это высвобождает или делает доступными нуклеиновую кислоту или геном вируса .

Транскрипция / производство мРНК [ править ]

Для некоторых РНК- вирусов инфекционная РНК продуцирует информационную РНК ( мРНК ). Это перевод генома в белковые продукты. Для других вирусов с отрицательной цепочкой РНК и ДНК вирусы производятся путем транскрипции, а затем трансляции.

МРНК используется, чтобы инструктировать клетку-хозяина производить компоненты вируса. Вирус использует существующие клеточные структуры для репликации.

Синтез вирусных компонентов [ править ]

Следующие компоненты производятся вирусом с использованием существующих органелл хозяина :

  • Вирусные белки: вирусная мРНК транслируется на клеточных рибосомах в два типа вирусных белков:
    • Структурный: белки, составляющие вирусную частицу.
    • Неструктурные: белки, не обнаруженные в вирусной частице, в основном ферменты для репликации вирусного генома.
  • Вирусная нуклеиновая кислота (репликация генома): синтезируются новые вирусные геномы; Матрицы представляют собой либо родительский геном, либо вновь образованные комплементарные цепи в случае одноцепочечных геномов. Эти геномы состоят из вирусной полимеразы или (в некоторых ДНК-вирусах) клеточного фермента, особенно в быстро делящихся клетках.

Сборка вириона [ править ]

Вириона является просто активной или неповрежденной вирусной частицей. На этом этапе вновь синтезированный геном (нуклеиновая кислота) и белки собираются для формирования новых вирусных частиц.

Это может происходить в ядре клетки, цитоплазме или плазматической мембране большинства развитых вирусов.

Релиз (стадия освобождения) [ править ]

Зрелые вирусы высвобождаются либо в результате внезапного разрыва клетки, либо в результате постепенного вытеснения (вытеснения) окруженных вирусов через клеточную мембрану .

Новые вирусы могут вторгаться или атаковать другие клетки или оставаться в клетке в спящем состоянии . В случае бактериальных вирусов высвобождение дочерних вирионов происходит путем лизиса инфицированной бактерии. Однако в случае вирусов животных высвобождение обычно происходит без лизиса клеток.

Балтиморская система классификации [ править ]

Вирусы подразделяются на 7 типов генов, каждый из которых имеет свои собственные семейства вирусов, которые, в свою очередь, сами имеют разные стратегии репликации.

Дэвид Балтимор , лауреат Нобелевской премии по биологии, разработал систему под названием Балтиморская система классификации для классификации различных вирусов на основе их уникальной стратегии репликации.

На основе этой системы существует семь различных стратегий репликации (Балтиморский класс I, II, III, IV, V, VI, VII). Здесь кратко и в общих чертах перечислены семь классов вирусов. [3]

Класс 1: двухцепочечные ДНК-вирусы [ править ]

Этот тип вируса обычно должен проникнуть в ядро хозяина, прежде чем он сможет реплицироваться. Некоторым из этих вирусов требуются полимеразы клеток-хозяев для репликации их генома , тогда как другие, такие как аденовирусы или вирусы герпеса, кодируют свои собственные факторы репликации.

Однако в любом случае репликация вирусного генома сильно зависит от состояния клетки, допускающего репликацию ДНК, и, таким образом, от клеточного цикла . Вирус может побудить клетку к насильственному делению клетки , что может привести к трансформации клетки и, в конечном итоге, к раку .

Примером семейства в рамках этой классификации являются Adenoviridae .

Есть только один хорошо изученный пример, в котором семейство вирусов класса 1 не реплицируется в ядре. Это семейство поксвирусов , в которое входят высокопатогенные вирусы, поражающие позвоночных .

Класс 2: одноцепочечные ДНК-вирусы [ править ]

В эту категорию попадают вирусы, которые не так хорошо изучены, но все же имеют большое значение для позвоночных. Два примера включают Circoviridae и Parvoviridae .

Они реплицируются в ядре и во время репликации образуют промежуточную двухцепочечную ДНК.

Анелловирус человека, называемый TTV , включен в эту классификацию и обнаруживается почти у всех людей, бессимптомно заражая их почти во всех основных органах .

Класс 3: двухцепочечные РНК-вирусы [ править ]

Как и большинство вирусов с РНК- геномами, двухцепочечные РНК-вирусы не зависят от полимеразы хозяина для репликации в такой степени, как вирусы с ДНК- геномами. Вирусы с двухцепочечной РНК изучены не так хорошо, как другие классы.

Этот класс включает два основных семейства: Reoviridae и Birnaviridae .

Репликация является моноцистронной и включает отдельные сегментированные геномы, что означает, что каждый из генов кодирует только один белок, в отличие от других вирусов, которые демонстрируют более сложную трансляцию.

Классы 4 и 5: вирусы с одноцепочечной РНК [ править ]

Цикл репликации коронавируса (4 класс)

Эти вирусы состоят из двух типов, однако оба разделяют тот факт, что репликация происходит в основном в цитоплазме и что репликация не так зависит от клеточного цикла, как ДНК-вирусы. Этот класс вирусов также является одним из наиболее изученных типов вирусов, наряду с вирусами с двухцепочечной ДНК.

Класс 4: Вирусы с одноцепочечной РНК — положительный смысл [ править ]

Вирусы с положительной РНК и все гены, определяемые как положительно-смысловые, могут быть напрямую доступны рибосомам хозяина для немедленного образования белков. Их можно разделить на две группы, каждая из которых реплицируется в цитоплазме:

  • Вирусы с полицистронной мРНК, геномная РНК которых образует мРНК и транслируется в полипротеиновый продукт, который впоследствии расщепляется с образованием зрелых белков. Это означает, что ген может использовать несколько методов для производства белков из одной и той же цепи РНК, уменьшая размер своего генома.
  • Вирусы со сложной транскрипцией, для которых могут использоваться субгеномные мРНК, рибосомный сдвиг рамки считывания и протеолитический процессинг полипротеинов. Все это разные механизмы, с помощью которых можно производить белки из одной и той же цепи РНК.

Примеры этого класса включают семейства Coronaviridae , Flaviviridae и Picornaviridae .

Класс 5: Вирусы с одноцепочечной РНК — негативный смысл [ править ]

Вирусы с РНК с отрицательным смыслом и все гены, определенные как гены с отрицательным смыслом, не могут быть напрямую доступны рибосомам хозяина для немедленного образования белков. Вместо этого они должны транскрибироваться вирусными полимеразами в «читаемом» дополнительном положительном смысле. Их также можно разделить на две группы:

  • Вирусы, содержащие несегментированные геномы, для которых первым этапом репликации является транскрипция генома с отрицательной цепью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой с образованием моноцистронных мРНК, которые кодируют различные вирусные белки. Затем создается копия генома с положительным смыслом, которая служит шаблоном для производства генома с отрицательной цепью. Репликация происходит в цитоплазме.
  • Вирусы с сегментированными геномами, репликация которых происходит в цитоплазме и для которых вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза продуцирует моноцистронные мРНК из каждого сегмента генома.

Примеры этого класса включают семейства Orthomyxoviridae , Paramyxoviridae , Bunyaviridae , Filoviridae и Rhabdoviridae (включая бешенство ).

Класс 6: вирусы с одноцепочечной РНК с положительным смыслом, которые реплицируются через промежуточные ДНК [ править ]

Хорошо изученное семейство вирусов этого класса включает ретровирусы . Одной из определяющих особенностей является использование обратной транскриптазы для преобразования позитивно-смысловой РНК в ДНК.

Вместо использования РНК для шаблонов белков они используют ДНК для создания шаблонов, которые встраиваются в геном хозяина с помощью интегразы . Затем репликация может начаться с помощью полимераз клетки-хозяина.

Класс 7: двухцепочечные ДНК-вирусы, которые реплицируются через одноцепочечные промежуточные РНК [ править ]

Эта небольшая группа вирусов, примером которой является вирус гепатита В , имеет двухцепочечный геном с разрывом, который впоследствии заполняется, образуя ковалентно замкнутый круг ( кзкДНК ), который служит матрицей для производства вирусных мРНК и субгеномной РНК. РНК прегенома служит матрицей для вирусной обратной транскриптазы и для продукции ДНК-генома.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Робертс Р.Дж., «Патология рыб, 3-е издание», Elsevier Health Sciences, 2001.
  2. ^ Geo. F. Brooks, MD et al. «Jawetz, Melnick & Adelberg's MEDICAL MICROBIOLOGY.pdf, 26-е издание, McGraw Hill, 2013, ISBN  978-0-07-181578-9
  3. ^ NJ Dimmock et al. «Введение в современную вирусологию, 6-е издание». Блэквелл Паблишинг, 2007.
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector