Делеционные мутации вирусов. Вставки или инсерции в геном вируса.

Делеционные мутации вирусов. Вставки или инсерции в геном вируса. В связи с эпидемией коронавируса, редакция Medical Channel приняла решения направить все свои силы на борьбу с этой угрозой. Мы переводим самые свежие и лучшие статьи из научных журналов, посвященные COVID-19, поскольку убеждены, что лучшим оружием являются знания. Если вы хотите поддержать нашу редакцию, чтобы выходило как можно больше переводов, то вы можете сделать пожертвование через Yandex или подписаться на наш Patreon. Будем очень признательны вашей помощи, все собранные средства будут идти на оплату работы переводчиков, редакторов и иллюстраторов.

Yandex: https://yasobe.ru/na/medach

Patreon: https://www.patreon.com/medach

Со времен появления первых сообщений о новом виде пневмонии (COVID-19) в городе Ухань, провинции Хубэй, Китай, ведутся серьезные дискуссии о теории происхождении возбудителя — вируса SARS-CoV-2 (также называемого HCoV-19).

Инфекции, вызванные SARS-CoV-2, в настоящее время широко распространены, и по состоянию на 11 марта 2020 года было подтверждено 121 564 случая в более чем 110 странах, при этом 4373 случая заболевания оказались смертельными.

SARS-CoV-2 является седьмым коронавирусом, который достоверно вызывает какие-либо заболевания у человека. SARS-CoV, MERSCoV и SARS-CoV-2 ответственны за тяжелые респираторные проявления заболевания, тогда как HKU1, NL63, OC43 и 229E связаны с легкими симптомами.

Здесь мы рассмотрим известные данные исследований, которые позволят сделать выводы о происхождении SARS-CoV-2 из сравнительного анализа геномных данных. Мы предлагаем обзор отличительных особенностей генома SARS-CoV-2 и обсуждаем сценарии, при которых данные особенности могли возникнуть.

Наши анализы ясно показывают, что SARS-CoV-2 не является искусственной лабораторной конструкцией или целенаправленно управляемым вирусом.

Наше сравнение альфа- и бета-коронавирусов выявляет две заметные геномные особенности SARS-CoV-2:

  • на основе структурных исследований и биохимических экспериментов SARS-CoV-2, по-видимому, более оптимизирован для связывания с человеческим рецептором ACE2, нежели другие вирусы этого семейства;
  • белок-шип SARSCoV-2 имеет функциональный сайт многоосновного (фуринового) расщепления на границе S1-S2 посредством вставки 12 нуклеотидов, что дополнительно привело к приобретению трех O-связанных гликанов вокруг сайта.

Рецептор-связывающий домен (RBD) в белке шипа является наиболее вариабельной частью генома коронавируса.

Было показано, что шесть аминокислот RBD являются критическими для связывания с рецепторами ACE2 и для определения диапазона хозяев для различных SARS-CoV-подобных вирусов с координатами, основанными на SARS-CoV, — это Y442, L472, N479, D480, T487 и Y4911, которые соответствуют L455, F486, Q493, S494, N501 и Y505 в SARS-CoV-27.

Пять из этих шести остатков различаются между SARSCoV-2 и SARS-CoV (рис. 1а). На основании структурных исследований и биохимических экспериментов SARS-CoV-2, по-видимому, имеет RBD, который обладает высоким сродством к ACE2 у человека, хорьков, кошек и других видов с высокой гомологией рецепторов.

Делеционные мутации вирусов. Вставки или инсерции в геном вируса. Рисунок 1 | Особенности шиповых белков SARS-CoV-2 и родственных коронавирусов a) Мутации в контактных остатках шиповых белков SARS-CoV-2. Связывающий белок SARS-CoV-2 (красная полоса сверху) был сопоставлен с наиболее схожими с SARS-CoV-подобными коронавирусами и самим SARS-CoV. Ключевые остатки в связывающем белке, которые вступают в контакт с рецептором ACE2, отмечены синими прямоугольниками как в SARS-CoV-2, так и в родственных вирусах, включая SARS-CoV (штамм Urbani). b) Приобретение многоосновного сайта расщепления и О-связанных гликанов. Как сайт многоосновного расщепления, так и три соседних О-связанных гликана являются уникальными для SARS-CoV-2 и ранее не наблюдались в бета-коронавирусах линии В. Показаны последовательности из NCBI GenBank, коды доступа MN908947, MN996532, AY278741, KY417146 и MK211376. Последовательности коронавируса панголина представляют собой некий микс, полученный из SRR10168377 и SRR10168378 (NCBI BioProject PRJNA573298).

Хотя приведенный выше анализ предполагает, что SARS-CoV-2 может связывать человеческий ACE2 с более высокой аффинностью, вычислительный анализ предсказывает, что его взаимодействие с рецепторами сложно назвать идеальным, и что последовательность RBD отличается от показанной в SARS-CoV, чтобы быть более «удобной» для связывания с рецептором. Таким образом, высокоаффинное связывание белка шипа SARS-CoV-2 с человеческим ACE2, скорее всего, является результатом естественного отбора на человеческом или подобном человеку рецептору ACE2. Это убедительное доказательство того, что SARS-CoV-2 не является продуктом целенаправленных манипуляций.

Второй примечательной особенностью SARS-CoV-2 является многоосновный сайт расщепления (RRAR) на стыке S1 и S2, двух субъединиц шипа (Рис. 1b). Он позволяет эффективно расщепляться фурином и другими протеазами и играет роль в повышении вирулентности и наличие широкого диапазона выбора организмов-хозяев.

Кроме того, ведущий пролин также вставлен в этот сайт в SARS-CoV-2. Таким образом, вставленная последовательность является PRRA (Рис. 1b).

Предполагается, что поворот, созданный пролином, приведет к добавлению O-связанных гликанов к S673, T678 и S686, которые фланкируют сайт расщепления и являются уникальными именно для SARS-CoV-2 (Рис. 1b).

Подобные сайты многоосновного расщепления не наблюдались ни в каких родственных «бета-коронавирусах линии В», хотя другие бета-коронавирусы человека, включая HKU1 (линия А), имеют эти сайты и предсказывают О-связанные гликаны.

Учитывая уровень генетической изменчивости в шипе, вероятно, SARS-CoV-2-подобные вирусы с частичными или полными многоосновными сайтами расщепления будут позже обнаружены и у других видов. Функциональные последствия многоосновного сайта расщепления в SARS CoV-2 неизвестны, и будет важно определить его влияние на трансмиссивность и патогенез заболевания на животных моделях. 

Эксперименты с SARS-CoV показали, что вставка сайта расщепления фурином в месте соединения S1-S2 усиливает клеточное слияние, не влияя на уровень проникновения вируса. Кроме того, эффективное расщепление шипа MERS-CoV позволяет MERS, подобным коронавирусам от летучих мышей, инфицировать и клетки человека.

В случае вирусов птичьего гриппа быстрая репликация и передача в очень плотных популяциях кур стала результатом приобретения многоосновных сайтов расщепления в белке гемагглютинином (HA), который выполняет функцию, аналогичную функции белка шипа коронавируса.

Приобретение многоосновных сайтов расщепления в HA путем вставки или рекомбинации превращает вирусы птичьего гриппа с низкой патогенностью в высокопатогенные формы. Получение многоосновных сайтов расщепления HA также наблюдалось после повторного пассажа в клеточной культуре или через животных.

Функция О-связанных гликанов в новом коронавирусе пока неясна, но они могут создавать «муциноподобный домен», который экранирует эпитопы или ключевые остатки белка-шипа SARS-CoV-2. Некоторые вирусы используют муциноподобные домены в качестве щитов гликана, связанных с ускользанием от иммунного ответа.

Хотя наличие О-связанного гликозилирования в коронавирусах является лабораторно достоверным фактом, необходимы экспериментальные исследования, чтобы определить, используются ли эти сайты в SARS-CoV-2.

Маловероятно, что SARS-CoV-2 появился в результате лабораторных манипуляций с неким родственным SARS-CoV-подобным коронавирусом. Как отмечено выше, RBD SARS-CoV-2 оптимизирован для связывания с человеческим ACE2 с помощью естественного отбора, то есть механизма, отличного от ранее предсказанного.

Кроме того, если бы была проведена генетическая манипуляция, вероятно, была бы использована одна из нескольких обратных генетических систем, доступных для бета-коронавирусов. Тем не менее, генетические данные неопровержимо показывают, что SARSCoV-2 не получен из каких-либо ранее использованных вирусных магистралей.

Вместо этого мы предлагаем два сценария, которые могут правдоподобно объяснить происхождение SARS-CoV-2:

  • мутации в результате естественного отбора у животного-хозяина, предшествующие зоонозному переносу; 
  • естественный отбор у людей уже после зоонозного переноса; 
  • мы также обсуждаем, могли ли мутации в результате естественного отбора во время переноса вызвать SARS-CoV-2.

Так как многие ранние случаи COVID-19 были связаны с рынком Хуанань города Ухань, Китай, возможно, что источник инфекции в виде животных присутствовал именно в этом месте.

Учитывая сходство SARSCoV-2 с SARS-CoV-подобными коронавирусами летучих мышей, вполне вероятно, что летучие мыши служат резервуарными хозяевами для своего предшественника.

Хотя RaTG13, отобранный у летучей мыши Rhinolophus affinis, примерно на 96% идентичен SARS-CoV-2, его шип расходится в RBD, что позволяет предположить, что он не может эффективно связываться с ACE27 человека (Pис. 1a).

Малайские панголины (Manis javanica), незаконно ввезенные в провинцию Гуандун, переносили коронавирусы, похожие на SARSCoV-2. Хотя вирус летучей мыши RaTG13 остается наиболее близким к SARS-CoV-2 по характеру своего генома, некоторые коронавирусы панголина демонстрируют сильное сходство с SARS-CoV-2 в RBD, включая все шесть ключевых сайтов RBD (рис. 1).

Это ясно показывает, что связывающий белок SARS-CoV-2, оптимизированный для связывания с человеческим ACE2, является результатом естественного отбора. Ни у бета-коронавирусов летучих мышей, ни у бета-коронавирусов панголина, выделенных и изученных до настоящего времени, нет многоосновных сайтов расщепления.

Хотя не было выявлено ни одного коронавируса животных, который был бы достаточно похожим, чтобы быть прямым предшественником SARS-CoV-2. Разнообразие коронавирусов у летучих мышей и других видов подвергается многочисленным исследованиям.

Как инсерции, так и делеции могут происходить вблизи S1-S2 соединения коронавирусов, что показывает, что сайт многоосновного расщепления может возникать в результате естественного эволюционного процесса.

Читайте также:  Везикар - инструкция по применению, аналоги, отзывы и формы выпуска (таблетки 5 мг и 10 мг) лекарственного препарата для лечения недержания мочи или учащенного мочеиспускания у взрослых, детей и при беременности

Для того, чтобы вирус-предшественник приобрел как сайт многоосновного расщепления, так и мутации в связывающем белке, подходящем для связывания с человеческим АСЕ2, животному-хозяину, вероятно, потребуется высокая плотность популяции (чтобы обеспечить эффективный естественный отбор для проведения) и кодирование АСЕ2 гена, похожего на человеческий ортолог.

Вполне возможно, что предок SARS-CoV-2 попал в организм человека, приобретя геномные характеристики, описанные выше, путем адаптации во время передачи от человека к человеку.

После того, как эти изменения были получены, они позволили пандемии развиться и создали достаточно большое количество прецедентов, чтобы запустить систему наблюдения, которая и обнаружила новый вирус.

Все секвенированные до настоящего времени геномы SARS-CoV-2 имеют генетические признаки, описанные выше, и, таким образом, происходят от общего предка, который также обладал данными признаками. Присутствие в панголинах RBD, очень похожего на SARS-CoV-2, позволяет сделать вывод, что это также было возможно в вирусе, который стал распространяться и на людей.

Оценки времени происхождения последнего общего предка SARS-CoV-2, сделанные с использованием текущих данных о вирусе, указывают на появление возбудителя в конце ноября 2019 года – начале декабря 2019 года, что согласуется с самыми ранними ретроспективно подтвержденными случаями.

Следовательно, этот сценарий предполагает период нераспознанной передачи у человека между начальным зоонозным событием и приобретением многоосновного сайта расщепления.

По сути, эта ситуация характерна для MERS-CoV, для которой все случаи заболевания людей являются результатом повторного распространения вируса с верблюдов-дромадеров, приводящих к спорадическим инфекциям или коротким цепям передачи, которые в конечном итоге проходят без адаптации к дальнейшей устойчивой передаче.

Исследования полученных от человека образцов вируса могут дать информацию о том, как именно произошло его распространение и эволюция. Ретроспективные серологические исследования также могут быть информативными, поэтому было проведено несколько подобных исследований, показывающих низкую активность SARSCoV-подобных коронавирусов в некоторых районах Китая. Однако эти исследования не смогли критически ответить на вопрос, были ли воздействия вызваны предшествующими инфекциями SARS-CoV, SARS-CoV-2 или другими SARSCoV-подобными коронавирусами. Дальнейшие серологические исследования должны проводиться для определения степени предшествующего воздействия SARS-CoV-2 на человека.

Фундаментальные исследования, связанные с пассажем SARS-CoV-подобных коронавирусов летучих мышей в клеточных культурах и/или на животных моделях, ведутся в течение многих лет в лабораториях уровня 2 по биобезопасности во всем мире, и имеются документально подтвержденные случаи лабораторных утечек SARS-CoV.

Поэтому мы должны изучить возможность непреднамеренного лабораторного высвобождения SARS-CoV-2. Теоретически, возможно, что SARS-CoV-2 приобрел мутации RBD (Рис. 1a) во время адаптации к пассажу в культуре клеток, как это наблюдалось ранее в исследованиях SARS-CoV.

Однако обнаружение SARS CoV-подобных коронавирусов у панголинов с почти идентичными RBD обеспечивает гораздо более логичное объяснение того, как SARS-CoV-2 приобретал их посредством рекомбинации или мутации.

Приобретение как многоосновного сайта расщепления, так и O-связанных гликанов также противоречит сценариям, основанным на исследованиях в культуре клеток. Новые многоосновные сайты расщепления наблюдались только после длительного прохождения вируса птичьего гриппа с низкой патогенностью in vitro или in vivo.

Кроме того, гипотетическая генерация SARS-CoV-2 путем клеточной культуры или пассажа у животных потребовала бы предварительного выделения вируса-предшественника с очень высоким генетическим сходством, которое пока не было описано.

Последующее образование многоосновного сайта расщепления потребовало бы повторного пассажа в клеточной культуре или у животных с рецепторами ACE2, сходными с таковыми у людей, но такое исследование также ранее не было проведено. Наконец, генерация О-связанных гликанов также вряд ли произошла из-за пассажа в клеточной культуре, поскольку такие особенности предполагают участие иммунной системы, что невозможно в условиях клеточной культуры.

В разгар глобальной чрезвычайной ситуации в области общественного здравоохранения разумно задаться вопросом о причинах возникновения пандемии.

Детальное понимание того, как вирус животных широким шагом перешел через границы видов для столь активного заражения людей, поможет предотвратить будущие случаи зоонозного переноса. Например, если SARS-CoV-2 предварительно адаптирован к другим видам животных, то существует риск его повторного появления.

Напротив, если адаптивный процесс произошел у людей, то даже если происходят повторные зоонозные переносы, они вряд ли начнут развиваться без той же серии мутаций.

Кроме того, выявление ближайших родственников вируса SARS-CoV-2, циркулирующего у животных, будет в значительной степени способствовать изучению морфологии вируса, вирулентности и разработки тактики эффективной терапии. Действительно, наличие последовательности RaTG13 у летучих мышей помогло выявить ключевые мутации RBD и сайт многоосновного расщепления.

Особенности генома нового коронавируса, описанные в данном исследовании, могут частично объяснить вирулентность и контагиозность SARS-CoV-2 у людей. Хотя данные показывают, что SARSCoV-2 не является целенаправленно управляемым вирусом, в настоящее время невозможно доказать или опровергнуть другие теории его происхождения, описанные здесь.

Однако поскольку мы наблюдали все заметные признаки SARS-CoV-2, включая оптимизированный RBD и многоосновный сайт расщепления, в связанных коронавирусах в природе, мы не считаем, что какой-либо искусственный лабораторный сценарий правдоподобен. Большее количество исследований может изменить баланс данных в пользу одной гипотезы по отношению к другой.

Получение родственных вирусных последовательностей из животных источников было бы наиболее точным способом выявления вирусного происхождения. Например, будущее наблюдение за промежуточным или полностью сформированным многоосновным сайтом расщепления у вируса, подобного SARS-CoV-2 у животных, могло бы еще больше подкрепить гипотезы естественного отбора.

Было бы также полезно получить больше генетических и морфофункциональных данных о SARSCoV-2, включая исследования на животных моделях. Идентификация потенциального промежуточного хозяина SARS-CoV-2, а также определение последовательности вируса в очень ранних случаях были бы весьма информативными.

Независимо от точных механизмов, с помощью которых SARSCoV-2 возник в результате естественного отбора, постоянное наблюдение за пневмонией у людей и других животных, несомненно, имеет огромное значение.

Типы вирусных мутантов и взаимодействия между вирусами

Наряду с полными вирионами в процессе репродукции фор­мируются необычные по структуре и функции вирусные части­цы, которые можно объединить в три группы: псевдовирусы, вирусы-мутанты и вирусы-рекомбинанты. Псевдо- и мутантные вирионы возникают в чистых и смешанных культурах вирусов, а рекомбинантные – только в смешанных.

  • Псевдовирусы представлены вирусными капсидами. Среди псевдовирусов различают:
  • неполные псевдовирионы (вирусы-пустышки, или «вирусные тени») − полые капсиды, не содержащие вирусного генома;
  • псевдовирионы, капсиды которых вместо вирусного генома содержат нуклеиновую кислоту клетки-хозяина.

Типы вирусных мутантов. В репродуктивных циклах вирусов зако­номерно появляются вирусные гибриды-мутанты [лат. mutation, изменение], по структуре и фенотипу отличающиеся от роди­тельского (дикого) типа, но имеющие его генетическую основу, и немутационные гибриды.

Термин «мутант» («тип», «штамм», «вариант») обозначает вирус, который отличается каким-то наследуемым признаком от родительского «дикого» вируса. «Дикий тип» ― это условное обозначение определенной популяции, которое обычно применяют к ней только в связи с исследуемой мутацией, например температуроустойчивость. При этом дикий тип может содержать иные мутации.

Штаммом называют различные дикие типы одного вируса, например штаммы Орсэй и Нью-Джерси вируса везикулярного стоматита. Термин «тип» является синонимом «серотип», который определяют по нейтрализации инфекционности (специфическими антителами), например серотипы реовируса 1, 2 и 3.

Различают спонтанную и индуцированную мутации вирусов.

Индуцированная мутация. Большая часть мутантов получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами, например, азотистой кислотой, гидроксиламином, алкилирующими агентами, ультрафиолетовым облучением.

Спонтанная мутация. Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствии каких-либо мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменению фенотипа.

В основе спонтанного мутагенеза лежит «оши­бочное» спаривание азотистых оснований, обусловленное существованием двух таутомерных [греч. tauto – те же самые, meros – часть] форм азотистых оснований.

Во время реплика­ции вирусов спаривание правильного азотистого основания с основанием в таутомерной форме приводит к простой замене (транзиции) пурина на пурин или пиримидина на пиримидин. Скорости спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах низки – 10-8–10-11 на каждый включенный нуклеотид.

Например, для вируса оспы кроликов обнаружено менее 0,1 % спонтанных ts-мутантов. У РНК-содержащих вирусов скорость спонтанного мутагенеза значительно выше – 10-3–10-4 на каждый включенный нуклеотид. Для вируса везикулярного стоматита частота перехода к ts-фенотипу равна 1–5 %.

Появляющиеся мутанты, как правило, являются делеционными (лат. deletion, выпадение), т. е. утрачивающими определенный участок генома родитель­ского вируса.

Вирусные частицы с таким дефектным геномом сохраняют свою активность, но для репликации и созревания нуждаются в продуктах вирусного генома родителя – обычно в структурных и неструктурных белках.

Такой характер воспроиз­водства вирусов называют негенетическим типом взаимодейст­вия или односторонней комплементацией(дополнением); роди­тельский вирус, стимулирующий репродукцию мутанта, – виру­сом-помощником, а репродуцирующийся с его помощью му­тант – вирусом-сателлитом (спутником).

Читайте также:  Схемы слуховых аппаратов. Кохлеарные имплантаты при тугоухости.

В соответствии с этим различают 4 класса вирусов-мутантов: 1) вирусы с условно дефектными геномами; 2) ДИ-частицы, т. е. дефектные интерферирующие; 3) интеграционные вирусы с де­фектными геномами; 4) вирусы-сателлиты.

Условно-дефектные вирусы несут мутантные геномы, де­фектные в определенных условиях. Среди них чаще всего встре­чаются температурочувствительные ts— и холодочувствительные tc-мутанты, мутанты по спектру хозяев и мутанты по морфоло­гии бляшек.

У ts-мутантов нуклеотидная последовательность в геноме изменяется таким образом, что образованный ими белковый продукт сохраняет функционально активную конформацию только при пермиссивной [англ.

permissive, разрешающий] температуре около 36–38°С, а при более высокой непермиссивной температуре 39–42оС мутант становится нежизнеспособ­ным и прекращает развитие.

Наоборот, tc-мутанты размножают­ся при более высокой, чем оптимальная, пермиссивной для них температуре.

Делеционные мутации вирусов. Вставки или инсерции в геном вируса.

Дефектные интерферирующие вирусы, или ДИ-частицы, представляют собой вирионы, у которых отсутствует некоторая часть геномной РНК или ДНК, но структурные белки остаются такими же, как у родительских вирусов.

Репликация ДИ-частиц без родительских вирионов не происходит, но при совместном заражении клеток теми и другими она восстанавливается вследствие использования ген­ных продуктов дикого типа, которых они сами не вырабатыва­ют.

Для ДИ-частиц родительский вирус с полно­ценным геномом является вирусом-помощником (хелпером).

Название ДИ-частиц обусловлено тем, что утилизируя для своей репликации продукты генов хелпера, они вместе с тем угнетают репродукцию вируса-помощника, что в вирусологии называют интерференцией [лат. inter, взаимно и ferio, подавлять].

Интеграционные вирусы с дефектным геномом – это мутан­ты-типы (или виды) ретровирусов подсемейства онкорнавирусов, содержащие onс-гены [греч. oncoma, опухоль и англ.

RNA – РНК], – прежде всего саркомные вирусы-гибриды, которые в процессе эволюции, как предполагают, приобрели клеточные onс-гены.

Интегрируя с клеточным геномом, ДНК-транскрипты саркомных вирусов привносят в него onс-гены и, если они попа­дают под действие определенной регуляции клеток, после короткого латентного периода вызывают злокачественное их пе­рерождение.

Вирусы-сателлиты. Так же, как ДИ-частицы, они паразитируют на генных продуктах ви­руссов-помощников и часто интерферируют с ними, как, напри­мер, сателлит вируса некроза табака, полностью зависящий в своей репликации от одновременного заражения клеток табака его инфекционным вирусом-помощником.

Однако вирусы-сателлиты часто используют генные про­дукты неродственных им вирусов-помощников с негомологич­ными геномами.

Генетическое взаимодействие между вирусами. Различают два типа генетического взаимодействия между вирусами: комплементация и рекомбинация.

  1. Комплементацией называют взаимодействие генных продуктов вируса в смешанных вирусных культурах клеток, которое приводит к увеличению выхода одного или обоих вирусов, в то время как их генотип остается неизменным.
  2. Существует два типа комплементации:
  3. 1) неаллельная, или межгенная (наиболее типичная), при которой мутанты, дефектные по различным функциям, помогают друг другу в репликации, предоставляя функцию, дефектную у другого вируса;

2) аллельная, или внутригенная (наблюдается намного реже), которая происходит в том случае, если генный продукт, дефектный у обоих партнеров в разных доменах, образует мультимерный белок. Если такой белок состоит из субъединиц одного партнера, то он функционально неактивен, а если из субъединиц обоих партнеров, то он может принять функционально активную конформацию.

Вирус­ной рекомбинацией называют обмен генетическим материалом (отдельных участков и целых генов) между двумя вирусами с разными геномами или же вариантами одного и того же вируса, различающимися некоторыми структурными особенностями их генома. Вирус, в геноме которого при рекомбинациях произошло замещение-добавление определенного участка ДНК, называют вирусом-реципиентом (рекомбинантом).

  • Биологическое значение рекомбинаций: они не нарушают структуры вирусного генома (в отличие от мута­ций, они не летальны), а обновляют его или устраняют имеющиеся повреждения, обогащают при этом ге­нетический фонд вирусов и вносят существенный вклад в их эволюцию.
  • Внутримолекулярные рекомбинации у вирусов реализуются механизмом разрыв-воссоеди­нение, а у РНК-вирусов с сегментированным геномом – пере­мешиванием генов.
  • Среди генетических рекомбинаций ДНК-вирусов выделяют рекомбинации:

1) между двумя дикими типами вирусов с интактными (лат. intactus, нетронутый), т. е. полными, геномами. Рекомбинации между дикими типами могут быть межгенны­ми с передачей генов и внутригенными с обменом отдельных участков гена. При этом образующийся вирус-рекомбинант на­следует свойства обоих типов вирусов;

2) между диким типом и его мутантным вариантом. Формирование рекомбинантов происходит на основе мутантов.

В частности, рекомбинация между интактным геномом дикого типа и де­фектным геномом его мутанта устраняет повреждение в результате скрещивания полно­го и дефектного геномов вирусов – перекрестная, или кросс-реактивация.

Так как при этом восстанавливается утраченный признак (маркер), то ее нередко именуют феноменом «спасения маркера»;

3) между вариантами мутантов дикого типа вируса. Формирование рекомбинантов происходит на основе мутантов. Также наблюдается реактивация повреж­дений геномов, но так как ее эффективность всецело зависит от количества и тесного кооперативного взаимодействия между рекомбинирующими вирусами, то ее называют не пере­крестной, а множественной реактивацией.

В рекомбинационном процессе между вирусами, имеющими полный сегментированный геном, происходит перетасовка (пе­ресортировка) их фрагментов и образование рекомбинантов, со­держащих родственные, но не свойственные для дикого типа ге­ны, например, гены гемагглютининов и нейраминидаз других сероваров вируса гриппа типа А.

Таким образом, в клетке, зараженной смешанной культурой родственных вирусов с интактными генами, возникают вирусы-рекомбинанты и реассортанты, а при одновременном ее инфи­цировании диким типом с его мутантом или несколькими му­тантами-реактивантами.

Генетического взаимодействия между биологически и эволюционно далекими вирусами в природе не происходит вслед­ствие их высокой специфичности по спектру клеток-хозяев и интерференции, т. е. в естественных условиях из гетерогенных вирусных геномов гибридов не возникает.

Негенетическое взаимодействие вирусов. Негенетические взаимодействия часто приводят к фенотипическому маскированию истинного вирусного генотипа и возникновению немутационных гибридов. К негенетическим взаимодействиям вирусов в частности относят гетерозиготность, фенотипическое смешивание, интерференцию.

Среди немутационных вирусов-гибридов различают вирусы-гетерозиготы и «вирусы-химеры».

Вирусы гетерозиготы (греч. heteros, иной, чужой и zygoo, со­единять) представляют собой вирусные частицы, в состав кото­рых входит не один, а два различных генома вирусов или один полный с некоторой частью второго. Образование гетерозигот сравнительно редкое явление.

«Вирусы-химеры» – это вирусные частицы, содержащие полный геном, заключенный в капсид, состоящий из белка другого вируса, что происходит при так называемом фенотипическом смешивании, или транскапсидизации. Фенотипическое смешивание довольно широко распространено среди близкородственных безоболочечных вирусов, таких, на­пример, как вирусы полиомиелита типов 1 и 2, вирусов ЭКХО и Коксаки, других пикорнавирусов.

Таким образом, немутационные вирусы-гибриды – полноценные вирионы. Подобно виру­сам-мутантам, возникают путем комплементации, а не вследст­вие скрещивания геномов, как рекомбинанты.

Состояния гетерозиготности и транскапсидизации вирусов неустойчивы и быстро исчезают при пассажах.

Биологическое значение немутационных гибридов: значение гетерозигот не выяснено. Транскапсидизация же может обеспечить вирусам-гибридам широкий круг хозяев и преодоле­ние межвидовых барьеров.

Анализ мутаций, делеций, инсерций в гене CALR (ПЦР, кач.) Analysis of CALR gene mutations, deletions, insertions, PCR, qualitative

Метод определения Полимеразная цепная реакция (ПЦР), прямое секвенирование по Сэнгеру

Исследуемый материал Цельная кровь (с ЭДТА)

Мутации в гене кальретикулина CALR (расположен на р плече 19-й хромосомы) являются маркером миелопролиферативных новообразований (МПН) – заболеваний крови, сопровождаемых образованием избыточного количества зрелых миелоидных клеток. Частота обнаружения данных мутаций при эссенциальной тромбоцитемии составляет порядка 20% случаев, при первичном миелофиброзе – 25% случаев. Для истинной полицитемии дефекты гена CALR не характерны.

Патогенез CALR-позитивных МПН до конца не изучен.

Ведущей является гипотеза, согласно которой мутантный белок CALR взаимодействует с рецептором тромбопоэтина и индуцирует его структурные изменения, достаточные для активации янус киназы JAK2, задействованной в процессах передачи сигнала для выживания и пролиферации гемопоэтических клеток.

Этот процесс оказывается возможным благодаря смене отрицательного заряда С-домена белка CALR на положительный в результате делеций и инсерций в 9-м экзоне гена CALR, приводящих к сдвигу рамки считывания и изменению С-концевой последовательности полипептида. Структурно белок CALR представлен тремя доменами: N, P и С.

N-домен способен связываться с рецептором тромбопоэтина. В неизмененном белке этому противодействует домен Р. Мутантный С-конец блокирует Р-домен, освобождая N-домен и делая возможным его конкурентное связывание с рецептором. Таким образом, активация путей передачи сигнала в клетке осуществляется независимо от уровня тромбопоэтина. 

Дефекты гена CALR подразделяют на мутации типа 1 и им подобные (делеции – потери части нуклеотидной последовательности) и мутации типа 2 и им подобные (инсерции – вставки). Наиболее распространенными являются L367fsX46 (делеция 52 пар оснований) и K385fsX47 (инсерция 5 пар оснований) – на их долю приходится более 80% всех обнаруживаемых в гене CALR мутаций.

Читайте также:  Вермокс таблетки 100 мг, суспензия - инструкция по применению, формы выпуска, аналоги и отзывы

Мутации в гене CALR ассоциированы с молодым возрастом пациентов, высоким уровнем тромбоцитов, благоприятным прогнозом течения МПН. При первичном миелофиброзе наиболее длительная выживаемость отмечена у CALR-положительных пациентов с мутациями типа 2. При эссенциальной тромбоцитемии значимых различий в выживаемости больных с мутациями типа 1 и 2 не выявлено.

Методы генетической диагностики онкогематологических заболеваний

Гипотеза происхождения вирусов от транспозонов

a:2:{s:4:»TEXT»;s:71602:»

Транспозоны (ТЕ — transposable elements) — это мобильные генетические элементы, обнаруживаемые у всех живых организмов. Они способствуют регуляции экспрессии генов при развитии и адаптации, а также служат основными источниками генетических вариаций в эволюции геномов.

Например, большинство примат-специфических последовательностей, регулирующих генную экспрессию, произошли от ТЕ [1]. ТЕ составляют значительную долю большинства геномов многоклеточных эукариот: 15—47% у насекомых, 35—69% у млекопитающих и до 90% у растений [2].

У прокариот ТЕ обеспечивают возможность в ходе эволюции некоторым генам базового набора переходить в категорию вспомогательных, а вспомогательным — в базовые [3].

Кроме того, мобильные элементы бактерий при своих перемещениях инактивируют гены хозяев или изменяют их регуляцию, а также индуцируют все виды хромосомных перестроек и обеспечивают перенос генов между разными особями [4].

ТЕ образуют 2 класса: 1 — ретротранспозоны, 2 — ДНК-транспозоны. Ретро-ТЕ делятся на несущие длинные концевые повторы LTR (ретровирусы: Ty1/Copia, Ty3/Gypsy, Bel/Pao, Dirs) и не содержащие LTR (nonLTR) ретротранспозоны: LINE и SINE [5].

Ретро-ТЕ перемещается в новый локус, оставляя исходную копию на прежнем месте.

Идентичность образуемых копий способствует гомологичной рекомбинации между ТЕ, которая индуцирует внутригеномные хромосомные перестройки (делеции, транслокации, инверсии, сегментарные дупликации) и внутригенные мутации (при внедрении в ген), что рассматривается в качестве двигателя эволюции [6].

ДНК-ТЕ перемещаются путем вырезания исходной копии. Хотя для некоторых ДНК-ТЕ прокариот, например Tn1, IS1, IS2 и IS4, показано, что их транспозиции могут быть не сопряжены с исключением из мест исходной локализации в плазмидах или хромосоме («репликативные» транспозиции) [4].

Среди ДНК-ТЕ выделяют 2 подкласса: элементы вырезания/вставки и хелитроны (элементы катящегося кольца) [2]. Элементы вырезания/вставки перемещаются при помощи транспозазы (фермента класса рекомбиназ), новое место интеграции обычно находится вблизи старого [7].

Они содержат инвертированные концевые повторы (TIR — terminal inverted repeat), фланкированные дупликациями сайта-мишени (TSD — target site duplication) различной длины и состава. Последние чувствительны к транспозазам, в зависимости от ферментативных свойств которых ДНК-ТЕ относят к разным суперсемействам.

Так, для Tc1/Mariner характерны 5’-TA-3’ TSD, для piggiBack — 5’-TTAA-3’, для hoboAcTam3 — TSD длиной 8 п.н., для PIF/Harbinger — 3 п.н., для Mutator/MuDR — 9 — 12 п.н. Выявлена также новая группа ДНК-ТЕ Spy, представители которой не создают TSD при инсерции.

Вместо этого Spy транспозируют точно между нуклеотидами хозяев 5’-AAA и TTT-3’ без дупликации или модификации целевых сайтов AAATTT [2]. Кроме того, выделяют неавтономные ДНК-ТЕ.

К ним относятся миниатюрные инвертированные повторы (MITE), некоторые из которых содержат коровые повторы, имеющие тенденцию располагаться в тандемных массивах — в ряде случаев эти массивы приводят к появлению сателлитных ДНК в пери- и центромерных областях хромосом [8]. Для определения сайтов интеграции ТЕ разработаны и внедрены системы алгоритмов RelocaTE, RetroSeq, TEMP, TIF, ITIS (Identification of Transposon Insertion Sites) [9].

В геномах прокариот ТЕ составляют значительно меньшую долю, так как наибольшее значение в их эволюции имеет горизонтальный перенос (ГП) генов при помощи плазмид, интегронов и бактериофагов. У прокариот обнаруживаются как ДНК-ТЕ, так и ретро-ТЕ.

Последние у бактерий образуют 17 основных групп: интроны группы II, ретроны, DGR (diversity-generating retroelements); Abi-подобные, ассоциированные с CRISPR-Cas и подобные группе II ретро-ТЕ, а также 11 других групп ретроэлементов с неизвестными функциями.

Из них свойствами защиты от чужеродных элементов обладают DGR, Abi (abortive bacteriophage infection) и CRISPR (clustered regularly interspaced, short palindromic repeats) [10]. Несмотря на эффективность данных защитных систем, ГП у прокариот является основным источником эволюционной изменчивости.

Для эукариот большее значение в преобразовании геномов приобрели ТЕ, составляя значительную долю их геномов; вирусы же, наиболее вероятно, являются продуктами эволюции ТЕ при обретении ими способности к ГП. Разно-образие и распространенность вирусов у эукариот говорит о значении ТЕ в их происхождении.

В дальнейшем из-за выраженной мутабельности вирусы утрачивают признаки эволюционной связи со своими предшественниками.

Распределение и состав ТЕ и вирусов специфичны для разных доменов живого, что позволяет предположить их взаимопревращения в эволюции, при которых ТЕ служат источниками вирусов. Так, у прокариот большую долю составляют ДНК-содержащие вирусы, и наиболее распространенными ТЕ также являются ДНК-транспозоны.

Для эукариот, в геномах которых преобладают ретро-ТЕ, характерно превалирование РНК-содержащих вирусов. ТЕ могут быть автономными и неавтономными — последние размножаются при помощи белковых продуктов первых.

Те же свойства характерны и для вирусов — существуют сателлитные вирусы (вирофаги), репродуцирующиеся при помощи факторов более крупных вирусов [11].

Предполагается, что экзогенные ретровирусы образовались из Ty3/Gypsy LTR-содержащих ретро-ТЕ — их последовательности выявляются в геномах большинства живых организмов [12]. В отношении происхождения других вирусов нет точных данных, доказывающих их происхождение.

Логика возникновения вирусов в эволюции для передачи информации адаптирующих свойств приводит к выводу об их происхождении от ТЕ вследствие высокой мутабельности. РНК-вирусы могли возникнуть из ретро-ТЕ, а ДНК-вирусы — от ДНК-ТЕ.

При этом ферменты, используемые для интеграции в геном хозяина, могли приобрести иные свойства, необходимые для автономной репродукции под влиянием ряда мутаций. Вследствие этого произошедшие от ТЕ экзогенные вирусы утратили свойства интеграции в геном хозяина одновременно с приобретением вирулентности и передачи другим клеткам и организмам.

Благодаря мутациям многие вирусы окончательно утратили признаки ТЕ. В настоящее время обнаруживаются промежуточные эволюционные ниши, демонстрирующие механизмы возникновении вирусов от ТЕ: горизонтальный перенос ТЕ [13] и передача одомашненных ретро-ТЕ (произошедших от Ty3/gypsy) в капсидах из эндогенных белков Arc (сходных с ретровирусными Gag) между нейронами [14].

Дальнейшие мутации данных промежуточных форм могут вызвать образование экзогенных вирусов, не содержащих в своем составе последовательностей ТЕ, что является логическим завершением череды их изменений с образованием новых таксонов вирусов, характеризующихся высоким разнообразием.

Возникновение вирусов у эукариот является побочным продуктом эволюционных преобразований геномов при помощи ТЕ. В пользу данного предположения свидетельствует способность к интеграции в геном хозяина вирусов, не содержащих в своем составе генов, кодирующих необходимые для инсерции ферменты.

Например, при гепатите В возможна интеграция всего вирусного генома [15], при аденовирусных и герпес-вирусных инфекциях обычно интегрирует часть генома, при инфекции онковирусами может интегрировать как полный геном, так и его часть [16].

Тропизм вирусов к определенным тканям и интеграции в геномы их клеток также является подтверждением их происхождения от ТЕ, так как последние характеризуются активацией в специфических тканях, аранжируя генные сети для выполнения клетками тканеспецифических функций [17—19].

Кроме того, гены и последовательности ТЕ обладают высоким потенциалом при их мутациях образовывать гены функциональных РНК и их белковых продуктов, что важно для эволюции вирусов.

Подтверждением данного потенциала служит обнаружение того, что ТЕ являются важнейшими источниками генов некодирующих РНК (нкРНК) [20, 21], регуляторных последовательностей [22] и белок-кодирующих генов (БКГ) их хозяев [22—24].

Как вирусы, так и ТЕ обладают повышенной мутабельностью. Последовательности ERV (эндогенных ретровирусов) подвержены дезорганизации путем образования мутаций со сдвигом рамки считывания, стоп-кодонов и делеций, которые поражают их способность к репликации и транспозиции [25].

В связи с повышенной мутабельностью многие ТЕ утрачивают первоначальные свойства, в том числе способность к транспозициям, и кооптируются хозяевами для образования новых адаптационных признаков. Например, при помощи ТЕ-специфичных доменов выявлено множество происходящих от ТЕ генов, некоторые из которых образуют тандемные кластеры генных семей [24].

БКГ ERV также предоставляют генетический материал, кооптируемый хозяевами. Например, гены Syncytin у млекопитающих — лучшее представление доказанного одомашнивания генного продукта ERV для клеточных функций.

Гены Syncytin кооптированы от генов envelope ERV независимо у различных линий млекопитающих, выполняя физиологическую функцию в плаценте [26]. Получены многочисленные данные о происхождении эукариотических генов путем одомашнивания ТЕ, которые описаны в крупных обзорах [22, 23].

Кроме одомашнивания, ТЕ, внедренные в интроны, могут быть использованы для появления новых доменов существующих БКГ путем экзонизации. Например, в генах TMPO и ZNF451, характерных для всех позвоночных, домены LAP2α сплайсинговых изоформ произошли от ORF1 ретротранспозона DIRS1-

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector