Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Все пациенты интересуются качеством полученных клеток, а в дальнейшем и качеством эмбрионов. Однако данный вопрос многофакторный и не имеет однозначного ответа. Начнем с начала. Первый вопрос, который задают пациенты, когда к ним в палату после процедуры забора ооцитов приходит эмбриолог, звучит всегда одинаково: «А клетки у меня хорошие?». Хочется сразу заметить, что на этот вопрос очень сложно ответить на данном этапе программы ВРТ. Первичная оценка ооцита основана на непосредственном визуальном анализе морфологии ооцит-кумулюсного комплекса. При получении ооцитов эмбриолог смотрит на клетки через бинокулярный микроском с незначительным уровнем увеличения. Выглядит это вот так:

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

В данной ситуации оценить детально качество ооцитов не представляется возможным. Эмбриолог может только делать предположения. Поэтому оценка ооцитов на этапе проведения трансвагинальной пункции яичников не проводится.

После забора ооцитов эмбриолог определяется с тем, каким методом проводить оплодотворение полученных клеток.

Метод оплодотворения выбирается на основании показателей мужского материала. Если показатели спермограммы снижены – выбирается метод ICSI.

Суть его заключается в том, что эмбриолог очищает ооциты от клеток кумулюса и с помощью специальных инструментов, работая на специальном микроскопе, вводит морофологически хороший, активно-подвижный сперматозоид внутрь клетки. Перед тем как ввести сперматозоид в клетку, его обездвиживают.

Данный метод оплодотворения предлагается также парам с бесплодием неясного генеза и пациентам, планирующим проведение преимлантационной генетической диагностики. Помимого этого, ИКСИ может быть проведено по желанию пациента.

При хороших показателях спермограммы проводится оплодотворение методом ЭКО. В чашке со специальной средой соединяют сперматозоиды и ооциты, а оплодотворение происходит естественным способом.

Итак, поговорим более подробно о зрелости и качестве ооцита.

a

Созревание ооцита до состояния, когда он способен к оплодотворению, происходит в процессе стимуляции суперовуляции, проводимой врачом гинекологом-репродуктологом. Не все ооциты в процессе стимуляции достигают зрелости.

  • Способны оплодотворятся только ооциты, находящиеся в стадии метафазы 2 процесса мейоза. Их обозначают как М2.

Зрелый ооцит выглядит так

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

  • Ооциты не достигшие зрелости имеют отличия от ооцита М2, которые эмбриолог способен увидеть только при выполнении оплодотворения методом ICSI. Незрелые ооциты имеют 2 вида: это клетка находящаяся в метафазе 1 мейоза (М1) и так называемый герминальный везикул (GV) ооциты в профазе I деления мейоза, определяемые по наличию зародышевого пузырька или ядерной оболочки в цитоплазме.

М1

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

GV

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

При оплодотворении методом ЭКО такую оценку не проводят. Возможность оценить клетки в данной ситуации возникает только утром следующего дня, а в это время не всегда возможно понять, какими клетки были в момент пункции, т.к. они имеют возможность пройти процесс дозревания в условиях инкубатора.

Что такое качество ооцита

Качество ооцита характеризует внешний вид цитоплазмы, вителлинового слоя, полярного тельца. Гомогенная цитоплазма с однородным цветом и отсутствием гранулярности характеризует хорошее качество ооцита. Вакуоли, темная окраска, всевозможные включения, деформация или гранулярность расцениваются при морфологической оценке качества ооцита как негативные признаки.

Ооцит плохого качества, с гранулированной цитоплазмой и вакуолью большого размера в центре.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Оценка оплодотворения в стадии бластоцисты

Оценка оплодотворения проводится утром следующего за пункцией дня. Этот день считается 1-м днем эмбрионального развития.

Возможность понять, произошло ли оплодотворение клетки, появляется через 18 часов после оплодотвоерния и характеризуется формированием пронуклеусов. Эмбрион первых суток развития называется зиготой.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

На этот день эмбриолог оценивает «правильность» оплодотворения. Нормально оплодотворившийся ооцит содержит 2 пронуклеуса. Все остальные варианты считаются отклонением.

Триплоидный эмбрион (3pn)

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Аномально оплодотворившиеся эмбрионы исключаются из культивирования.

Оценка качества эмбрионов 2-3 дня развития

Начиная со вторых суток эмбрионального развития начинается фаза дробления.

Дробление — это синхронное быстрое деление эмбриона на равные крупные клетки. Эти клетки называются бластомерами. Оценка качества эмбриона производится по равномерности бластомеров.

Чем более равномерные бластомеры содержит эмбрион, тем лучшим считается его качество.

Оценку эмбрионов данных суток развития осуществляют по количеству бластомеров (обозначается цифрой) и по дополнительным критериям, таким как равномерность бластомеров и наличие фрагментации (оценивается латинскими буквами a,b,c,d и их комбинацией).

Эмбрион хорошего качества выглядит так.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

4-е сутки эмбрионального развития

На 4-е сутки развития эмбрион человека состоит уже, как правило, из 16-18 клеток, межклеточные контакты постепенно уплотняются, и поверхность эмбриона сглаживается. Этот процесс называется компактизацией.

Важно понимать, что до 3-х суток дробление эмбриона происходит механически, каждая клетка делится пополам, черпая энергию из запасов ооцита.

Начиная с 4 суток эмбрионального развития начинается дифференциация клеток эмбриона, часть из них сформируют зародыш, остальные будут обеспечивать возможность имплантации и формирования плаценты.

  • На данном этапе эмбрионы наиболее чувствительны к отрицательным воздействиям.
  • Качество бластоцисты, которая сформируется из морулы, оценить практически невозможно.
  • Оценка качества морулы проводится по характеристикам компактизации:
  • А — эмбрион полностью компактизован. Клеточные мембраны видны нечетко.
  • В — компактизовано более 75% бластомеров. Эмбрион сохраняет сферичную форму и гладкую поверхность.
  • С — частичная компактизация (около 50% бластомеров).
  • D — компактизация менее 50% бластомеров. Различимы фрагменты и некомпактизовавшиеся бластомеры.

Морулы отличного качества

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Морула плохого качества

Далее внутри морулы начинает формироваться полость. Когда эта полость достигает достигает 20% от ее объема, эмбрион называется бластоцистой. В норме формирование бластоцисты допускается с конца 4-х по середину 6-х суток развития, но чаще это происходит на 5-е сутки. В редких случаях возможно формирование бластоцисты к 7-м суткам эмбрионального развития.

Бластоциста состоит из двух популяций клеток, таких как: трофэктодерма (однослойный эпителий, окружающий полость) и внутренняя клеточная масса (плотное образование из клеток внутри бластоцисты).

Из трофэктодермы сформируется в дальнейшем плацента и все зародошевые оболочки. Из внутренней клеточной массы будут формироваться все ткани и органы будущего ребенка.

На данном этапе развития эмбрион оценивают по 3 критериям:по размеру полости, качеству трофэктодермы и качеству внутриклеточной массы.

Размер полости оценивают цифрой от 1-ого до 4-х. Внутриклеточную массу и трофэктодерму оценивают буквами от А до С. Первая буква в оценке качества будет относится к внутриклеточной массе, вторая – к качеству трофэктодермы.

Если бластоциста успела совершить «хетчинг» (разрыв оболочки, окружающий эмбрион), такой бастоцисте присваивается цифра 5. Если же бластоциста успела полностью выбраться из оболочки после хетчинга, такую бластоцисту обозначат цифрой 6.

Размер полости имеет меньшее значение в определении качества эмбриона, чем буквенная классификация. Ввиду того, что эмбрионы имеют индивидуальные особенности, они могут развиваться неравномерно. Любой размер полости определяется как вариант нормы.

Буквенные обозначения следует понимать так: наивысшее качество оценивается буквой А, наихудший вариант развития внутриклеточной массы и трофэктодермы обозначается буквой С.

Важно понимать, что критерии оценки эмбрионов носят субъективный характер. Даже эмбрионы, оцененные по классификации как эбмрионы среднего и ниже среднего качества, могут дать полноценную беременность.

  1. Бластоцисты хорошего качества
  2. 3АА
  3. 4АА
  4. 5АА
  5. 5АА
  6. 6АА
  7. Бластоцисты среднего качества
  8. 1АВ
  9. 2ВВ
  10. Бластоцисты плохого качества
  11. 2ВС
  12. 3ВС
  13. 2СС

Предимплантационная диагностика эмбрионов (PGD)

В Германии  в 2011 году был принят закон, разрешающий предимплантационную диагностику эмбрионов.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в полость матки, то есть до начала беременности. Обычно для анализа проводится  биопсия одного бластомера у эмбриона, находящегося на стадии дробления (4-10 бластомеров).

При материнском носительстве генетической патологии возможна биопсия 1-го полярного тельца яйцеклетки до оплодотворения. Преимплантационная генетическая диагностика рассматривается в качестве способа альтернативного  пренатальной диагностике.

  Ее главное преимущество заключается в том, что при ее использовании отсутствует селективное прерывание беременности, а вероятность рождения ребёнка без диагностируемого генетического заболевания достаточно высока.

Таким образом, ПГД  требует экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Показания для проведения преимплантационной диагностики

Преимплантационная генетическая диагностика показана супружеским парам, у которых имеется носительство  хромосомной перестройки или моногенного заболевания. Примерами моногенных заболеваний могут служить муковисцмдоз, болезнь Тея-Сакса, серповидноклеточная анемия, гемофилия, миодистрофия Дюшена и многие другие.

Кроме этого, преимплантационная генетическая диагностика проводится у супружеских пар с повышенным риском врождённых аномалий у детей, который не связан с носительством диагностированных мутаций.

К таким случаям относятся пары:

  1. где возраст матери превышает 35 лет;
  2. где возраст отца выше 39 лет;
  3. если у отца наблюдаются тяжёлые нарушения сперматогенеза;
  4. у супружеских пар с привычным невынашиванием;
  5. у супружеских пар с повторяющимися неудачными попытками ЭКО.
Читайте также:  Вирусы оспы. Виды вирусов оспы. Строение вирусов оспы.

В случае неопределённого повышенного риска рождения ребёнка с врожденными аномалиями преимплантационная генетическая диагностика  чаще всего проводится для девяти хромосом, с которыми связаны наиболее часто встречающиеся врождённые заболевания.

Это хромосома 13 (синдром Патау), хромосома 15 ( синдром Прадера-Вилли), хромосома 16, хромосома 17, хромосома 18 (синдром Эдвардса), хромосома 21 ( синдром Дауна), хромосома 22 (синдром «кошачьих зрачков»), а также Х и У, (различные численные аномалии, включая  синдром Шерешевского-Тернера и синдром Кляйнфельтера).

В настоящее время  за границей уже диагностируется следующие болезни:

  1. Хорея Гентингтона
  2. Синдром ломкой Х-хромосомы
  3. Миотоническая дистрофия
  4. Синдром Марфана
  5. Ретиношизис
  6. Гемофилия-А
  7. Фиброзно-кистозная дегенерация
  8. Бета-таласемия
  9. Гидроцефалия
  10. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса
  11. Недержание пигмента
  12. Острая интермиттирующая порфирия
  13. Адренолейкодистрофия
  14. Спинально-церебеллярная атаксия 3
  15. Мышечная дистрофия Дюшенна
  16. Гипокальциемический паралич
  17. Ангионевротический отек
  18. Синдром Карнея
  19. Nistagmus

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Как проводится ПГД?

Проведение преимплантационной диагностики возможно только в рамках лечебного цикла ЭКО, а точнее экстракорпорального оплодотворения с интраплазматической инъекцией сперматозоидов (ИКСИ), то есть сперматозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургических инструментов.

Процедура ИКСИ необходима в связи с тем, что при обычном ЭКО к яйцеклетке добавляется большое количество сперматозоидов.

Затем, при заборе полярных телец или бластомеров, есть риск попадания в анализ вместе с клеткой эмбриона генетического материала сперматозоида, не участвовавшего в оплодотворении.

Подготовка к лечебному циклу и сам лечебный цикл ЭКО с ПГД практически не отличается от обычного лечебного цикла ЭКО:

  • женщина получает гормональные препараты для стимуляции суперовуляции;
  • производится трансвагинальная пункция фолликулов;
  • оплодотворение яйцеклеток сперматозоидами проводится в условиях эмбриологической лаборатории;
  • перенос эмбрионов в матку проводится на 5-6 сутки.

Диагностика генетических нарушений

Если генетическое нарушение наследуется от женщины, то можно отобрать «здоровые» эмбрионы, пройдя процедуру тестирования только полярных телец, не трогая сам эмбрион. Также можно протестировать только бластомеры.

Либо может проводиться последовательное изучение полярных телец, затем бластомеров.Какая именно схема ПГД будет применяться для каждого конкретного случая, определяется на консультации с врачом-генетиком при планировании ПГД.

Как правило, в большинстве случаев проводится последовательный анализ сначала полярных телец, затем бластомеров. Это связано с тем, что включение в исследование полярных телец и бластомеров повышает точность и эффективность диагностики.

При первом делении мейоза овоцит 1-го порядка делится, в результате чего образуются овоцит 2-го порядка и небольшое первое редукционное тельце (обе клетки с диплоидным набором хромосом).

При втором делении мейоза в результате деления овоцита 2-го порядка образуются одна яйцеклетка и второе редукционное тельце. Первое редукционное тельце иногда тоже делится на две одинаковые мелкие клетки.

В результате этих преобразований овоцита 1-го порядка образуются одна яйцеклетка и три редукционных тельца, где и яйцеклетка, и редукционные тельца имеют гаплоидный набор хромосом.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Перед переносом эмбриолог оценивает строение и форму эмбрионов. Результат генетической диагностики сопоставляется с морфологией эмбрионов и делается заключение о том, какие эмбрионы рекомендуются для переноса в матку. Для переноса отбирают самые лучшие по морфологическим характеристикам эмбрионы без генетических нарушений.

Анализ проводится в очень сжатые сроки. Для анализа бластомеров доступно всего 2 суток, так как эмбрион не может продолжать своё развитие вне организма матери далее стадии бластоцисты (5-е сутки после оплодотворения), поэтому исследование обязательно должно быть выполнено за это короткое время.

Используемые генетические методы

Для числовых и структурных хромосомных нарушений применяется метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ).При проведении ПГД моногенных заболеваний применяется метод ПЦР.

  1. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) — метод цитогенетического анализа, используемый для выявления и локализации присутствия специфических последовательностей ДНК-хромосом. Так изучается не только морфология хромосом, но и последовательности ДНК, входящие в их состав. Используются ДНК-зонды, которые представляют собой нуклеотидную последовательность ограниченного размера комплементарную определённому участку ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата. Зонд несет «метку», то есть содержит нуклеотиды, связанные с флуорофором (молекула, способная к флуоресценции). Таким образом, при помощи  флуоресцентной микроскопии наблюдается свечение специфических последовательностей ДНК хромосом.
  2. Полимеразная цепная реакция — метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Преимущества преимплантационной диагностики

  1. Выбор и перенос в матку только тех эмбрионов, которые не имеют хромосомных патологий
  2. Снижение риска рождения ребёнка с определёнными генетическими дефектами
  3. Снижение риска невынашивания (примерно в 2 раза)
  4. Снижение риска многоплодия (примерно в 2 раза)
  5. Увеличение шанса на успешную имплантацию (примерно на 10 %)
  6. Увеличение шансов на благополучное рождение ребёнка (примерно на 15-20 %)

Риски при проведении преимплантационной диагностики

  • Риск случайного повреждения эмбриона (

Преимплантационная генетическая диагностика или скрининг

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) или скрининг (ПГС) проводится при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) с целью исключения генетических аномалий у эмбрионов до момента их имплантации в полость матки.

Преимплантационный генетический скрининг эмбриона на хромосомные аномалии позволяет отобрать здоровые эмбрионы с нормальным числом хромосом (эуплоидные).

Эмбрионы с неправильным количеством хромосом (анэуплоидные), являются либо нежизнеспособными, либо несут риск рождения ребенка с генетической патологией, в том числе с синдромом Дауна, пороками развития различных органов и систем.

Перенос эмбриона с нормальным количеством хромосом значительно повышает результативность программы ЭКО, уменьшает количество неудачных попыток, снижает риск невынашивания беременности.

Кроме того, ПГД является единственным методом профилактики передачи в семье моногенных заболеваний. Технология преимплантационной диагностики позволяет свести к минимуму риск рождения ребенка с патологией у супругов, являющихся носителями наследственного моногенного заболевания (дефектного гена).

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Пгд рекомендовано:

  • При бесплодии, привычном невынашивании беременности
  • При неоднократных неудачных попытках ЭКО
  • При возрасте женщины старше 35 лет
  • При наличии высокого риска передачи наследственных заболеваний

Техника выполнения ПГД

Для проведения преимплантационной генетической диагностики эмбрионам проводится биопсия на 3 день (биопсия бластомера) или на 5 день (биопсия трофэктодермы) их развития.

На третий день развития эмбрион, как правило, состоит из восьми бластомеров (клеток). Биопсия эмбриона на данной стадии представляет собой отделение одной клетки от эмбриона.

При этом существует риск повреждения эмбриона, что влечет за собой снижение потенциала его дальнейшего развития.

Кроме того, на этой стадии эмбрионы имеют высокий уровень мозаицизма (до 55%), то есть наличия хотя бы одной клетки, отличающейся по хромосомному набору (генетическому составу) от остальных, что обуславливает риск ложнопложительных и ложноотрицательных результатов диагностики.

Более распространенной в современной практике является биопсия эмбриона на пятый день развития. В этот момент эмбрион уже находится в стадии бластоцисты (ранней стадии развития зародыша), состоящей из двух слоев клеток: внутриклеточной массы и трофэктодермы.

Впоследствии трофэктодерма участвует в образовании плаценты, а внутриклеточная масса — в образовании плода. В процессе биопсии эмбриолог с помощью микроинструментов забирает сразу несколько клеток трофэктодермы, внезародышевой ткани.

Это существенно снижает риск повреждения эмбриона, риск наличия мозаицизма, получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования, обеспечивает безопасность процедуры и повышает точность диагностики.

Оборудование для проведения безопасного ПГД

В Доме Планирования Семьи отдается преимущество проведению биопсии эмбрионов на 5 день. Техника проведения такой биопсии требует от эмбриолога значительного опыта и наличия высококлассного оборудования в лаборатории.

Биопсия проводится экспертами-эмбриологами на современном и надежном оборудовании — инвертированном микроскопе Olympus, оснащенном микроманипуляторами Narishige и активным лазером OCTAX NaviLase.

Этот лазер позволяет максимально точно и безопасно отделить одну или несколько клеток (биоптат) от эмбриона.

OCTAX NaviLase минимизирует вредное воздействие на клетку за счет низкой инвазивности и минимального облучения, и является предметом гордости Эмбриологической лаборатории клиники.

Точность диагностики

Генетический анализ на хромосомный набор может выполняться разными методами, в числе которых метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ), aCGH (метод сравнительной геномной гибридизации) и NGS (метод полногеномного секвенирования).

Наша Клиника использует только самые современные методы aCGH и NGS, обеспечивающие информативные и надежные результаты.

Слаженная работа команды репродуктологов, эмбриологов и генетиков позволяет достичь высокий процент наступления беременности в Клинике.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты

Диагностика на изолированных бластомерах позволяет получить точную информацию о генотипе эмбриона. В основном биопсия 1-2 бластомеров осуществляется у эмбрионов на стадии 8-10 клеток.

Читайте также:  Опухоль фолликулярной воронки. трихоэпителиома.

Поскольку на ранних стадиях дробления все бластомеры тотипотентны (т.е. взаимозаменяемы), удаление нескольких клеток не сказывается на дальнейшем развитии эмбриона.

Методически анализ единичных бластомеров от дробящихся зародышей принщЕгшально не отличается от анализа полярных телец.

Выбор метода молекулярной диагностики определяется спецификой исследуемой мутации и включает как ПЦР для одновременной детекции нескольких мутаций (мультиплексная ПЦР), так и более сложные ДНК-методы.

Их применение позволяет проводить диагностику наиболее распространенных аутосомно-рецессивных моногенных болезней — муковисцидоза, талассемии, спинальной мышечной атрофии, болезни Тея — Сакса, а также аутосомно-доминантных — миотонической дистрофии, синдрома Марфана, хореи Гентингтона и Х-сцепленных — миодистрофии Дюшенна и синдрома ломкой Х-хромосомы.

Цитогенетическая доимплантационая диагностика проводится на 1-2 бластомерах FISH-методом с использованием ДНК-зондов, специфичных к прицентромерным районам хромосом 16, 18, 21, 13, X, Y. В случае гетерозиготного носительства транслокации одним из родителей предпринимаются попытки использования цельнохромосомных ДНК-зондов.

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Проблема диагностики гетероплоидии осложняется высокой частотой хромосомного мозаицизма на ранних стадиях эмбриогенеза человека. Так, показано, что 38—46% морфологически нормальных эмбрионов на стадии 8-10 клеток имеют три и более анеуплоидных бластомера.

Число бластомеров, различающихся по числу и набору хромосом, может достигать половины всех клеток зародыша. Поскольку заключение, основанное на анализе 1-2 клеток, не в полной мере отражает хромосомный статус формирующего зародыша вследствие высокой частоты аномальной сегрегации хромосом при дроблении зиготы, вероятность диагностических ошибок велика.

Поэтому ДД может быть рекомендована в случаях высокого риска (25-50%) рождения ребенка с наследственной патологией.

Диагностика на стадии бластоцисты является одним из перспективных направлений ДД. На стадии бластоцисты зародыш состоит примерно из 60-100 клеток. При визуализации трофо- и эмбриобласта без ущерба для развития эмбриона можно удалить до 10 клеток трофобласта.

Однако следует учитывать, что культивирование эмбрионов in vitro в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) редко доводят до стадии бластоцисты, так как способность таких эмбрионов к имплантации может оказаться существенно сниженной.

В то же время частота морфологически нормальных эмбрионов с мозаичной формой численных хромосомных аберраций остается достаточно высокой и достигает 40%.

Таким образом, основное (и единственное) преимущество доимплантационой диагностики заключается в возможности трансплантации генетически полноценных эмбрионов.

Недостатками этого подхода являются: методические трудности, связанные с необходимостью работы с микроколичествами материала, ограничения диагностики рамками программ ЗКО и большая вероятность ошибочной диагностики, обусловленной сложностями анализа единичных клеток. Перспективы анализа большего числа клеток, безусловно, повысят разрешающую способность методов ДД.

Однако при анализе даже нескольких клеток трофобласта проблема хромосомного мозаицизма остается нерешенной и, следовательно, не исключает необходимости проведения последующей ПД на постимплантационных стадиях.

В заключение отметим два основных обстоятельства, сдерживающих развитие доимплантационой диагностики в России.

Во-первых, эти исследования даже в наиболее развитых отечественных центрах вспомогательных репродуктивных технологий пока находятся на стадии научных разработок.

Это означает, что после проведения ДД и наступления долгожданной беременности после трансплантации оперированных зародышей на постимплантационных стадиях целесообразно провести ПД стандартными методами.

Во-вторых, доимплантационая диагностика невозможна без наличия высокоточного оборудования для молекулярных и цитогенетических исследований, прецизионной техники для микрохирургических операций яйцеклеток и бластоцист, высококвалифицированных специалистов — цитогенетиков, молекулярных биологов и эмбриологов и, конечно, специальных высококачественных реактивов, в том числе хромосом- и локус-специфических ДНК-зондов и расходных материалов. В результате этого ДД, безусловно, существенно увеличивает и без того высокую стоимость процедуры ЭКО и делает ее малодоступной для жителей России.

— Также рекомендуем «Нерутинные методы пренатальной диагностики. Клетка плода в трансцервикальных образцах..»

Оглавление темы «Генная патология плода.»: 1. Генные болезни плода. Пренатальная диагностика генных болезней плода. 2. Сроки пренатальной диагностики генных болезней. 3. Основные подходы к пренатальной диагностике генных болезней. Прямая диагностика генных аномалий. 4. Косвенная диагностика генных болезней. Точность молекулярной диагностики — возможные источники ошибок. 5. Комбинированная диагностика генных болезней. Биохимические методы в пренатальной диагностике. 6. Содержание альфафетопротеина (АФП) в амниотической жидкости. Ацетилхолинэстераза и пренатальная диагностика дефектов нервной трубки. 7. Биохимическая пренатальная диагностика муковисцидоза, гиперплазии коры надпочечников. 8. Доимплантационная диагностика патологии плода. 9. Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты. 10. Нерутинные методы пренатальной диагностики. Клетка плода в трансцервикальных образцах.

Биопсия бластомера/трофэктодермы / полярного тельца ооцита

Диагностика на изолированных бластомерах. Диагностика патологии на стадии бластоцисты.

Протокол ЭКО – сложный многоэтапный процесс, результатом которого в идеале должно стать рождение здорового ребенка. Одна из процедур, которая помогает будущим родителям и медикам достичь желаемого – предимплантационная генетическая диагностика плода (ПГД).

Что такое ПГД

Предимплантационная диагностика генетических заболеваний – это генетический анализ, который проводится на стадии культивирования эмбриона, до переноса его в полость матки будущей матери. Благодаря ПГД отклонения в геноме плода можно выявить еще до наступления беременности.

Таким образом, многократно уменьшается риск:

  • рождения больного ребенка
  • получения замершей беременности
  • самопроизвольного аборта (выкидыша)
  • иммунного конфликта между матерью и ребенком.

Биопсия (забор клеток) может проводиться на разных стадиях, в зависимости от каждого конкретного случая:

  • на стадии яйцеклетки/зиготы (полярные тельца яйцеклетки исследуют обычно, если будущая мама является носителем аномалии)
  • на стадии дробления эмбриона на 6-8 бластомеров, примерно на третий день его развития (один из бластомеров отбирают для исследования)
  • на стадии бластоцисты – на пятый день развития эмбриона производят забор 5 – 7 клеток трофэктодермы, что дает более достоверные результаты).

Сегодня существуют разные методы ПГД, которые применяются в зависимости от того, каким оборудованием оснащена генетическая лаборатория:

  • FISH (флуорисцентная гибридизация in situ (то есть на своем месте) – довольно доступный и быстрый метод диагностики, который, к сожалению, не позволяет сделать анализ всех хромосом
  • CGH — Comparative Genomic Hybridization (сравнительная геномная гибридизация) – в этом случае на генетические отклонения могут быть диагностированы все 24 хромосомы в эмбрионе
  • PCR — Polymerase chain reaction (полимерная цепная реакция) – метод, который позволяет диагностировать заболевания, в основе которых лежат доминантные и рецессивные мутации, определять хромосомные нарушения, антигены системы HLA, а также резус-фактор эмбрионов. Прежде, чем проводить PCR эмбриона, необходимо обследовать будущих родителей, а иногда и других близких родственников на наличие мутации
  • NGS — Now-Generation Sequencing (высокопроизводительное секвенирование) – наиболее современный и дорогостоящий метод, который позволяет максимально точно проводить генетический тест, находя мутации в любом участке хромосом.

Биопсия бластомера

Биопсия бластомера – процедура, при которой в блестящей оболочке эмбриона (зоне пеллюцида) делают микроскопический прокол, через который при помощи биопсийной иглы отбирают для исследования один или два бластомера.

Безопасность процедуры доказана: после биопсии, в ходе которой изымается не более двух клеток, эмбрион продолжает нормально развиваться, сохраняя достаточное количество генетического материала.

Биопсия трофэктодермы

В ходе биопсии трофэктодермы (поверхностного слоя бластоцисты) изымаются клетки, из которых впоследствии формируются внезародышевые ткани – плацента. Извлечения внутренних клеток эмбриона в этом случае не требуется. Диагностика генетических нарушений в этом случае более точна, так как может проводиться при помощи большего количества клеток.

Какие заболевания позволяет выявить ПГД

Предимплантационная генетическая диагностика эмбрионов позволяет выявить до полутора сотен наследственных заболеваний – моногенных мутаций или генетический аномалий.

Среди последних – синдром Дауна, синдромы Эдвардса, Патау, Тернера, Кляйнфельда. Среди наиболее распространенных моногенных мутаций — гемофилия, фенилкетонурия, муковисцедоз, гемолгобинопания, наследственные миопатии, хорея Гемингтона, синдром Мартина-Белла, нейросенсорная тугоухость, невральная амиотрофия и другие.

Показания к проведению

В ряде случает проведение ПГД необходимо. Сдать генетический анализ нужно, если

  • хотя бы один из родителей страдает генетическими болезнями или является их носителем
  • генетические или хромосомные аномалии выявлены в сперматозоидах или яйцеклетках
  • олигозооспермия, азооспермия, большой процент аномальных сперматозоидов обнаружены в отцовском материале
  • возраст матери – больше 35 лет, а отца – больше 39 лет
  • имеет место невынашивание беременности (два выкидыша и более)
  • резус-конфликт привел к гибели ребенка
  • в анамнезе есть несколько неудачных попыток ЭКО

Классификация эмбрионов: оценка качества эмбрионов в программах ЭКО

Хотим сразу предупредить — ни в коем случае не стоит забывать, что для того, чтобы самостоятельно оценить перспективы и принять решение о переносе эмбриона нужно быть настоящим специалистом, имеющим помимо специального образования достаточный опыт.

В каждом конкретном случае решение и прогноз основывается на совокупности всех известных данных и чаще всего является коллективным решением врача и эмбриолога.

Главная сложность состоит в том, что каждому этапу развития эмбриона соответствует своя система оценки качества и способ записи этой оценки.

И для того чтобы понимать обозначения вроде «8с» необходимо хотя бы немного разобраться в содержании этих этапов и сопутствующих терминах.

Читайте также:  Профилактика некариозных поражений зубов.

День первый

На первом этапе эмбриолог оценивает признаки оплодотворения после проведенной процедуры ЭКО, ИКСИ, ИМСИ или PICSI. На этом этапе в эмбрионе оценивают наличие, количество, симметричность, внутреннее строение и внешний вид пронуклеусов.

Пронуклеусы — это ядра мужской и женской половых клеток еще не слившихся и несущих одинарный набор хромосом. 

По их количеству и внешнему виду оценивают жизнеспособность эмбриона и перспективы возникновения патологий.

 В норме их должно быть два, они должны иметь относительно равные размеры, находиться рядом и иметь внутри «ядрышки» — пронуклеоли тоже в определенном количестве и расположенные определенным образом.

На этом этапе может формироваться множество патологий, например, при присутствии только одного пронуклеуса оплодотворение и не сможет произойти, ведь именно это образование и есть носитель генетического материала, а без участия противоположного пола размножаться мы еще не научились.

 Пронуклеусов может оказаться и три. Такие эмбрионы часто несут аномальный, тройной набор хромосом и нежизнеспособны. Обычно они погибают до имплантации (прикрепления к стенке матки) или приводят к замершей беременности. Такие эмбрионы отбраковываются и не используются в программах ЭКО.

День второй

Вторые сутки знаменуются соединением ядер женской гаметы и мужской, а также процессом дробления зиготы, которая на этой стадии становится эмбрионом. Численность бластомеров (эмбриональных клеток) – 2–4, но их объем не увеличивается.

Дробление эмбрионов оценивается специалистом по таким критериям:

  • количество эмбриональных клеток;
  • форма, строение, размеры;
  • симметричность деления;
  • скорость дробления;
  • число ядер в бластомерах. В норме бластомеры одноядерные, при патологиях возникает мультинуклеация (более одного ядра), что, скорее всего, свидетельствует о хромосомном нарушении у эмбриона;
  • отклонения в цитоплазме (содержимое клетки);
  • наличие участков цитоплазмы, неимеющих ядер (фрагментация). Чем выше степень фрагментации, тем больше рисков, что эмбрион далее будет развиваться. На сегодняшний день до конца непонятно, почему происходит фрагментация, которая встречается в программах ЭКО довольно часто: является ли это следствием стимуляции или это характерная особенность эмбрионального развития. Максимальной имплантационной способностью обладают эмбрионы с регулярной формой бластомеров, отсутствием фрагментации, нормальной скоростью деления.

Уровень фрагментации и численность бластомеров классифицируется по типам следующим образом:

  • А – высококачественный эмбрион без фрагментированных бластомеров;
  • В – среднекачественный эмбрион, фрагментация составляет менее 20%;
  • С – удовлетворительное качество эмбриона, фрагментация составляет 21–50%.

Самый качественный эмбрион — 4А, где 4 — количество бластомеров, А — отсутствие фрагментации.

Эмбрион на второй день

День третий

Продолжается дробление эмбриона, у которого насчитывается от 4 до 9 бластомеров. В начале третьего дня развития запускается собственная генетическая программа, которая в некоторых случаях содержит «опечатки».

До этого эмбрион для своего роста «пользуется» веществами, накопленными яйцеклеткой во время ее созревания. Если эмбрион имеет мутации в программе («блок развития»), то далее он не развивается.

Это происходит примерно в 20% случаях.

Причиной «блока развития» может быть низкокачественная семенная жидкость или яйцеклетка. Изначальное неудовлетворительное развитие эмбриона свидетельствует о проблемах с яйцеклеткой, если эмбрион «страдает» с третьих суток культивирования, то сперма была ненадлежащего качества.

 «Блок развития» – это так называемый естественный отбор, эволюционный спасительный механизм, который останавливает развитие некачественных эмбрионов. Как в дальнейшем будет развиваться и расти эмбрион зависит от сформированного генома и своевременности начала его функционирования.

Эмбрион на третий день

День четвертый

К этому сроку эмбрион содержит до восьми бластомер. Клетки контактируют значительно активнее, поверхность у эмбриона немного сглаживается.

Культивирование эмбриона третьи сутки характеризуется началом такого процесса, как компактизация, когда границы эмбриональных клеток различить невозможно. Компактизация бывает частичная или полная.

Если этот процесс произошел на второй день, то возможно эмбрион развивается неправильно, с отклонениями, что отображается в эмбриологическом протоколе. Готовится переход эмбриона в бластоцисту.

В моруле (трехдневный эмбрион) содержится до 16 бластомеров.

При естественном зачатии на этом сроке эмбрион транспортируется из фаллопиевых труб в матку. По окончании четвертых суток происходит кавитация, когда внутри эмбриона образуется пустота.

В процессе эмбрионального роста за пределы зародышевой оболочки выходит определенное количество клеток. Эти клетки при необходимости генетического исследования забирают на анализ. Диагностику проводит эмбриолог на 5–6 сутки, прокалывая зародышевую оболочку.

Биопсия абсолютно безопасна для эмбриона и не вредит его развитию. До получения диагностических данных эмбрионы криоконсервируют.

Результаты исследования напрямую повлияют на дальнейшую «судьбу» эмбриона, характеристики которого никак не меняются после размораживания.

Современные безопасные технологии замораживания биоматериала позволили широко внедрить в различные программы ВРТ генетическую диагностику.

На четвертый день оценка эмбриона малоинформативна, но его можно оценить по численности компактизированных клеток. Чем больше таких клеток, тем вероятнее эмбрион станет бластоцистой.

Оценивание компактизации происходит по классам:

  • первый – компактизировано меньше 50% клеток;
  • второй – примерно 50%;
  • третий – 75%;
  • четвертый – 100%.

Не во всех лабораториях происходит оценка по такому критерию.

Четвертый день развития. Стадия морулы

День пятый

На данном этапе, включающем период с конца четвертого до начала шестого дня, морула, полость которой составляет половину своего объема, становится бластоцистой, состоящей из двух типов клеток:

  • Трофобласт – наружная оболочка, состоящая из однослойного эпителия, расположенная вокруг внутренней полости. Задача трофэктодермы – регуляция и контроль над имплантацией эмбриона в эндометрий, развитие плаценты и внеэмбриональных оболочек.
  • Эмбриобласт (внутриклеточная масса) – масса служит основой для образования тканей и органов будущего ребенка.

Ооцит окружен блестящей оболочкой плотной консистенции (Zona pellucida), выполняющей две функции: она препятствует проникновению в яйцеклетку более одного спермия и удерживает вместе бластомеры.

По мере роста внутриэмбриональная полость расширяется, приводя к разрыву оболочки, в результате чего происходит выход бластоцисты или «хэтчинг» (вылупление).

 На этом этапе оценка эмбриона происходит по таким критериям:

  • объем внутренней полости;
  • степень выхода за оболочку;
  • плотность трофэктодермы;
  • количество эмбриобластов.

Качество обозначается цифрами (1–5), количество — буквами (А-С).

На пятый день бластоцисты переносят в матку или замораживают. Бластоцисты оценивают по степени зрелости (бластуляция):

  • первая степень – ранняя бластоциста с внутренней полостью меньше 50% объема эмбриона;
  • вторая – полость больше 50% объема;
  • третья – полость занимает 100% объема эмбриона;
  • четвертая – расширенная бластоциста с полостью становится больше оболочки (Zona pellucida), которая истончается;
  • пятая – проникновение трофобласта через оболочку;
  • шестая – бластоциста покинула Zona pellucida.

Шестой день развития. Стадия бластоцисты

Оценка эмбриобласта

Важнейший критерий внутриклеточной массы (ВКМ) – плотность, сгруппированность. Эмбрион считается более качественным, если отмечается высокая плотность ВКМ.

  • А – большое количество плотно сгруппированной внутриклеточной массы.
  • В – количество клеток и плотность средняя.
  • С – количество ВКМ незначительно.

Критерии трофэктодермы – количество и маленький размер:

  • А – многочисленные клетки трофэктодермы.
  • В – незначительная численность клеток.
  • С – большого размера клетки в небольшом количестве.

Степень приживаемости эмбрионов в полости матки оценивают спустя две недели по исследованию крови на ХГЧ. Более достоверная информация будет получена с помощью УЗ-диагностики через три недели. Вероятность наступления беременности зависит во многом от качества имплантированных эмбрионов.

 Морфологические данные, используемые для оценивания эмбрионов, являются необходимыми и основными, но этого не всегда достаточно. Иногда при переносе высококачественных эмбрионов они не имплантируются. В других случаях при переносе эмбрионов невысокого качества наступает беременность.

Поэтому эмбриологи используют дополнительные варианты оценивания, позволяющие спрогнозировать имплантацию.

Развитие эмбрионов является сложным трудоемким процессом, в котором нужно учитывать массу тонких нюансов, что под силу только высокопрофессиональным специалистам. Если в ходе проведения программы ЭКО удалось довести 40% эмбрионов до этапа бластоцисты отличного качества, то программа считается успешной.

В этом плане криотехнологии, применяемые в протоколах ЭКО, неоценимы, поскольку есть возможность не только перенести в матку высококачественные эмбрионы, но и заморозить оставшиеся. Это преимущество позволяет использовать криозамороженный биоматериал при следующем переносе, минуя несколько небезопасных для здоровья и дорогостоящих этапов.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector