Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии.

Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии.

Задачи вирусологии, решаемые с помощью КК: 1. Индикация (обнаружение) вируса по ЦПД 2. Накопление вируса 3. Изоляция вируса 4. Титрование вируса по ЦПД 5. Поддержание вируса 6. Освежение штаммов после длительного хранения 7. Изучение размера, формы фокусов ЦПД вируса 8. Изготовление культуральных вакцин 9. Изучение свойств вновь выделенных вирусов

Культуры клеток • Отсутствие этических • Клеточные взаимодействия проблем при постановке in vitro отличаются от опыта таковых в живом • Экономичность организме, что затрудняет • Возможность правильную интерпретацию моделирования различных полученных результатов ситуаций в ходе • Высокий риск эксперимента контаминации (заражения • Получение однозначных посторонними сопоставимых результатов микроорганизмами) при соблюдении условий клеточной культуры при культивирования несоблюдении правил • Возможность изучения работы процессов на клеточном уровне

Работа с однослойными культурами клеток

Культуральная посуда

Питательные среды Естественного Искусственные происхождения Синтетические Полусинтетические Экстракты из органов и Естественные Раствор пит. среды + тканей на Хенкса, растворе соли + цветной раствор Эрла индикатор Хенкса

Питательные среды Диспергирующие Поддерживающие (снятие клеток со стекла) Поддерживающие Ростовые 1. р-р Версена (0, 002%) 5 -10% 2. р-р трипсина 0 -2% сыворотки (0, 25%) сыворотки крови КРС – крови КРС ростовой 3. р-р ЭДТА фактор 4. химотрипсин

Техника безопасности Требования: 1. НЕ распространяй! 2. НЕ контаминируй! (не загрязняй!) 3. НЕ заразись!

Правила работы: 1. На рабочем месте меньше говорить, быть собранным, аккуратным, внимательным 2. С вирусом работать в боксе 3. Работать в спецодежде (халат, чепчик, сменная обувь, стерильные перчатки, маска, комбинезон) 4.

В боксе с вирусом работать в самой стерильной зоне – у пламени горелки (на расстоянии 15 -20 см) 5. Пользоваться только стерильными расходными материалами (посуда, дозаторы, инструментарий, тампоны) 6. Нельзя допускать образования мелкодисперсных аэрозолей 7.

Нельзя ничего брать в рот, есть, пить, курить

После работы необходимо: 1. Инактивировать все расходники (собрать в место дезинфекции) 2. Обработать рабочие поверхности дезинфицирующим раствором (аламинол) 3. Обработать воздух УФЛ 4. Обработать руки (перчатки – в место дезинфекции, вымыть руки с щелочным хозяйственным мылом) 5. Снять спецодежду.

Пассаж культуры клеток

I Подготовка рабочего места 1. Обработать поверхности спиртом 2. Обработатьбокс УФЛ в течение 15 минут, одновременно обработать воздух помещения рециркулятором воздуха «Дезар» 3. Нагретьв термостате или на водяной бане раствор Версена (до 37°С)

II Отделение клеток от монослоя 1. Включить газ 2. Надеть перчатки и маску, обработать руки и рабочую поверхность спиртом 3. Открыть матрас 4. Слить культуральную среду в жидкие отходы 5.

Открыть раствор Версена 6. Налить небольшое количество р-ра Версена в матрас 7. Закрыть матрас и раствор Версена 8. Несильными покачиваниями распределить р-р по монослою 9. Открыть матрас 10.

Слить р-р Версена

II Отделение клеток от монослоя 11. Повторить пункты 5 -10 2 раза 12. В последний раз оставить 1 мл (примерно, правило уголка) р-р Версена в матрасе 13. Закрыть матрас 14. Оставить матрас в термостате на 5 -10 минут 15. Подготовить рабочее поле, убрать р-р Версена в холодильник, включить УФЛ, выйти из бокса

III Контроль отделения монослоя 1. Просмотреть дно матраса на свет, оценить отхождение монослоя 2. Аккуратнопотрясти матрас, постукивая боковой гранью об ладонь 3. Принеобходимости оставить матрас в термостате еще на несколько минут

IV Обновление КК (собственно пассаж) 1. Обработать рабочее поле, питательную смесь, матрасы спиртом 2. Достать из холодильника сыворотку крови КРС 3. Открыть емкость с пит. смесью 4. Открыть матрас 5. Налить в матрас пит.

смесь до нужного объема (15/20 мл) 6. Закрыть матрас и пит. смесь 7. Аккуратно перемешать содержимое матраса 8. Открыть матрас 9. Разлить клеточную суспензию на нужное количество матрасов/ слить часть суспензии в жидкие отходы 10. Довести объем пит.

среды в каждом матрасе до 15 мл

IV Обновление КК (собственно пассаж) 11. Снять фольгу с флакона с сывороткой крови КРС 12. С помощью пинцета извлечь пробку (в 2 этапа, с фламбированием), поместить пробку в емкость со спиртом 13. Открыть матрас 14.

Поместить в матрас 1, 5 мл сыворотки крови КРС (10% от объема пит. среды) 15. Закрыть матрас 16. Взять пинцетом пробку из емкости со спиртом 17. Профламбировать пробку над пламенем горелки 18. Плотно закрыть флакон с сыв-кой кр. КРС пробкой, затем фольгой 19.

Проконтролировать плотное закрытие всех матрасов и емкостей

V Уборка рабочего места 1. Подписать на матрасах дату и номер пассажа 2. Поместить матрасы в термостат 3. Убрать сыворотки крови КРС в холодильник 4. Протереть все поверхности спиртом 5.

Очиститьемкости с сухими (выкинуть в мусорный пакет) и жидкими (если нет вируссодержащего материала – вылить в раковину) отходами, в емкость для жидких отходов залить небольшое количество 5% р-ра аламинола 6.

Включить УФЛ и рециркулятор на 15 минут

Благодарю за внимание!

Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии

Значительный вклад в развитие вирусологии внесли клеточные культуры. Однако, несмотря на то, что возможность культивирования клеток животных вне организма (Каррель, 1912) и размножения в них вирусов (Шейнгард и др.

, 1913) были установлены давно, для изготовления вакцин вирусы длительное время размножали в организме животных и куриных эмбрионах.

Только с развитием однослойных клеточных культур (Дульбеко, 1952) началась эра культуральных вирусных вакцин.

В 50-е годы XX столетия отмечено резкое увеличение заболевания полиомиелитом в ряде стран Америки и Европы. По данным 1956 года в США зарегистрировано более 300 тысяч инвалидов после паралитических осложнений полиомиелита. Разработка метода размножения полиовируса в культуре клеток приматов к этому времени (Эндерс и др., 1949 г.

) явилась необходимым условием для создания вакцины. Сначала была разработана инактивированная вакцина Солка (1954), затем живая вакцина Сэбина (1957). В результате массовой вакцинации заболеваемость полиомиелитом в 1965 году по сравнению с 1958 годом снизилась в 50 раз. В дальнейшем заболевание встречалось в виде спорадических случаев.

Начались поиски путей полного искоренения этой инфекции.

Эпопея борьбы с полиомиелитом явилась яркой иллюстрацией быстрого развития и эффективного использования новых методов исследования в решении актуальных практических задач и особенно в разработке и производстве вакцин.

Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии.

История борьбы с полиомиелитом во многом сходна с историей борьбы с ящуром животных, протекавшей в то же самое время с широким использованием метода клеточных культур и других достижений общей вирусологии. Успешное решение этих двух глобальных проблем оказало благотворное влияние на развитие вирусологии в целом и явилось прекрасной школой для ряда поколений вирусологов.

Справедливости ради следует отметить, что первой культуральной вакциной для практического применения была инактивированная вакцина против ящура (Френкель, 1947). Вирус выращивали в суспензии эксплантатов эпителия языка крупного рогатого скота в полусинтетической среде в металлических реакторах.

Эпителиальную ткань получали при убое скота на мясокомбинатах. Такую вакцину с успехом применяли в ряде стран в течение многих лет.

В дальнейшем в процессе создания более совершенных средств специфической профилактики ящура родилась новая промышленная технология культивирования клеток — суспензионное выращивание линий клеток в реакторах большой емкости.

Данная технология имеет прототипное значение и может быть использована при изготовлении многих вакцин, так как проблема производства вируса для вирусных вакцин превратилась, в основном, в проблему производства клеток. Многолетний опыт применения инактивированной вакцины против ящура из вируса, размноженного таким способом, показал ее высокую эффективность и полную безопасность.

Культуры клеток прочно заняли место не только в приготовлении вирусных вакцин, но и в лабораторной диагностике вирусных заболеваний. С их помощью выделены сотни патогенных вирусов.

Например, вирусная природа кори доказана еще в 1911 году, а выделить вирус в культуре ткани удалось лишь в 1954 году. Аналогичная ситуация имела место и с другими вирусами.

Одним из практически важных результатов развития учения о вирусах является современная лабораторная диагностика вирусных болезней человека и животных с использованием новейших молекулярно-биологических методов исследования.

В заключение следует отметить, что вакцинопрофилактика справедливо считается крупнейшим достижением биологии.

Характерная черта развития биологии на современном этапе — стремительное преодоление расстояния, отделяющего фундаментальные открытия от их практического применения.

Этот процесс наиболее отчетливо проявляется в области разработки средств специфической профилактики вирусных заболеваний. Благодаря этому в последние годы достигнуты большие успехи в области вакцинопрофилактики многих опасных вирусных заболеваний человека и животных.

Читайте также:  Мерцательная аритмия и трепетание предсердий. Послеоперационные нарушения ритма сердца.

Существует эффективный контроль таких грозных заболеваний как корь, бешенство, чума свиней, чума крупного рогатого скота, чума плотоядных, ньюкаслская болезнь, болезнь Марека и многих других вирусных болезней. Наиболее ярким примером может служить борьба с оспой, полиомиелитом и ящуром.

— Также рекомендуем «Природа вирусов. Этапы исследования вирусов.»

Оглавление темы «История вирусологии. Основы вирусологии.»: 1. Вирусология как учение о вирусах. История вирусологии. 2. Клеточные культуры в вирусологии. Начало изучения клеточных культур в вирусологии. 3. Природа вирусов. Этапы исследования вирусов. 4. Изучение генома вирусов. Роль открытия генома вирусных частиц. 5. Структура и состав вирусов. Строение вирусов и вирусных частиц. 6. Химический состав вирусов. Вирусные геномы. Виды вирусных геномов. 7. Классификация вирусов. Современная номенклатура в вирусологии. 8. Репликация вирусов. Как размножаются вирусы? 9. Цикл размножения вирусов. Прикрепление или адсорбция вируса. 10. Проникновение вируса в клетку. Этап обнажения вирусного генома.

Культура клеток HeLa: бессмертное наследие Генриетты Лакс

Красивая чернокожая американка Генриетта Лакс (рис. 1),

В ходе обследования лечащий врач отправил биопсию ее опухоли на анализ Джорджу Гею (George Gey), руководителю лаборатории исследования клеток и тканей при университете Джонса Хопкинса (Балтимор, Штат Мэриленд), который занимался проблемой лечения рака и поиском бессмертной клеточной линии человека для научных исследований (рис. 2).

1 сентября 1951 г. Джордж Гей, держа в руках пробирку с клеточной культурой HeLa, выступал перед телевизионными камерами.

Он заявил, что благодаря полученной клеточной линии в медико-биологических научных исследованиях началась новая эпоха, открывающая невиданные перспективы в разработке новых лекарственных препаратов и что не далек тот день, когда будет найдено лекарство от рака.

Генриетта Лакс умерла в госпитале Хопкинса 4 октября 1951 г., а популяция ее клеток продолжала свой безудержный рост, значительно опережая развитие биоэтических норм и правил, необходимых для регулирования научного прогресса.

Джордж Гей был прав. Действительно, клетки HeLa стали долгожданным событием для исследователей всего мира. Эта популяция клеток, идентичная во всех лабораториях мира, позволила ученым быстро получать и независимо друг от друга подтверждать все новые и новые данные.

Можно смело сказать, что гигантский прыжок молекулярной биологии в конце прошлого века был обусловлен возможностью культивировать клетки in vitro. Клетки HeLa — первые бессмертные человеческие клетки, которые когда-либо были выращены на искусственной питательной среде.

Они дали возможность ученым культивировать сотни других линий раковых клеток.

И хотя до сих пор не найдено условий для культивирования нетрансформированных клеток, раковые клетки в большинстве своем являются адекватной моделью для поиска ответов на вопросы, задаваемые учеными и медиками.

В отличие от обычной популяции человеческих клеток, которые делятся от 40 до 50 раз, прежде чем умереть, клетки HeLa способны делиться бесконечно.

Нормальные клетки человека имеют кариотип, состоящий из 46 хромосом, в то время как клетки HeLa — от 76 до 80 хромосом, в значительной степени мутированных [6]. Появление этого отклонения от нормального кариотипа связано с вирусом папилломы человека (ВПЧ) HPV18, ответственного почти за все случаи рака шейки матки.

ВПЧ «вставляет» свою ДНК в клетку-хозяина, в результате чего она начинает синтезировать протеин, который связывается и инактивирует белок p53, известный как хранитель генома из-за его роли в пред-отвращении мутации и подавлении опухоли. Поэтому инактивация белка р53 может иметь катастрофические последствия [7].

Даже по сравнению с другими раковыми клетками клетки HeLa растут чрезвычайно быстро. В свое время доктор Дж. Гей был поражен, увидев, что в течение 24 ч культивирования своего первого образца HeLa количество клеток удвоилось. Причиной этой аномалии служит активность фермента теломеразы HeLa.

Так, в процессе деления нормальной клетки повторяющиеся короткие последовательности ДНК на концах всех хромосом, известные как теломеры, сокращаются вследствие снижения активности данного фермента [8]. Это приводит к старению и, в конечном счете, к апоптозу и гибели клеток.

Нормальные клетки имеют максимальное количество делений прежде, чем эти теломеры истощаются. А в клетках HeLa, за счет высокой активности теломеразы, теломеры удлиняются, достигая при этом неограниченной репликативной возможности [9].

Эта аномалия позволяет клеткам HeLa делиться бесконечно, что делает их сейчас старше возраста Генриетты на момент ее смерти.

Этой клеточной культуре ученый мир обязан многими замечательными достижениями. Например, без клеток HeLa была бы невозможна разработка в 1953 г. вирусологом Национального фонда детского паралича Джонасом Солком (Jonas Salk) вакцины против полиомиелита из инактивированных вирусов [4].

Это был большой и многообещающий научный успех, но прежде чем применять новый препарат на людях, его необходимо было испытать на живых человеческих клетках. Популяция клеток HeLa оказалась совершенным инструментом.

Они не только быстро росли, что позволяло своевременно накопить огромное количество клеток, необходимых для исследования, но и, как оказалось, легко заражались вирусом полиомиелита. Менее чем за 1 год вакцина была готова для применения на пациентах [10].

После успешного использования клеток HeLa для получения вакцины вируса полиомиелита линии культур клеток человека стали незаменимыми для выделения и культивирования ряда других вирусов, производства антител, интерферона, противоопухолевых химиопрепаратов.

С тех пор список прорывных технологий и достижений с использованием клеток HeLa стал постоянно пополняться.

Они повсе-дневно используются для вирусологических исследований, изучения таких заболеваний, как рак, СПИД, для оценки воздействия радиации и токсичных веществ, составления генетических карт, развития методов клеточной инженерии и решения огромного количества других научных задач [5].

В конце 60-х годов XX века НеLa и другие клеточные культуры дали толчок для возникновения генетической инженерии (условно относят к 1972 г.), когда в США П.

Бергом (Paul Naim Berg) и его коллегами из Стэнфордского университета была создана первая рекомбинантная молекула ДНК.

Открылась возможность целенаправленно конструировать искусственные генетические программы и многие нужные лекарственные препараты [11].

В декабре 1960 г. клетки HeLa полетели в космос на советском космическом аппарате «Спутник-6», в последующем они побывали в космосе еще несколько раз. Результаты показали, что HeLa хорошо себя чувствуют не только в земных условиях, но и в невесомости.

С тех пор HeLa применяли для клонирования (в том числе знаменитой овечки Долли), многочисленных генетических исследований, отработки методов искусственного оплодотворения и для тысяч других исследований. С 1972 г.

эти клетки активно используются в международной программе совместной борьбы с раком, при участии медиков всего мира [5].

Благодаря клеткам HeLa была выявлена связь ВПЧ и раком шейки матки, а также роль теломеразы в пред-отвращении деградации хромосом. За это Харальд цур Хаузен в 2008 г. и Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак в 2011 г. были удостоены двух Нобелевских премий [12, 13].

«Мать вирусологии, клеточных и тканевых технологий, биотехнологии, современной медицины» — вот далеко не полный перечень эпитетов, которые заслужила за многие десятилетия эта клеточная культура.

Таким образом, невольный вклад Генриетты Лакс в медицину бесценен, за более чем полувековое служение науке и человечеству клеточная культура HeLa стала неоценимой и неотъемлемой частью биомедицинских исследований (рис. 3).

Рис. 3. История использования клеток в молекулярной биологии и медицине (рисунок авторов).

А тем временем личность самой Генриетты Лакс долгое время не афишировалась. Доктор Гей, конечно, знал о происхождении клеток HeLa, но он считал, что конфиденциальность в этом вопросе является приоритетной, и в течение многих лет никто, и в том числе семья Лакс, не знал, что это именно ее клетки прославились на весь мир [5].

После смерти доктора Джорджа Гея в 1970 г. тайна раскрылась. Это произошло случайно.

На заре зарождения технологий исследований с помощью клеточных культур многие ученые не уделяли должного внимания стандартам стерильности при работе с клетками и возможности перекрестного заражения многочисленных клеточных линий [4].

Более агрессивные и живучие клетки HeLa заражали менее сильные клеточные культуры, перемещаясь по воздуху с частицами пыли или на нестерильных инструментах, недостаточно тщательно вымытых руках, одежде [4, 5].

Спустя 25 лет ученые обнаружили, что чистота культуры клеток HeLa оказалась под вопросом — одна и та же клеточная линия в различных лабораториях имела разные генетические характеристики [14]. Возникшую проблему было решено исправить путем генотипирования, для чего ученые разыскали родственников Генриетты и попросили дать им образцы ДНК семьи, чтобы составить карту генов. Таким образом тайное и стало явным.

Читайте также:  Илеус. Послеоперационный паралитический илеус.

При этом в течение нескольких десятилетий согласие на эксплуатацию клеток самой Г. Лакс и ее родственников игнорировалось. Небогатая семья Генриетты так и не получила компенсацию за применение клеток HeLa без согласия донора, а материальная помощь ее многочисленным родственникам, не имевшим средств на оплату медицинского обслуживания, была бы очень кстати.

Но все запросы упираются в глухую стену, ответчиков давно уж нет [5, 15]. В 2013 г. ее родственники впервые получили авторское право на использование клеточного материала своей прабабушки в научно-популярных публикациях. От всякой денежной награды семья отказалась.

В это же время было принято соглашение между Национальными институтами здравоохранения США (NIH) и членами семьи Генриетты о помещении последовательности генома HeLa «в базу данных с контролируемым доступом», то есть в базу данных NIH о генотипах и фенотипах (dbGaP; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap)». В настоящее время ученым необходимо обратиться в NIH для использования данных в своих исследованиях, согласившись с выдвигаемыми условиями. Также по закону требуется, чтобы семья Lacks была упомянута в любых научных публикациях [16].

Хотелось бы отметить, что некоторыми учеными клетки HeLa были вынесены в отдельный вид, не относящийся к человеческому — Helacyton gartleri (Hela, в честь самих клеток HeLa; cyton, от греческого цитоса, что означает клетка; и gartleri — в честь генетика Стэнли Гартлера, который первым задокументировал поразительные свойства этих клеток). Эволюционный биолог Ли Ван Вален относит клетки HeLa к новому микробному виду из-за их не-ограниченного деления, собственного клонального кариотипа, хромосомной несовместимости с людьми, разной экологической ниши и способности выживания вне человеческого тела. Однако многие с этим не согласны, так как считают выживание клеток HeLa искусственным явлением и утверждают, что эволюция в чашке Петри мало влияет на эволюцию в природе [17]. В парках, скверах и городах, созданных людьми, живет большое количество микро- и макроорганизмов, адаптированных к этим условиям, добавляет Ван Вален. Так, человеком были искусственно созданы новые виды, хотя и не от своей собственной плоти. Если бы HeLa не был получен из человеческой ткани, утверждает Ван Вален, не было бы никаких сомнений в том, что его выделили бы в новый вид [18, 19].

Тем не менее образец раковой опухоли, ради любопытства помещенный в питательную среду, стал быстро размножаться, не стареет, и вот уже 65 лет активно используется в науке.

В наше время клеточная культура HeLa — это важный научный инструмент многих исследовательских лабораторий, благодаря ему были проведены тысячи исследований, защищены диссертации, опубликованы более 70 тыс. научных статей и получены более 11 тыс. патентов.

На сегодняшний день их настолько много, что если бы Генриетта была жива, то их вес в общем количестве в десятки раз превысил бы вес самой женщины, которая, к сожалению, так и не узнала о том, какой бесценный, хоть и невольный вклад она внесла в науку.

Поэтому хочется почтить память Генриетты Лакс. Ее клетки — оставшееся после нее бессмертное наследие, спасли и продолжают спасать жизней больше, чем в силах сделать любой врач.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
  • The authors declare no conflicts of interest.
  • Сведения об авторах

Ляпун И.Н. — e-mail: irina-lyapun@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-5290-3864

Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4456-808X

Бынина М.П. — e-mail: marina.bynina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8255-328X

Автор, ответственный за переписку:

Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru

Как цитировать:

Ляпун И.Н., Андрюков Б.Г., Бынина М.П. Культура клеток HeLa: бессмертное наследие Генриетты Лакс. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):151-157. https://doi.org/10.17116/molgen201937041

Тема 7 Использование культуры клеток в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с общими сведениями о куль­туре клеток и методами ее получения, сохранения, поддержания; ознакомиться с оборудованием и растворами, используемыми для работы с культурой клеток; овладеть методикой световой микроскопии некоторых видов перевиваемых культур клеток.

Изучение вирусов вплоть до 40-х годов 20-го века проводили исключительно на лабораторных животных. Однако, животные оказались чувствительными к ограниченному числу вирусов и это привело к поиску других моделей живых систем, более универсальных и чувствительных к вирусам. Такой живой системой стала культура клеток.

Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организ­ма, сохраняющие способность к делению и поддержанию своей жизнедеятельности вне организма (in vitro ) в искусственных условиях.

Методика культивирования клеток начала активно развиваться после 40–х годов 20 века. До этого времени проводились эксперименты с культурой ткани – отдельными эксплантами, полученными из органа животного и помещёнными в определённые питательные растворы.

Однако, такая культура тканей могла поддерживать свою жизнедеятельность крайне ограниченный отрезок времени и была названа переживающей.

В дальнейшем с появлением антибиотиков, предупреждающих контаминацию ткани различной микрофлорой, разработкой методики дезагрегации ткани на отдельные клетки и открытием способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) стало возможным получить культуру отдельных клеток ткани. Так возникла новая живая система – культура клеток, которая и до настоящего времени является наиболее универсальной и востребованной в различных областях биологии и медицины.

Это связано с тем, что клетки в такой культуре сохраняют способность к делению и поддержанию своей жизнедеятельности вне организма в течение продолжительного времени (в отличие от переживающей культуры ткани), её называют растущей культурой клеток.

Клетки культивируют в основном двумя основными способами – стационарным и суспензионным. При стационарном культивировании клетки находятся в неподвижном стационарном состоянии, будучи адгезированными к определённой поверхности. При суспензионном культивировании клетки находятся в свободно-взвешенном состоянии в питательной среде  при постоянном перемешивании.

Растущая стационарная (монослойная) культура клеток классифицируется на первичную (первично-трипсинизированную), диплоидную, перевиваемую.

Первичная или первично-трипсинизированная культура клеток – это культура клеток, полученная непосредственно из ткани органа и формирующая in vitro один слой клеток (монослой).

Для ее получения используют ткань молодых здоровых животных, а еще лучше, эмбрионов, которые обрабатывают протеолитическими ферментами. Иными словами, проводят дезагрегацию ткани на отдельные клетки.

В последнее время область культивирования клеточных культур значительно расширилась.

Наряду с уже известными тканями млекопитающих стали использовать ткани низших позвоночных и беспозвоночных (земноводные), насекомых, рыб, растений.

  • Основное требование при получении первичной клеточной культуры – это стерильные условия работы.
  • Методика получения первично-трипсинизированной культуры клеток
  • 1 Ткань органа разрезают на небольшие кусочки размером 3 – 5,0 мм и отмывают специальными растворами солей от балласта (слизь, кровь, разрушенные клетки и др.)
  • 2 Отмытые кусочки ткани переносят в колбу с магнитом и заливают 0,25 % раствором трипсина, предварительно подогретого до 37°С

3 Колбу устанавливают на магнитную мешалку и проводят трипсинизацию кусочков ткани в течение 15 – 20 минут. После чего полученную суспензию клеток собирают и охлаждают при 0 — +4 ° С. Кусочки ткани в колбе повторно заливают 0,25 % раствором подогретого трипсина и процедуру трипсинизации повторяют 4 – 5 раз до полной дезагрегации ткани на отдельные клетки (метод дробной трипсинизации).

4 Все фракции полученных суспензий клеток в растворе трипсина объединяют и проводят центрифугирование при 1000 об/мин. в течение 15 мин.

5 Надосадочную фракцию (раствор трипсина) удаляют, к осадку клеток добавляют питательную среду и ресуспендируют.

6 Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Посадочную концентрацию клеток готовят из расчета 1х106 кл./мл на питательной среде.

  1. 7 К полученной суспензии клеток добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота (до 10 % от объёма суспензии).
  2. 8 Полученную суспензию клеток в среде с сывороткой помещают в культуральные флаконы (матрасы) и культивируют в термостате при средней температуре + 37°С.
  3. Наблюдение за культурой клеток проводят методом световой микроскопии.
Читайте также:  Фиброматоз дёсен. Лекарственная гипертрофия дёсен. Первичный герпетический гингивостоматит.

В процессе культивирования клеток был изучен их жизненный цикл и показана зависимость между количеством клеток в культуре и временем их жизни (рис. 14).

На графике видно, что жизненный цикл культуры клетоксостоит изчетырёх основных этапов

кол-во клеток
 время жизненного цикла I         II                                             III                                             IV                                                                            
  • Рис. 14 Жизненный цикл первичной культуры клеток
  • I – этап адаптации: клетки оседают и адгезируются (прикрепление) к поверхности культурального сосуда; распластываются и подготавливаются в клеточному циклу — митозу; продолжительность этапа в среднем 3-5 часов;
  • II – этап логарифмического роста: клетки вступают в клеточный цикл; контакт соседних клеток между собой запускает процесс ингибирования (торможение) деления этих клеток, что получило название контактное ингибирование; результатом этапа этапа является формирование монослоя клеток; продолжительность этапа в среднем 3-5 суток;
  • III – этап стационарный: клетки утрачивают способность вступать в клеточный цикл; в них поддерживается обмен веществ (метаболизм); продолжительность этапа в среднем 7-9 суток;
  • IV – этап дегенерации и гибели клеток: питательная среда в результате жизнедеятельности клеток насыщается продуктами метаболизма клеток, что приводят к их дегенерации; клетки деадгезируются, свободно «плавают» в питательной среде и постепенно разрушаются (лизис); продолжительность этапа в среднем 3-5 суток.
  • Продолжительность этапов жизненного цикла может варьировать в зависимости от возраста животного и вида ткани, качества растворов и питательных сред, а также от профессиональных навыков исследователя.

Первичную культуру клеток можно пересевать, т.е. проводить пассаж. Пассаж – это перенос клеток в новую питательную среду с целью ее поддержания in vitro.

Таким образом, получив единожды из ткани органа культуру клеток, можно длительно поддерживать её жизненный цикл. Культуру клеток, полученную путем пассажа первичной культуры клеток, принято называть субкультурой или клеточной линией.

Субкультивирование насчитывает в среднем от 5 и более пассажей, считая от первого пассажа первичной культуры клеток.

В результате субкультивирования можно получить один или несколько клонов клеток, относительно устойчивых в условиям in vitro, обладающих одинаковой морфологией и сохраняющих свой исходный кариотип. Клоны таких клеток можно получать как спонтанно, так и целенаправленно. Данную культуру клеток принято называть диплоидной.

С 1963 г.

было принято международное определение, согласно которомудиплоидная культура клеток это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная in vitro, имеющая ограниченный «отрезок жизни» до 50±20 пассажей, характеризующаяся тремя фазами жизни, сохраняющая в результате пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминаций и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации золотистым хомякам.

Диплоидная культура клеток в результате длительной селекции может мутировать (мутационная теория), что приводит к незапланированным изменениям в её генетическом аппарате. Например, в результате воздействия на монослой клеток диспергирующим ферментом, особенно в сочетание с «цетрифужным» методом пассажа.

Так была получена так называемая перевиваемая культура клеток — морфологически однородная популяция клеток, происходящая из диплоидной культуры клеток в результате её длительной селекции или полученная целенаправленно из раковых клеток млекопитающих и обладающая неограниченным сроком сохранения жизнедеятельности  in vitro.

  1. В табл. 5 представлены некоторые свойства разных видов растущей культуры клеток
  2. Таблица 5
  3. Некоторые сравнительные свойства однослойных культур клеток
Свойства Культуры клеток
первичная диплоидная перевиваемая
Происхождение из органа из субкультуры (клеточная линия) из диплоидной
Число жизнен-ных циклов 1 50 ± 20 не ограниченное
Морфология клеток как в исходной ткани органа  фибробластоподобные   эпителиоподобные
Кариотип   диплоидный гетероплоидный
Тератогенность (туморогенность) не обладает не обладает может обладать
Наличие контаминантов возможно отсутствуют

Культур клеток принято обозначать исходя из вида и возраста животного, а также органа, из которого она была получена.  Например, первичная культура клеток почки теленка (ПТ), перевиваемая культура клеток почки теленка – ПТ-80 (рис. 15); перевиваемая культура клеток коронарных сосудов телёнка – КСТ (рис. 16) и т.д.

Если культура клеток была получена исследователем целенаправленно в результате селекции, то сам автор даёт ей название. Например, VERO — перевиваемая культура почки зелёной мартышки (рис.

17); HELA- перевиваемая культура клеток из раковой опухоли шейки матки человека, HEP 2 — перевиваемая культура клеток из карциномы гортани человека; КВ — перевиваемая культура клеток из раковой опухоли слизистой полости рта и т.д.

Растворы и питательные среды для культивирования клеток

В работе с культурами клеток используют различные растворы солей, ферментов, а также питательные среды, сыворотку крови млекопитающих и другие билогически активные компоненты.

Сбалансированный солевой раствор (BSS) содержит основные неорганические соли: Ca+, K+, Mg+, Na+; Cl¯, SO4¯ ¯, НPO4¯ ¯, HCO3¯ ¯ и глюкозу. Примером могут быть такие  BSS, как раствор Хэнкса (1949г.), раствор Эрла (1943г.) и др. Их используют в изготовление питательных сред, для препарирования ткани, при промывках, кратковременной инкубации ткани и т.п.

Ферментативные (диспергирующие) растворы применяют в процессе получения первичной культуры клеток (дезагрегация ткани на отдельные клетки), при проведение пассажа. С этой целью используют 0,25 %-ный раствор трипсина на фосфатном буфере, 0,02 %-ный раствор версена (натриевая соль этилендиамитетрауксусной кислоты).

Питательные среды, используемые в настоящее время для культивирования клеточных культур, являются синтетическими и изготавливаются в соответствии с утвержденными рецептурами.

Наиболее универсальными в работе с культурами клеток являются среда Игла, среда 199 и их модификации.

В их состав входят незаменимые аминокислоты, витамины, соли (простая среда), а также ещё дополнительно и заменимые аминокислоты, нуклеозиды, липиды, гормоны и другие биологически активные компоненты (сложная среда).  

В культивировании клеток широко используют сыворотку крови крупного рогатого скота, лошади (получают из сердца), а  для некоторых клеточных линий человека — сыворотку крови человека. Сыворотка крови содержит факторы, стимулирующие деление клеток (митогены) и их адгезию,  обладает антитрипсиновой активностью, является источником липидов, гормонов, микроэлементов.

Для предупреждения контаминации  культуры клеток в питательную среду могут добавлять антибактериальные препараты, например, антибиотики.

Клетки культивируют в специальной посуде из плотного материала – стекла (многоразовое использование) или полистирола (одноразовое использование). К ней относят матрасы, многолуночные планшеты, чашки Петри разного диаметра, вращательные бутыли с магнитным стержнем для суспензионного культивирования и др.

Преимущества культуры клеток перед другими живыми системами состоит в том, что ее можно получать из разнообразных клеток, которые является мишенями для самых  разных видов вирусов.

Кроме того, культуру клеток просто заражать вирусами и в дальнейшем проводить  их индикацию методом световой микроскопии, непрерывно наблюдая за процессом культивирования (в том числе и латентных, персистирующих вирусов), а при необходимости «вмешиваться» в процесс их культивирования.

В культуре клеток можно накапливать и собирать большие «урожаи» вирусов в высоком инфекционным титре при минимальном содержании балластных белков. Культуры клеток можно постоянно поддерживать в лабораторных условиях при меньших  материальных затратах по сравнению с лабораторными животными или куриными эмбрионами.

  • Материальное обеспечение: ткань печени КРС, питательные среды (Игла, 199), солевые растворы (Эрла, Хенкса), 0,25% р-р трипсина, 0,02% р-р версена, сыворотка крови КРС, газовая горелка, стерилизатор с ножницами и пинцетом анатомическим, чашка Петри, стакан лабораторный, колба с магнитом, магнитная мешалка,  стаканы центрифужные, центрифуга, камера Горяева, дозатор механический, наконечники, матрасы, планшеты для культуры клеток, световой микроскоп, 70 ° этиловый спирт, холодильник, термостат.
  • Примерный план занятия (2 часа)
  • 1 Проведение тестирования студентов 
  • 2 Объяснение преподавателя по теме занятия.
  • 3 Демонстрация: а) метода получения первичной культуры клеток; б) метода световой микроскопии культуры клеток
  • 4 Самостоятельная работа студентов: а) световая микроскопия перевиваемых линий клеток б) выполнение рисунков перевиваемых линий клеток
  • 4 Подведение итогов занятия
  • 5 Задание к следующему занятию
  • Контрольные вопросы

1 Что такое культура клеток? Какие преимущества у культуры клеток перед другими живыми системами?

  1. 2  Как классифицируют культуры клеток?
  2. 3 Какую культуру клеток называют первичной? Каким методом её полу-
  3. чают?
  4. 4  Из каких этапов состоит жизненный цикл культуры клеток?
  5. 5  Чем отличается растущая однослойные культура клеток от пережива-
  6. ющей?
  7.    6  Какие культуры клеток называют диплоидными и перевиваемыми?
  8.    7 Какие растворы и питательные среды используют в культивировании кле- ток?
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector