Диагностические проблемы кариотипирования плода. Маркерные хромосомы. Мозаицизм хромосом.

Лимфоциты крови плода. Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином. Обычно анализируют 11—20 метафазных пластинок.

Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и настоятельно рекомендуется для кари-отипирования плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во II триместре, но, как показывает наш опыт, и в поздние сроки беременности. В последнем случае кариотипирование плода позволяет решить вопрос о тактике ведения беременности, родов и неонатального периода.

Диагностические проблемы кариотипированая плода

К диагностическим ошибкам при цитогенетической ПД могут привести структурные перестройки хромосом, возникшие de novo, сверхчисленные маркерные хромосомы и мозаицизм хромосом.

Структурные перестройки хромосом, возникшие de novo

Структурные перестройки хромосом, не унаследованные от кого-либо из родителей при подтвержденном отцовстве, встречаются довольно редко (0,06-0,20% от всех пренатальных исследований).

При обнаружении перестройки хромосом, действительно возникшей de novo, невозможно полностью исключить микроперестройки и, следовательно, несбалансированность хромосомного набора у плода.

В этой ситуации риск рождения ребенка с аномалиями развития составляет 10%.

Диагностические проблемы кариотипирования плода. Маркерные хромосомы. Мозаицизм хромосом.

Маркерные хромосомы

Сверхчисленные маркерные хромосомы в пренатальном периоде выявляются с частотой 0,6-0,96/1000. Все маркерные хромосомы делятся на несколько классов: возникшие de novo и семейные, мозаичные и немозаичные, спутничные и лишенные спутников.

Риск рождения ребенка с аномалиями развития зависит от хромосом, принимающих участие в их образовании, а также от их принадлежности к тому или иному классу.

Поэтому обнаружение в кариотипе плода маркерной хромосомы требует не только ее идентификации всеми доступными методами, но и кариотипирования родителей для установления происхождения маркера и формы анеуплоидии (полная или мозаичная).

Прогноз в отношении плода более благоприятен, если один из фенотипически нормальных родителей является носителем идентичной маркерной хромосомы.

Общий риск аномалий развития у плода при сверхчисленных маркерных хромосомах, возникших de novo, составляет около 8% для сателлитных маркеров (содержащих короткие плечи акроцентрических хромосом, несущих рибосомные гены) и 27% —для несателлитных.

При этом наличие эухроматинового материала, выявленного методами дифференциального окрашивания (G-,Q-,NOR-,DA/DAPI) или FISH с использованием наборов цельнохромосомных ДНК-зондов, свидетельствует о частичной трисомии и существенно увеличивает вероятность аномалий развития.

Мозаицизм хромосом

Проблеме хромосомного мозаицизма в ПД уделяется особое внимание в связи с тем, что накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о совместимости с внутриутробным развитием и живорождением многих аутосомных трисомии. При этом тяжесть проявления синдромов не зависит от формы анеуплоидии (полная или мозаичная) и доли анеупло-идных клеток в исследуемой ткани.

Вероятность обнаружения клеток с разным хромосомным набором существенно различается в зависимости от используемого метода приготовления препаратов. Однако в любом случае необходимо определить, является ли мозаицизм артефактным, т.е.

возникающим в процессе приготовления хромосомных препаратов, или он действительно отражает кариотип плода.

В отличие от аутосомных моносомий, которые, как правило, обусловлены методическими моментами, моносомия X, а также трисомии по любым хромосомам набора требуют самого пристального внимания.

Наиболее частыми источниками диагностических ошибок являются контаминация образца и псевдомозаицизм.

Контаминация образца материнскими клетками

Образцы любого эмбрионального материала могут быть контаминированы клетками материнского происхождения.

При длительном культивировании материнские клетки могут пролиферировать и приводить к диагностическим ошибкам.

Риск ошибок, обусловленных контаминацией , составляет 0,16% при культивировании клеток АЖивыше (до 0,4%) при культивировании клеток ворсин хориона.

Избежать ошибочных результатов можно лишь при сокращении времени культивирования или использовании «прямого» метода приготовления препаратов.

Во избежание диагностических ошибок при анализе лимфоцитов пуповинной крови необходимо контролировать чистоту образца в соответствии с методикой, основанной на отличиях реакции фетального гемоглобина от окраски гемоглобина взрослых эритроцитов в щелочной среде.

— Также рекомендуем «Псевдомозаицизм. Мозаицизм хромосом, ограниченный плацентой.»

Оглавление темы «Хромосомная патология плода.»: 1. Отклонения сывороточных маркеров крови как показание к пренатальному кариотипированию. 2. Программы по пренатальному кариотипированию и биохимическому скринингу в России. 3. Данные эхографии и пренатальное кариотипироваиие. 4. Формирование показаний к пренатальному кариотипироваиию. 5. Лабараторные методы пренатальной диагностики. Диагностика хромосомных болезней. 6. Основные принципы цитогенетической пренатальной диагностики. 7. Цитогенетический анализ клеток ворсин хориона плаценты. 8. Диагностические проблемы кариотипирования плода. Маркерные хромосомы. Мозаицизм хромосом. 9. Псевдомозаицизм. Мозаицизм хромосом, ограниченный плацентой. 10. Алгоритм пренатальной диагностики хромосомных болезней.

диагностические проблемы кариотипирования плода — Med24info.com

Трудности при ПД могут представлять как геномные, так и хромосомные мутации, некорректная интерпретация которых может привести к диагностическим ошибкам.

Сложными для цитогенетического анализа и требующими уточнения являются многие наследуемые аберрации хромосом, все случаи структурных перестроек, возникшие de novo, неидентифицированные сверхчисленные маркерные хромосомы, мозаи- цизм хромосом и однородительская дисомия (ОРД).

Учитывая различную диагностическую и прогностическую значимость выявленных изменений кариотипа, а также разрешающую способность уточняющих диагностических мероприятий, рассмотрим кратко каждую из этих проблем, а также оптимальные варианты их решения.

  1. структурные перестройки хромосом, возникшие de novo

Если показанием для кариотипирования плода является носитель- ство структурной перестройки одним из родителей, то при выборе способа инвазивного вмешательства необходимо учитывать особенности хромосомной аберрации. К сожалению, разрешающая способность цитогенетического анализа на «прямых» препаратах хориона по сравнению с препаратами из культивированных клеток плода (лимфоцитов или амниоцитов) невысока. Поэтому точная диагностика в I триместре беременности ограничена Робертсоновскими транслокациями, а также другими перестройками, существенно меняющими морфологию хромосом. При реципрокных транслокациях, в образовании которых принимают участие равноценные по размеру и сходные по рисунку дифференциальной исчерченности участки хромосом, предпочтительнее проводить диагностику по лимфоцитам пуповинной крови. Аналогичных рекомендаций следует придерживаться и в случаях парацентрических и перицентрических инверсий. Наибольшие трудности при анализе хромосом даже из культивированных клеток представляют небольшие по размеру перестройки, особенно если они локализованы в теломерных G-отрицательных сегментах хромосом. Следует подчеркнуть, что практически во всех случаях семейного носительства перестроек целесообразно проводить сравнительный анализ хромосом плода и родителей, используя комплекс методов дифференциального окрашивания и FISH с ДНК-зондами, необходимых для идентификации конкретной перестройки. Спонтанные хромосомные аберрации, то есть перестройки, не унаследованные от кого-либо из родителей при подтвержденном отцовстве, пренатально встречаются относительно редко (0,06-0,20 % от всех исследований) [749]. В наших исследованиях их частота составила 0,07 % (у 5 из 7579 плодов). При обнаружении хромосомной перестройки, действительно возникшей de novo, невозможно полностью исключить сопутствующие микроперестройки и, следовательно, несбалансированность хромосомного набора, и, тем более, определить наличие генных мутаций в точках разрывов. В этой ситуации, согласно рекомендациям Европейского общества перинатологов, риск рождения ребенка с какими-либо аномалиями развития оценивается в 10 % [749].

Принимая во внимание, что информация о развитии плода, полученная с помощью УЗИ, ограничена оценкой состояния отдельных органов и систем, желательно во всех случаях неясного цитогенетического диагноза проводить кариотипирование биологических родителей. К таким случаям относятся также структурно полиморфные участки хромосом, которые необходимо дифференцировать от структурных аномалий:

  • прицентромерные гетерохроматиновые районы хромосом 1, 16 и особенно 9 (варианты 9qh, 9ph, 9phqh);
  • спутники на коротких плечах хромосомы 17 и на длинном плече Y-хромосомы;
  • вариабельные размеры коротких (р) плеч акроцентрических хромосом групп D и G;
  • длинное плечо Y-хромосомы, включая район Yqh.

Стандартная схема диагностики структурных перестроек, в том числе при отсутствии информации о кариотипе родителей на момент проведения Диагностические проблемы кариотипирования плода. Маркерные хромосомы. Мозаицизм хромосом.
Рис. 9.5. Принципиальная схема пренатальной диагностики хромосомных мутаций анализа, предполагает ряд диагностических мероприятий (рис. 9.5). При обнаружении структурной перестройки (или подозрении на ее наличие) необходимо уточнить ее происхождение, т. е. провести кариотипиро- вание родителей. В любом случае необходимо определить сбалансированность аберрации, для чего предпринять попытки уточнения точек разрывов методом FISH с использованием локус-специфичных ДНК-зондов. При установлении родительской принадлежности сбалансированной хромосомной аберрации рекомендуется пролонгирование беременности с УЗ-контролем в динамике. Если установлен факт возникновения морфологически сбалансированной аберрации de novo, необходимо проинформировать беременную о высоком риске отклонений в развитии плода, а также о возможных психических и физических нарушениях у ребенка после рождения. Рекомендации по ведению беременности в этом случае целесообразно вырабатывать на пренатальном консилиуме с привлечением неонатологов и педиатров. В случае несбалансированного кариотипа, обусловленного перестройкой de novo или унаследованного от родителей вследствие сегрегации перестроенных хромосом, рекомендуется прерывание беременности. Следует подчеркнуть, что кариотипирование родителей при обнаружении любой хромосомной перестройки у плода является обязательным, т. к. имеет принципиальное значение не только для диагностики при настоящей беременности, но и для прогноза здоровья будущих детей. Зачастую носители структурных перестроек выявляются именно в таких ситуациях. Носители хромосомных мутаций (реципрокных и Робертсоновских транслокаций, изохромосом, маркерных хромосом) относятся также к группе повышенного риска по ОРД у плода. Наличие хромосомных перестроек приводит к образованию гамет с частичной или полной анеуплоидией, при последующей коррекции которой возникает ОРД по хромосомам или сегментам хромосом, вовлеченных в перестройку. В этих группах, a priori имеющих риск ОРД у плода, целесообразно заранее предусмотреть получение пуповинной крови одновременно для цитогенетической и молекулярной диагностики во избежание повторных инвазивных манипуляций.

Особенного внимания заслуживают Робертсоновские транслокации с участием хромосом 14 и 15.

Читайте также:  Миопатии и нарушения сна. Нарушение зрения. Исследование зрительной системы.

Риск ОРД составляет 0,65 %, если аберрантная хромосома образована негомологичными хромосомами, и 66 % — если она представлена транслокацией между гомологами или изохромосомой [868].

В случаях обнаружения при пренатальном кариотипировании таких структурных перестроек, наследуемых или возникших de novo, рекомендуется тестирование ОРД. 

Источник: Баранов В.С., Кузнецова Т. В., «Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты» 2007

А так же в разделе «диагностические проблемы кариотипирования плода »

Что такое мозаичный эмбрион?

Преимплантационное генетическое тестирование эмбрионов на анеуплоидии (PGT-A) – это генетический анализ, который используется для повышения успешности ЭКО путем получения информации о хромосомном здоровье эмбриона.

Эмбрионы с правильным набором хромосом 46 – (эуплоидные) имеют больше шансов на имплантацию и развитие успешной беременности, чем эмбрионы с неправильным набором хромосом (анеуплоидные). У здорового человека в клетках 46 хромосом. На самом деле у нас есть две пары каждой хромосомы, одну из которых мы получаем от нашей биологической матери, а другую – от нашего биологического отца.

  • PGT-A проводится по причине того, что у анеуплоидных эмбрионов очень высока вероятность неудачной имплантации или прерывания беременности.
  • Вероятность получения анеуплоидного эмбриона увеличивается с возрастом.
  • Как PGT-A может улучшить показатели успеха программы ЭКО?

Бывают такие варианты, когда из пары хромосом присутствует только одна хромосома – моносомия. Или же наоборот, вместо 2 хромосом, их 3, что называется трисомией. В результате преимплантационного генетического тестирования, эмбрион, у которого есть такие хромосомные изменения, называется анеуплоидным.

Однако недавние достижения в технологии PGT-A выявили третий вариант результатов PGT-A, которые находятся где-то посередине.

Такой вариант, получивший название мозаичных эмбрионов (содержит сочетание анеуплоидных и эуплоидных клеток).

Причина в том, что секвестирование ДНК для тестирования PGT стало более продвинутым и более чувствительным. Эта обновленная технология известна как NGS (следующее поколение секвестрования).

Теперь мы стали видеть более мелкие детали, тогда как раньше это было невозможно.

Сейчас можно услышать — «40% мозаика», что означает, что 40% клеток анеуплоидные, а 60% – эуплоидные (по данным биопсии).

Результат PGT эуплоидного (здорового) эмбриона
Результат низкоуровневого мозаицизма эмбриона по трисомии 18 хромосомы (47,XY + 18)
Результат высокоуровневого мозаицизма эмбриона по трисомии 18 хромосомы (47,XY + 18)

  • 80% определения анеуплоидых клеток – считать эмбрион анеуплоидным.

Мозаицизм не обязательно присутствует во всем эмбрионе, он может быть только в определенных его участках. При биопсии эмбриона (бластоцисты) берутся клетки трофэктодермы (ТЭ), которыя в будущем формируют плаценту, а внутриклеточную массу (ВКМ), из которой будет формироваться плод, не затрагивают.

Мы должны помнить, что мозаицизм, выявленный в образце трофэктодермы, не всегда указывает на наличие мозаицизма в внутриклеточной массе, что, в свою очередь, не приводит к появлению мозаицизма у самого плода.

Какая частота мозаичных эмбрионов по данным PGTA?

Мозаика встречается примерно у 15-90% эмбрионов на стадии дробления и у 30-40% бластоцист (5-ти суточной стадии развития эмбриона) (Spinella et al. 2018), возникает с одинаковой частотой независимо от возраста (Munne et al., 2017), от всех протестированных эмбрионов методом PGT-A.

Очевидно, что эуплоидные эмбрионы – имею выше шанс достичь  наступления успешной беременности. В этом случае наиболее частый вопрос, который пациенты задают при получении результатов PGT-A: «Как влияет этот мозаичный результат на беременность или ребенка?».

Ответ сложен. Хотя мозаицизм существовал всегда, его можно было обнаружить только в течение нескольких лет, поэтому последующие исследования все еще продолжаются.

Тем не менее есть некоторые руководящие принципы и рекомендации профессионального медицинского сообщества.

Почему происходит мозаицизм эмбриона?

Причина возникновения полностью анеуплоидных эмбрионов является ошибка мейоза в яйцеклетке или сперматозоиде, и эта ошибка затем переносится в каждую клетку эмбриона.

В мозаичных эмбрионах ошибка возникает после оплодотворения, поражаются только те клетки, которые происходят от клетки с нарушением при ее делении. Важен тот факт, что уровень мозаицизма напрямую зависит от времени митотической ошибки. Если ошибка произойдет в ранней фазе деления клеток, тогда будет затронуто больше клеток, чем если бы это произошло на более позднем этапе.

  1. Вероятно, мозаицизм эмбриона может быть результатом быстрого деления клеток и расслабления «контрольных точек», характерных для раннего развития эмбриона, и что это переходная фаза во время развития (McCoy 2017).
  2. Для проведения PGT-A эмбриолог проводит получение, как правило, около 5-8 клеток у эмбриона на стадии бластоцисты, что для эмбриона полностью безопасным.
  3. И так в образце биопсии для PGT-A если 5 из 5 клеток являются эуплоидными, то эмбрион является эуплоидным.
  4. Соответственно, при проведении тестирования 5 клеток, мозаицизм минимально может составить 20% (1 из 5 клеток), а самый высокий показатель может быть 80% (4 из 5 клеток).
  5. Международное общество по преимплантационной генетической диагностике (PGDIS) по выполнению PGT-A, рекомендуют классифицировать результаты следующим образом:

Международное собщество по преимплантационной генетической диагностике (PGDIS) рекомендовало отдавать приоритет мозаичным эмбрионам для переноса в зависимости от уровня мозаицизма и конкретной задействованной хромосомы.

Поскольку мозаицизм – относительно новый термин,  по этой теме не так много данных, большинство рекомендаций сводятся к тому, что при переносе мозаичного эмбриона важно смотреть, какие хромосомы затронуты и могут ли быть связанные синдромы:

  • Мозаицизм трисомии 21 хромосомы (синдром Дауна) не рекомендован, потому что это может привести к рождению ребенка с этим синдромом.
  • Мозаика для моносомии 10 может быть предпочтительнее, поскольку большинство моносомий (отсутствие одной хромосомы) (кроме синдрома Тернера –  45  Х0) не выживают, поэтому эмбрион должен будет само корректироваться, чтобы привести к рождению ребенка.

Grati et al. (2018) установили основные рекомендации в зависимости от вовлеченности конкретной хромосомы, оценили каждую из трисомий мозаичного эмбриона.

  • Наивысший приоритет для переноса. Очень низкий риск любых  неблагоприятных исходов: мозаичные трисомии 1, 3, 10, 12 и 19
  • Вторая группа, которую следует рассмотреть для передачи. Немного повышенная вероятность выкидыша: 4, 5, (47, XXY)
  • Третья группа, которую следует рассмотреть для переноса. Немного более высокий риск выкидыша, или относительно низкий риск трисомий 7 и 11 одно родительской дисомии (UPD) – то есть, когда у плода две хромосомы от одного и того же родителя, а не по одной копии от каждого: 2, 7, 11, 17, 22
  • Возможность переноса следует рассматривать с осторожностью и только после подробного обсуждения с потенциальными родителями. Повышенный риск выкидыша, UPD или жизнеспособной анеуплоидии: 6, 9, 15
  • Возможность переноса эмбриона может быть рассмотрена после обсуждения с потенциальными родителями возможных клинических проявлений. Высокий риск поражения плода и несколько повышенный риск выкидыша и жизнеспособной анеуплоидии: 8, 20, (47, XXX), (47, XXY)
  • Лучше избегать. Очень высокий риск любых вышеупомянутых неблагоприятных исходов: 13, 14, 16, 18, 21, (45, X).

Показатели успешности мозаичных эмбрионов следует оценивать в зависимости от % мозаицизма (какой процент клеток у эмбриона содержит анеуплоидию).

Munne et al. (2017): 56% развивающаяся беременность (если мозаицизм 20-40%) при  22%  развивающейся беременности (если мозаицизм > 40%);

Spinella et al. (2018): 42% живорождений  (при 50% мозаичных эмбрионах). Частота выкидышей одинакова в обеих группах.

Мозаицизм низкого уровня может иметь сравнимый успех с переносом эуплоидных эмбрионов.

Важным показателем является репродуктивный возраст женщины при переносе мозаичного эмбриона.

Виктор и др. (2019) обнаружили, что возможность имплантации мозаичных эмбрионов может уменьшаться с возрастом – с 56% у женщин  моложе 34 лет до 27% у женщин старше 34 лет.

Авторы предполагают, что такие показатели могут быть по причине того, что самокоррекция более эффективна в более молодом репродуктивном возрасте.

Большинство мозаичных эмбрионов становятся полностью анеуплоидными или эуплоидными к 12 дню развития (Popovic et al. (2019).

Способность исправлять себя можно объяснить следующим образом: в мозаичном эмбрионе клетки с анеуплоидией могут делиться медленнее, истощаться и погибнуть с большей вероятностью в сравнении с хромосомно здоровыми (эуплоидными) клетками, которые растут быстрее.

Но если анеуплоидных клеток слишком много, они могут вытеснить эуплоидные клетки и привести к остановке развития эмбриона либо к дальнейшему развитию эмбриона с не правильным набором хромосом.

Аномальные клетки могут перемещаться в трофэктодерму (будущую плаценту), в то время как эуплоидные клетки сосредотачиваться во внутриклеточной массе (клетки из которых происходит развитие эмбриона). На самом деле это способ самокоррекции, который мозаичный эмбрион может использовать для удаления измененных клеток из ВКМ.

Существует вероятно определенный порог, при котором такая самокоррекция может происходить.

Является ли мозаицизм с моносомией приоритетным для переноса эмбриона?

Отсутствие хромосомы (моносомия) у эмбриона редко приводит к развитию беременности и рождению ребенка (за исключением отсутствия одной X половой хромосомы) – синдром Тернера (кариотип 45 X0).  Эмбрион не может иметь только одну копию хромосомы (это существенная потеря важного генетического материала), что приводит к невозможности развития.

По этим причинам мозаичный эмбрион с моносомией может быть лучшим выбором для переноса.

Читайте также:  Невральный комплекс органов. Развитие спинного мозга.

При переносе эмбриона с моносомией эуплоидные (хромосомно здоровые) клетки вытесняют моносомию, у эмбриона происходит самокоррекция и происходит развитие здоровой беременности.

Второй вариант, если анеуплоидные клетки перерастают, при моносомии, как правило, происходит остановка на раннем этапе развития, имплантация не наступает. Потому, что для развития эмбриона ему нужны две пары хромосом.

Сегментарный хромосомный мозаицизм – это изменение, при котором затрагивается только участок (сегмент) хромосомы.

Это может происходить на одной хромосоме (одиночная сегментарная мозаика) либо на нескольких хромосомах (множественная сегментная мозаика).

Основываясь на данных многих исследований,  сегментарные мозаики могут быть сопоставимы с эуплоидными эмбрионами по частоте имплантации (за исключением, возможно, нескольких сегментарных мозаик).

Мозаицизм целой хромосомы – это изменение при которой затрагивается вся хромосома, а не только ее сегмент.

Сложный аномальный эмбрион – это эмбрион, у которого 3 или более измененных хромосомы или хромосомных сегментов.

Мозаицизм целой хромосомы может иметь меньший успех в сравнении с эуплоидными эмбрионами. Fragouli et al. (2017): 13% против 47% живорождений. Таким образом, сегментная мозаика может быть приоритетнее для переноса эмбриона, чем мозаицизм целой хромосомы.

Сложные аномальный мозаицизм имеет меньший шанс успеха по сравнению с эуплоидными эмбрионами. Munne et al. (2017): 10% против 40% развивающихся беременностей на перенос эмбриона.

Как видно, при принятии правильного решения о переносе мозаичного эмбриона, важна грамотное консультирование репродуктолога, генетическое консультирование пары для достижения успешной, безопасной беременности и рождения здорового малыша в семье.

Идентификация маркерной хромосомы методом FISH

  • Идентификация маркерной хромосомы методом FISH – молекулярно-генетическое исследование, проводимое для идентификации хромосомного материала неизвестного происхождения, выявленного по результатам стандартного кариотипирования.
  • Синонимы английские
  • Marker Chromosome Identification Using FISH.
  • Метод исследования
  • Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с зондами, специфичными центромерному району хромосомы X (DXZ1).
  • Какой биоматериал можно использовать для исследования?
  • Венозную кровь.
  • Как правильно подготовиться к исследованию?
  • Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Весь наследственный материал, содержащийся в организме человека, кодируется с помощью последовательности нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК.

Каждая из цепочек ДНК состоит из 3 миллиардов пар нуклеотидов, поэтому, чтобы вместить такой большой объем генетической информации в ядро клетки, молекулы ДНК компактно упаковываются в специальные структуры – хромосомы. Набор всех хромосом клетки называется кариотипом.

Нормальный кариотип человека представлен 23 парами хромосом, из которых 22 пары одинаковы у мужчин и женщин (такие хромосомы называются аутосомами), а одна пара — ХХ у женщин и XY у мужчин — определяет пол и называется, соответственно, половыми хромосомами.

Под воздействием различных факторов в геноме могут возникать мутации – устойчивые, передаваемые по наследству изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, которые на хромосомном уровне организации генетической информации могут выражаться в изменении числа хромосом, а также в нарушении их структуры.

Стандартным методом исследования хромосом человека является кариотипирование. В процессе данного анализа выделенные из клеток хромосомы сравнивают со специальными хромосомными картами, а диагностическое заключение содержит информацию об их количестве, строении и структуре.

В результате структурных внутрихромосомных и межхромосомных перестроек при кариотипировании могут быть обнаружены так называемые маркерные хромосомы. Это любой хромосомный материал неизвестного происхождения.

В зависимости от генетической информации, которая содержится в маркерной хромосоме, её наличие может не сопровождаться формированием каких-либо патологических состояний, а может приводить к заболеваниям.

В связи с этим при обнаружении маркерной хромосомы чрезвычайно важно произвести её идентификацию. Одним из диагностических методов, которые позволяют идентифицировать маркерные хромосомы, является FISH.

FISH — флюоресцентнаяin-situ гибридизация – метод молекулярно-генетического исследования, который позволяет обнаружить в генетическом материале определенную последовательность ДНК. Для выполнения анализа необходимы так называемые зонды – искусственно синтезированные короткие участки ДНК, меченные флюоресцирующим веществом.

Каждый зонд может связываться исключительно с определенной последовательностью нуклеотидов на исследуемой ДНК. Существуют зонды для дифференциальной окраски разных хромосом, которые и применяются для идентификации неизвестных хромосомных фрагментов. В процессе анализа к исследуемому генетическому материалу, полученному из лейкоцитов крови, добавляют зонд.

Гибридизация, то есть связывание зондов с исследуемой ДНК происходит при определенной температуре в течение нескольких часов. После этого образец промывают специальным раствором, чтобы удалить несвязавшиеся зонды. Результат гибридизации врач оценивает с помощью флюоресцентного микроскопа, который позволяет увидеть свечение, испускаемое присоединившимися к нативной ДНК зондами.

Для идентификации маркерной хромосомы, как правило, требуется постановка реакции с несколькими зондами.

Для чего используется исследование?

  • Идентификация маркерной хромосомы необходима для оценки её потенциального влияния на развитие генетически обусловленных заболеваний, а также течение беременности и развитие плода, так как структурные аномалии таких хромосом могут приводить к нарушениям передачи генетической информации при делении клеток и, следовательно, формированию половых клеток с хромосомным дисбалансом.

Когда назначается исследование?

  • При обнаружении по результатам стандартного кариотипирования маркерной хромосомы.
  1. Что означают результаты?
  2. Результат исследования содержит информацию о соответствии хромосомного фрагмента определенному участку одной или нескольких нормальных хромосом.
  3. Что может влиять на результат?
  4. Нарушения в проведении отдельных этапов исследования, опыт и квалификация врача молекулярно-генетической диагностики.

Важные замечания

  • При обнаружении маркерной хромосомы у плода целесообразно проводить стандартное кариотипирование родителей, а также сиблингов (братьев и сестер) для установления её происхождения (унаследованная или возникшая вновь мутация) и роли в возникновении наследственных заболеваний.
  • Интерпретация полученных результатов должна проводиться исключительно врачом, обладающим достаточной квалификацией в области медицинской генетики или репродуктологии.
  • Кто назначает исследование?
  • Генетик, репродуктолог.
  • Литература
  1. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2016. Pages 1337-1343.

  2. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. – T. I / Под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. С. 705-715.

Научная электронная библиотека Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

Межклеточные различия хромосомного набора у одного и того же индивидуума определяют как хромосомный мозаицизм (то есть межклеточные либо соматические вариации генома, или мозаичная анеуплоидия). Долгое время считалось, что этот феномен мало влияет на межклеточное разнообразие и болезни человека.

Однако некоторые последние сообщения заставляют изменить точку зрения на это явление, поскольку обнаружено, что хромосомный мозаицизм значительно чаще встречается у лиц с различными заболеваниями (нервные и психические заболевания, аутоиммунные состояния) (Xu et аl., 2004; Iоurоv et аl., 2006 а, б; 2008 б, г).

Также установлена значимая роль хромосомного мозаицизма в генетическом разнообразии, при различных патологических состояниях (Sсhinzel, 2001; Yurоv et аl., 2001, 2005; 2007; Iоurоv et аl., 2008 б, в, г), на ранних этапах развития центральной нервной системы и старении.

Например, при синдроме Дауна установлено, что именно хромосомный мозаицизм лежит в основе формирования зародышевой анеуплоидии в женских половых клетках.

Поскольку мейотическая анеуплоидия считается главной генетической причиной гибели плода и постнатальной патологии, данные исследований заставляют считать хромосомный мозаицизм не случайной находкой во время проведения цитогенетической диагностики, а более значимым биологическим феноменом, чем считалось ранее, причина которого остаётся неизвестной.

Первоначально хромосомный мозаицизм определяли как присутствие в одном и том же организме доли клеток, отличающихся от остальных своим хромосомным набором. Хотя он снова и снова регистрируется при цитогенетических анализах, его значимость обычно недооценивается. Тем не менее, в последние 10 лет всё большее число исследований показало, что этот феномен действительно влияет на развитие болезни, раннее пренатальное развитие головного мозга и старение. Как установлено, мозаицизм играет определённую роль в возникновении мейотической анеуплоидии, которая является главной причиной

пренатальной гибели, врождённых пороков и умственной отсталости. Группа ученых (Hulten et аl.

, 2008) при изучении хромосомы 21 в клетках яичника нормальных плодов женского пола получила экспериментальное подтверждение их оригинальной гипотезы о том, что мейотическая анеуплоидия клеток плода является результатом мозаицизма зародышевых клеток яичника, возникающего в процессе нормального пренатального развития.

Эти данные прекрасно согласуются с современными концепциями анеуплоидии, включая результаты исследования трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) (Юров и др., 2015б).

Особенно важна возможность с помощью результатов этих исследований объяснить эффект материнского возраста, рекуррентность анеуплоидии в последующих зачатиях и аномальный паттерн материнской рекомбинации, ранее обнаруженный анализом сцепления.

Гипотезу о том, что митотическая анеуплоидия лежит в основе мейотической анеуплоидии можно считать довольно революционной, но она имеет под собой довольно веские экспериментальные основания. Одно из них то, что хромосомный мозаицизм проявляется с довольно высокой частотой в эмбриональных тканях, достигая 25 % в спонтанных абортусах (Ворсанова и др., 2010; Vorsanova et al.

, 2003; 2005; 2010 в). Ограниченность мозаицизма только одной специфической тканью – известный феномен. Ещё в 1983 г. Калоушек и Дилл описали хромосомный мозаицизм, ограниченный только плацентой (ограниченный плацентарный мозаицизм) (Kаlоusek, Dill, 1983). Не так давно было обнаружено, что соматический хромосомный мозаицизм характерен для развивающегося головного мозга человека в большом числе нормальных эмбрионов. Более того, было установлено, что увеличение мозаичной анеуплоидии в развивающемся мозге человека – интегральный компонент развития центральной нервной системы (Юров и др., 2004; 2010; 2014; Юров и др., 2007; 2010 б, в; 2014 в; Тиганов и др., 2012; Yurov et al., 2001; Iourov et al., 2006 a, б; 2008 a, б, в, г). Следовательно, можно сделать следующие выводы:

  • 1) хромосомный мозаицизм часто встречается в клетках плода человека;
  • 2) мозаицизм может быть ограничен экстраэмбриональными тканями (плацента) или эмбриональными тканями (центральная нервная система и ткани яичника).
Читайте также:  Эпидемиология классической чумы свиней. Распространение классической чумы свиней.

Вполне резонно предположить, что последнее – один из основных источников тканеспецифичной патологии, либо полисистемных заболеваний (включая те, что возникают из-за сбоев в мейозе), что было показано (Hulten et аl., 2008).

Для понимания того, есть ли у хромосомного мозаицизма возможность способствовать межклеточному разнообразию, следует обратиться к исследованиям, проводимым для оценки реального состояния численной хромосомной вариабельности в здоровых тканях человека (Kаlоusek, Dill, 1983).

Следует отметить, что почти во всех тканях при тщательном молекулярно-цитогенетическом анализе удаётся обнаружить анеуплоидные клетки. Таким образом, можно преодолеть основные трудности в исследованиях, нацеленных на оценку воздействия хромосомного мозаицизма, определив пороговый непатогенный уровень анеуплоидии в данной ткани (Yurov et al.

, 2007). Таким образом, ассоциация между хромосомным мозаицизмом и изменениями физиологии клеток и тканей требует тщательного контроля путём проверки клеток различных тканей здоровых индивидуумов.

При фокусировании на заболеваниях, ассоциированных с хромосомным мозаицизмом, можно отметить весьма широкий спектр патологии, связанной с этим типом соматических вариаций генома, от хромосомных синдромов до сложных нейропсихических и иммунных заболеваний. Хультен с коллегами добавили анеуплоидию мейотического происхождения в «список заболеваний хромосомного мозаицизма» (Hulten et аl.

, 2008). Более того, вполне резонно предположить, что самой обычной генетической причиной пренатальной смерти может быть хромосомный мозаицизм. Можно прийти к заключению, что ограниченный определённой тканью мозаицизм – причина дисфункции этой ткани, как это было продемонстрировано на примере заболеваний головного мозга, на мозге плодов и тканях яичника (Юров и др., 2004; Yurov et al.

, 2001; Iourov et al., 2006 a, б). Следовательно, при поиске роли хромосомного мозаицизма в патологии нужно напрямую изучать ткани, подвергшиеся патологическим изменениям. К сожалению, из-за ограниченной доступности большинства тканей человека для обширных генетических исследований и сложности молекулярно-цитогенетических анализов, исследования анеуплоидии низкого уровня редки.

В настоящее время только нервная ткань и ткани яичника были обследованы с помощью молекулярно-цитогенетических технологий высокого уровня разрешения.

Тем не менее, ткани (типы клеток), обычно используемые для цитогенетических исследований (лимфоциты крови, фибробласты кожи, ворсины хориона), также могут быть пригодны для подтверждения гипотезы о том, что хромосомный мозаицизм – возможный генетический механизм, лежащий в основе различных заболеваний человека.

Более того, смежные исследования пролили свет на проблему природы некоторых моногенных заболеваний, которые отмечены у лиц мужского пола, несмотря на их летальность (синдром Ретта и др.) (Ворсанова и др., 1998; 2013 а, б, в; 2014 а, б; 2015; Юров и др., 2004; Vorsanova et al., 1996; 2004; 2010 а, б; Iourov et al., 2013 а, в; 2015 а, б, в).

Достижения в изучении хромосомного мозаицизма велики, но всё-таки это недостаточно изученный феномен.

Всё же, несмотря на многие задачи, которые ещё предстоит решить в этой области исследований, уже можно сделать определённые выводы: будучи патологическим состоянием, анеуплоидия вызывает пренатальную смерть и/или хромосомные синдромы, ассоциированные с тяжёлой задержкой развития, плохо совместимой с жизнью.

При развитии центральной нервной системы анеуплоидия должна быть элиминирована, или же возникает патологическое состояние (Iоurоv et аl., 2008 а, в). Следовательно, в организме человека, действительно, идёт процесс «антианеуплоидизации», необходимый для того, чтобы зародыш развился, а затем нормально существовал в постнатальном периоде.

Но, вероятно, антианеуплоидизация замедляется с возрастом, что, возможно, ассоциировано со старением и малигнизацией. Эти предположения поддерживаются результатами последних исследований старения и канцерогенеза (Duesberg, 2007; Russel et аl., 2007; Yurov et al., 2009; Yurov, Iourov, 2010).

Таким образом, развитие анеуплоидизации есть своего рода каскад обширных процессов, ведущих к патологическому состоянию, которым противостоит противоположный процесс, названный «антианеуплоидизацией». И наоборот, баланс между анеуплоидизацией и антианеуплоидизацией помогает организму нормально развиваться до тех пор, пока не замедляется антианеуплоидизация.

Предполагается, что анеуплоидизация ткани – ключевой процесс возникновения дисфункции. Будучи ограниченной пределами какой-либо специфической клеточной популяции, она может вызывать образование опухолей, тогда как, если вся ткань подвержена анеуплоидии, то эта ткань должна подвергнуться дегенерации. Это частично подтверждается данными исследований заболеваний головного мозга (Mоsсh et аl., 2007). Говоря о мозаицизме как причине патологических состояний, в том числе психических заболеваний, нужно упомянуть и о мозаичных структурных перестройках хромосом (Hаlder et аl., 2008; Mаnоlаkоs et аl., 2008), среди которых нередки малые сверхчисленные маркерные хромосомы, встречающиеся, вероятно, гораздо чаще, чем считалось ранее. Говоря о таких маркерных хромосомах, дополнительно нужно отметить, что мозаицизм может быть «скрытым» и «динамическим» (Fiсkelsсher et аl., 2007; Sаntоs et аl., 2007; Iоurоv et аl.,

2008 б, в, г). Термин «скрытый» мозаицизм существует ни одно десятилетие, с тех пор как начались молекулярно-цитогенетические диагностические исследования.

«Скрытым» мозаицизм называют так потому, что в подобных случаях только дополнительные молекулярно-цитогенетические исследования могут подтвердить его после обычного цитогенетического анализа (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989; 1991).

«Динамическим» мозаицизмом называют случаи возникновения нового генетического дисбаланса в уже аномальной клетке либо мозаицизм возникает благодаря «особенностям поведения» перестроенной хромосомы.

В настоящее время для изучения этих двух типов хромосомного мозаицизма требуются молекулярно-цитогенетические технологии высокого разрешения, такие как subсenM-FISH или многоцветовое окрашивание (МСВ) (Fiсkelsсher et аl., 2007; Sаntоs et аl., 2007; Iоurоv et аl., 2008 а, б, в, г).

Вообще изучение хромосомного мозаицизма на нынешнем уровне развития науки без этих технологий представляется практически невозможным. В свете вышесказанного важно упомянуть исследования с применением аrrаy СGH. Такие молекулярно-цитогенетические технологии обладают огромными возможностями для определения точек разрыва в хромосомах, идентификации новых микроделеционных синдромов и обнаружения вариаций генома в норме и патологии (Jаquemоnt et аl., 2006; Iоurоv et аl., 2008 а, б, г). Таким образом,

  1. 1) межклеточные вариации, проявляющиеся в виде хромосомного мозаицизма, вероятно, участвуют в формировании генетического разнообразия;
  2. 2) многие патологические состояния ассоциированы с хромосомным мозаицизмом;
  3. 3) хромосомный мозаицизм – всё ещё недостаточно принимаемый во внимание биомедицинский феномен, требующий дальнейших исследований;
  4. 4) современная молекулярная цитогенетика обладает достаточными технологиями для определения роли хромосомного мозаицизма в развитии различных нарушений психического развития.

Самые ранние цитогенетические исследования, проводившиеся среди новорождённых, показали, что анеуплоидия бывает только по 3 из 22 аутосом, причём наблюдалась только трисомия, а моносомии не было вообще. Хотя методология цитогенетических исследований с тех пор значительно прогрессировала, результаты первых работ оставались относительно неизменными.

Наиболее частой трисомией у новорождённых является трисомия хромосомы 21, которая встречается у 1 из 650–830 живорождённых. Другие трисомии новорождённых включают в себя трисомию хромосомы 18, или синдром Эдвардса (около 1:7500 живорождённых), трисомию хромосомы 13, или синдром Патау (1:22700), а также очень редкие случаи трисомии 22 и трисомии 8, все мозаичные.

Вскоре после открытия этих хромосомных анеуплоидных заболеваний цитогенетики обнаружили, что встречаемость анеуплоидии аутосом у человека не ограничивается хромосомами 13, 18 и 21, а может быть и по всем остальным аутосомам с клиническими последствиями, несовместимыми с жизнью.

Для проверки этой гипотезы были инициированы исследования по определению наличия анеуплоидии аутосом в тканях спонтанных абортусов (Ворсанова и др., 2010; Vorsanova et al., 2003; 2005; 2010 в, г). Хромосомные анализы таких тканей (в I триместре) показали наличие трисомий с участием почти всех аутосом.

Интересно, что трисомия хромосомы 16 встречалась почти в трети абортусов с трисомией аутосом в I-м триместре беременности. Также часто наблюдались в клетках этих тканей трисомии хромосом 2, 7, 8, 18 и всех акроцентрических хромосом.

Авторы объясняли отличия между частотами трисомий действительными различиями в предрасположенности хромосом к аномальной сегрегации или селекции, отражающей собой выживаемость при дисбалансе разных хромосом; либо же обоими этими факторами. Для того чтобы дифференцировать эти два возможных объяснения, данные об анеуплоидиях стали анализировать по гаметам.

В наиболее ранних исследованиях анеуплоидии гамет изучали метафазные хромосомы ооцитов или сперматозоидов. Исследователи применяли в этих экспериментах методы высокого разрешения (первично FISH, но потом ещё и СGH).

Результаты этих исследований показали, что у человека наблюдается относительно высокий уровень анеуплоидии гамет по сравнению с другими видами.

Более того, частота анеуплоидии в сперматозоидах, как было показано, проявляется разными хромосомами, что заставляет предположить, что хотя бы некоторая часть вариаций (анеуплоидий) отражает действительные различия аномальной сегрегации аутосом, а не ограничена только селективным отбором.

Половые различия также были отмечены по частоте анеуплоидии аутосом; в ооцитах анеуплоидия встречалась чаще, чем в сперматозоидах. Однако технические проблемы ухудшили возможности исследователей установить уровень аутосомной анеуплоидии различных хромосом в ооцитах.

Одним из факторов, который, как полагают, повлиял на повышенную частоту анеуплоидии в ооцитах по сравнению со сперматозоидами, стали способы оценки.

Большинство ооцитов, доступных для исследований, были те, что считались непригодными для процедуры искусственного оплодотворения (например, IVF (in vitrо оплодотворение), что вело к отклонению результатов, связанных с материнским возрастом либо с морфологическими аномалиями. Однако стоит отметить, что исследования неродственных человеку млекопитающих, не ограниченные этими отклонениями оценки, также показали заметное увеличение частоты анеуплоидии в ооцитах по сравнению со сперматоцитами. Этиологические факторы, которые сформулированы как влияющие на повышение уровня анеуплоидии в оогенезе включают в себя:

  • 1) нарушение мейотического деления в профазе I, когда деление начинается пренатально, но не завершается до овуляции, что происходит десятилетия спустя;
  • 2) различия в происхождении ошибок в мейозе у мужчин по сравнению с женщинами;
  • 3) различия в частоте и локализации мейотических рекомбинаций на хромосомах;
  • 4) эпигенетические различия в реакции на воздействия окружающей среды и стрессорные факторы.
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector