Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Е.А.ТКАЧЕНКО1, А.А.ИШМУХАМЕТОВ2, Т.К.ДЗАГУРОВА1, А.А.СИНЮГИНА2, Н.А.КОРОТИНА1, П.А.НАБАТНИКОВ1, С.Е.СОЦКОВА1, М.В.БАЛОВНЕВА1, А.Е.МАЛКИН2

1ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова», Москва;

2ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова», Москва.     

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека.

Случаи заболевания ГЛПС регистрируется в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, в целом по стране.

98% от общего числа случаев ГЛПС в России регистрируются в европейских регионах и 2% — в азиатских, главным образом, на Дальнем Востоке [1].

По данным Роспотребнадзора только за 15 лет XXI века было зарегистрировано более 108 тысяч случаев ГЛПС в 7 из 8 Федеральных округах, включая более 2,5 тысяч детей в возрасте до 14 лет. У более 400 больных ГЛПС тяжёлое клиническое течение болезни закончилось летальным исходом (Рис.1)

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Результаты анализа структуры заболеваемости ГЛПС в России свидетельствуют об этиологической роли 5 хантавирусов. 97,7% всех случаев ГЛПС в России этиологически обусловлены вирусом Puumala (Рис.

2) и, только 2,3% — другими вирусами:  Hantaan, Amur и Seoul (все вместе -1,5%) и двумя генотипами (“Kurkino” и “Sochi”) вируса Dobrava/Belgrade (0,8%), что указывает на ведущую этиологическую роль вирусов серотипа Puumala в структуре заболеваемости ГЛПС в России.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, значительная частота тяжелых форм течения болезни, сопровождающихся длительным периодом пониженной трудоспособности, отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость проблемы ГЛПС в России.

Социально-экономические потери усугубляются также тем, что из числа заболевших геморрагической лихорадкой до 85% составляют мужчины в возрасте от 20 до 40 лет, то есть, наиболее продуктивная часть населения. Из всего комплекса мер неспецифической профилактики ГЛПС наиболее часто применяемой остается дератизация.

  Дератизационные мероприятия обходятся  довольно дорого, а их применение обеспечивает лишь  кратковременное  снижение  численности грызунов на обработанных территориях и не решает проблемы ликвидации природного резервуара хантавируса.

  Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является вакцинопрофилактика, что было продемонстрировано на протяжении последних 20 лет в Китае, Южной и Северной Корее.

Однако вакцины против ГЛПС, производимые в этих странах на  основе вирусов Hantaan и Seoul, не обладают защитным действием  против  вируса Puumala – основного возбудителя ГЛПС у жителей Европейской части России, на которую приходится около 98% всей заболеваемости, регистрируемой в России.

Трудности с разработкой культуральной вакцины против хантавируса Puumala довольно долго оставались не решёнными, в основном, из-за ограниченного выбора чувствительных к размножению этого вируса клеточных культур,  низкого уровня репродукции вируса, отсутствия цитопатогенного действия.

Следует отметить, что материальные затраты, связанные с лечением одного больного ГЛПС составляют ориентировочно 60-90 тысяч рублей. Соответственно, с учётом средней ежегодной заболеваемости в России (10 000 больных) затраты могут составить более 600 миллионов рублей.

При ориентировочной стоимости 1 дозы вакцины 200 рублей, затраты на проведение полной трёхкратной вакцинации одного человека составят, приблизительно 700 рублей, т.е. в 1000 раз меньше затрат на лечение.

Кроме того, ежегодные финансовые затраты на проведение дератизационных работ на эндемичных по ГЛПС административных территориях (а их только в европейской части России не менее 30) составляют от 15 до 20 миллионов рублей на каждую область.      Население эндемичных территорий, нуждающееся в вакцинопрофилактике этой инфекции составляет только в России около 20 миллионов человек, что обусловливает высокую коммерческую ценность вакцины и, соответственно значительную финансовую прибыль от реализации вакцины. Создание вакцины против ГЛПС и ее широкое внедрение в  практику здравоохранения позволит в значительной  степени  уменьшить  тяжесть социально-экономических последствий, связанных с высокой заболеваемостью ГЛПС, сопровождающейся нередко летальным исходом. В связи с вышеизложенным, одной из наиболее актуальных и приоритетных в настоящее время проблем является разработка технологии изготовления вакцинных препаратов против ГЛПС, эффективных для применения в России и отвечающих современным требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам, вводимым людям.  

Биотехнологические основы конструирования культуральной, инактинированной вакцины против ГЛПС

При изготовлении вакцины ГЛПС в качестве субстрата для размножения хантавируса Puumala использовали линию перевиваемых клеток почек зеленой мартышки VERO, полученную из ВОЗ (WHO Vero cell bank from ECACC, Accession number 991042). Линия клеток VERO аттестована и рекомендована в качестве возможного субстрата для производства инактивированных вакцин (Протокол № 3  Заседания Ученого совета ГИСК им.Л.А,Тарасевича от 20 марта 2003 г. и Протокол №3 от 22 мая 2003 г. Комитета медицинских иммунобиологических препаратов). Использование этой линии клеток для производства инактивированной вакцины ГЛПС стало возможным в результате успешной адаптации штамма ТКД/Уфа-97 вируса Puumala, выделенного из крови больного ГЛПС в Башкирии, к размножению в клетках VERO. Адоптированный в процессе 20-ти кратного пассирования в культуре клеток VERO хантавирусный штамм не мог, однако, непосредственно использоваться в качестве посевного вируса, поскольку ранее его культивировали на перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (линия клеток  VERO-E6). Несмотря на то, что по паспорту, культура клеток   VERO-E6 не обладала туморогенностью и не содержала посторонних агентов, тем не менее, полностью нельзя было исключить возможность контаминации штамма нежелательными компонентами,  в том числе возможными онкогенами. В связи с этим была проведена очистка штамма от посторонней ДНК путём обработки ДНКазой и последующей очистки зональным ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. В результате получена соответствующая фракция вируса, которая после фильтрования через фильтр 0,22 мкм была использована для наработки штаммового запаса вируса, который был  охарактеризован  по всем требованиям, предъявляемым к аналогичным препаратам, включая тесты на специфическую идентичность, стерильность, отсутствие микоплазм, клеточной ДНК и т.д.  (Сборник инструкций по общим методам контроля МИБП, утвержденный приказом Госкомсанэпиднадзора РФ от 31.10.96).

Перечисленные контроли осуществлены дважды: — на уровне производственных штаммов и собственно посевных вирусов. Аттестованный посевной штамм ТКД/Уфа-97 (Табл. 1) был использован для накопления вируссодержащего материала, послужившего основой для изготовления экспериментальных серий вакцинного препарата.

 Таблица 1. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей M сегмента вакцинного штамма ПУУ-ТКД/VERO (с 172 по 1239 нп)           
                                                              Штаммы   вируса   Puumala   Hantaan
   Уфа-97    ТКД/VERO   К-27   Р-360   CG-1820   76-118
  ТКД/Уфа-97   99,8   99,7    99,8   99,5   60,1
  ПУУ-ТКД/VERO   99,9   99,8   99,5   99,6   60
  К-27   99,9   99,7    99,7   99,1   60,5
  Р-360   99,7   99,8   99,9   92,3   60,2
  CG-1820   99,4   99,3   99,5   99,5   60,1
  76-118   59,3   58,1   58,4   59,3   59 

Таким образом, проведенная нами очистка хантавирусного штамма, адаптация его к перевиваемой культуре клеток VERO, использование данной культуры в качестве культуры-продуцента, аттестация посевного штамма в соответствии с требованиями регламентирующих документов позволили разработать технологию изготовления лабораторных серий инактивированной вакцины против ГЛПС на основе вируса Puumala.  

В результате изучения кинетики инактивации было показано, что в очищенном вируссодержащем субстрате, обработанном 0,05 % раствором формалина, инфекционная активность вирусов не определялась по истечении экспозиции в течение 30 мин.

При обработке  0,025 % и 0,0125% растворами формалина время инактивации вируса увеличивалось до 6  и 48 часов, соответственно (Рис. 3).

Как и в случае с выбором температурного режима, руководствуясь желанием избежать повреждений структуры белков и сохранения максимальной антигенной активности инактивированного продукта, было принято решение об использовании в дальнейшем 0,025 %  раствора формалина.

С учетом запаса надежности, предложенная схема инактивирования инфекционной активности  хантавируса включает экспозицию вируссодержащего субстрата при температуре 6±2°С в присутствии 0,025 %  раствора формалина в течение 30 суток.     

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Концентрирование вируса проводили методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке. На первом этапе очистки балластные компоненты удаляли с помощью осветляющей  фильтрации, используя фильтр Poly Pro XL (CUNO) с размерами пор и площади поверхности 0.6 мкм и 0,14 м2, соответственно.

Второй этап — гель-фильтрация с использованием Sepharose 6 FF и хроматографа AKTA purifier (GE Healthcare). Для оптимизации процессов, осуществляемых на каждом из этих этапов, были изучены и определены параметры взаимодействия вируса с разными пористыми сорбентами.

В результате проведенных исследований отобрана гельфильтрационная схема очистки вируса, приводящая к получению высокоактивных препаратов, удовлетворяющих требованиям к чистоте конечного продукта (Рисунки 4,5,6).

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Из инактивированной формалином, сконцентрированной и очищенной антигенсодержащей  культуральной жидкости после стерилизующей фильтрации через фильтр Миллипор с размером пор 0,22 мкм получали вакцинный препарат.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.                                                                                                                                                                                                       —  Следует отметить, что практически на всех этапах изготовления вакцины, начиная от получения производственного штамма вируса и кончая готовой формой вакцины, предусмотрены   физико-химические и молекулярно-биологические тесты, а также контроли на животных и в культуре клеток (Табл. 2). Эта система надёжно обеспечивает безопасность применения новой вакцины, высокий уровень и стабильность её иммунологической активности. Отсутствие туморогенности обеспечено за счет резкого снижения на стадии гельфильтрации содержания клеточной ДНК (менее, чем 10 нг в одной вакцинной дозе). Таким образом, вакцинный препарат представляет собой инактивированный вирус Puumala.

Читайте также:  Монотерапия эпилепсии. Политерапия эпилепсии. Побочные эффекты антиэпилептических препаратов.
 Таблица 2. Характеристика вакцинного препарата на технологических этапах       
  Стадии очистки   Объем (л)   Титр вируса   lg ФОЕ/мл ИФА   (N белок)   log2/ 0.05 мл   ИФА (Gn/Gc белок)   log2/ 0.05 мл
Сбор КЖ   25   5,8    1024      512
Фильтрация   25   5,6    512    256
 Концентрирование   0,35   7,3   8192   2048
 Гельфильтрация   0,7   6,9   4096   1024
  Инактивирование   0,7   0   4096   1024

На завершающей стадии приготовления вакцины ГЛПС определяли антигенную активность и рассчитывали рабочую дозу (РД) вакцинного препарата.

В соответствии с предварительно установленным соотношением зависимости между количеством содержащегося в вакцине специфического антигена и её иммуногенной активностью минимальная иммунизирующая доза (МИД), то есть максимальное разведение исходного препарата, обеспечивающее продукцию вируснейтрализующих антител у 50% животных, соответствовало 8 антигенным единицам (АЕ). Разведение исходного препарата, содержащего 4 МИД или 32 АЕ, принимают за 1 РД вакцины.        Специфическую активность инактиврованной вакцины характеризовали по иммуногенности на мышах Balb/c. то есть, по способности препарата индуцировать у животных продукцию специфических хантавирусных антител.     Для оценки иммуногенности готовую адсорбированную вакцину вводили не менее, чем 6 мышам линии Balb/c  9-10 недельного возраста, весом 18-20 г.  в объёме 0,5 мл  подкожно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом, используя для одной иммунизации I РД готовой вакцины. В качестве контрольных использовали мышей Balb/c, которым в те же сроки вводили адсорбент гидроокись алюминия.  Через 2 недели после последней инъекции у животных брали из орбитальной вены кровь и готовили из неё сыворотку. В полученных сыворотках крови определяли титр вируснейтрализующих антител к штамму ТКД/Уфа-97 хантавируса Puumala, используя  метод ФОЕ.

Все 3 лабораторные серии вакцины индуцировали анти-вирусные антитела у 100 процентов животных и в довольно высоких титрах (Табл. 3).

 Таблица 3. Результаты исследований на иммуногенность 3-х серий вакцины ГЛПС     
  Наименование препарата   Доза препарата мл  Отношение числа животных с сероконверсией к общему числу   САТ анти-ПУУ антител в сыворотке животных*
  Серия №1   0,5   6/6   125
  Серия №2   0,5   — “ —   80
  Серия №3   0,5   — “ —   75
  Плацебо   0,5   0/6

Биореактор для «Вектора» и разработки вакцин: оборудование, которое борется с коронавирусом

Та же Россия, долгое время остававшаяся
в стороне от эпидемии, на сегодня имеет
одного больного на две тысячи человек
населения. Для сравнения: в КНР болезнь
остановили еще тогда, когда ее выявили
лишь у одного китайца из 17 тысяч.
Получается, вне Восточной Азии просто
нет государственного аппарата достаточно
эффективного, чтобы обуздать новый
коронавирус действенным карантином.

А это значит, что тем, кому не повезло жить на остальной части суши, остается рассчитывать только и исключительно на вакцину. Если ее сделают к ближайшей осени – масштаб жертв и потерь для экономики будет одним, а если к следующей – принципиально иным.

Как именно ее делают? Какие есть пути к ее получению и какие из них актуально используются сейчас? Наконец, что за оборудование для этого необходимо и кто его делает? Чтобы узнать детали, мы поговорили с Ириной Волковой, кандидатом технических наук и генеральным директором ООО «Сарториус Стедим РУС», дочерней компанией немецкого концерна Sartorius.

Биореактор
для «живой» вакцины

Как
объясняет Ирина Волкова, процесс
производства классической вакцины
состоит из нескольких этапов, из которых
первый и основной – наработка возбудителя
или его белков, того самого материала,
на который вакцина «натаскивает» нашу
иммунную систему, чтобы та могла сражаться
с самой болезнью.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.SARS-COV-2 подозревают в способности к антителзависимому усилению, что делает создание живой вакцины от вызываемого этим вирусом заболевания довольно сложным / ©sartogosm.ru

«В
целом в современном мире существует
четыре основных подхода к созданию
вакцины», – рассказывает Волкова. Первый
– это классическая технология, когда
в лабораторных условиях массово
выращивают вирус – но ослабленный, или
затем, после выращивания, «убивают»
его.

Поскольку не все биологи согласны
классифицировать вирус как живой
организм, такой процесс называют
инактивацией. Для «натаскивания»
иммунной системы при этом подходе служит
либо сам вирус, либо его биологический
материал (если используют инактивированный
вирус).

В любом случае и тот, и другой варианты классического подхода основаны на массовом выращивании вируса в лабораторной клеточной культуре. И вот здесь все зависит от параметров биореактора, где идет выращивание. Именно он – основное звено в процессе промышленного биотехнологического синтеза. И звено достаточно сложное.

Дело в том, что хотя сам вирус, выращиваемый в культуре, и может выдержать энергичное перемешивание и аэрацию (без них быстрая наработка биомассы невозможна), но вот клетки животных куда более хрупки и чувствительны к механическим воздействиям.

Чтобы биореактор обеспечил оптимальные условия для роста культивируемых биообъектов, нужно, чтобы перемешивание жидкостей в нем шло «мягко», без образования пены, гидроударов, кавитации и других явлений, способных нарушить наработку биомассы.

Но
и это еще не все. Чрезвычайно важно,
чтобы результаты культивирования были
устойчивыми, всегда повторялись, чтобы
реально наблюдаемые параметры всегда
совпадали с теми, что обозначил
производитель. А это требует высокого
уровня контроля качества со стороны
последнего.

Именно
таким, первым подходом к изготовлению
вакцин занят, например, новосибирский
«Вектор». В прошлом году Sartorius поставил
ему биореактор, соответствующий
требованиям для массовой, быстрой и
экономичной наработки биомассы вирусов.

Ирина Волкова отмечает, что хотя Sartorius далеко не единственный поставщик на рынке подобного оборудования, «Вектор» выбрал именно его – как по соображениям высокого качества продукции немецкого производителя, так и благодаря наличию у его российского представительства активной технической и сервисной поддержки.

Волкова подчеркивает: «В отличии от других компаний, таких же поставщиков оборудования, у нас есть собственные технические специалисты в России, собственная сервисная служба, склад запасных частей и ходовые позиции оборудования на подмену. Это очень важно – ведь клиент покупает дорогостоящее оборудование для достаточно серьезного и критического процесса, и если что-то идет не так, очень важно, чтобы производитель быстро и оперативно решал любые возникающие вопросы».

Даже несмотря на то, что «Вектор» – закрытое учреждение, с корнями (советских времен) в военной сфере, технические специалисты ООО «Сарториус Стедим РУС» регулярно его консультируют. Правда, из-за карантина многие технические вопросы решаются онлайн, с помощью видеоконференций.

Но в 2019 году, когда туда был поставлен упомянутый биореактор, специалисты компании проводили пусконаладочные работы и нужное обучение сотрудников «Вектора» для получения наилучшего результата. Ирина Волкова особо отмечает: «Для нас очень важно, что часть работ по производству вакцины против коронавируса сделана на нашем оборудовании».

Второй этап получения «живой» вакцины – это очистка полученного в биореакторе продукта. Этот процесс включает в себя и фильтрацию, и концентрирование массы вируса. Здесь важен каждый этап и вот почему. Хотя выращивание вируса идет в клетках животных, в конце процесса клетки разрушаются, чтобы из них можно было извлечь вирусы.

Но при этом остатки клеток в вакцине не просто не нужны, но и вредны – они могут «отвлекать» иммунитет, стимулируя выработку антител не к вирусу, а именно к биоматериалам клеток, в которых его выращивали.

Именно поэтому качество фильтрации – один из ключевых параметров всего цикла производства вакцины.

Системы для фильтрации, производимые Sartorius, работают на разных принципах, от центрифужного осаждения до концентрации под давлением.

Альтернативные
пути к вакцине: плюсы и минусы

В
теории, на оборудовании Sartorius возможна
отработка и других типов вакцин. Например,
при втором подходе к их получению
выращивается не сам ослабленный
коронавирус, а его вирусный вектор,
которым заражают клетки.

В этом случае
определенные гены коронавирусы встраивают
в аденовирус, который, по сути, является
транспортным вирусом, доставляющим
гены коронавируса в клетку. Сам «Вектор»
не рассматривает такой подход, как
основной.

Дело в том, что его лаборатории
имеют настолько высокий уровень
биобезопасности, что для них нет ничего
страшного в работе с живым вирусом.

Читайте также:  Четвертая неделя панкреатита. Оценка тяжести панкреатита.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.Sartorius выпускает и оборудование для перекрестно-поточной ультрафильтрации и микрофильтрации, вроде представленной на фото установки SARTOFLOW®. Фильтрация — составная часть систем, с помощью которых получают вакцины / ©sartogosm.ru

Третий
подход к разработке вакцин – на матричной
РНК, вообще без участия живых клеток.
Однако на сегодня в России РНК-вакцины
– очень недавнее явление, большого
опыта работы с ними здесь никто не имеет,
да и в мире мест, где над ними работают,
всего несколько.

Четвертый
метод создания вакцины – рекомбинантный.
При нем генетический материал вируса
встраивают методами генной инженерии
в, например, дрожжевые клетки, и эти
клетки начинают производить антиген.

Наработав достаточную массу дрожжей,
из нее выделяют нужный антиген и после
фильтрации очищают и готовят на этой
основе вакцину.

Здесь, в принципе также
участвуют те же биореакторы и фильтрующее
и концентрирующее оборудование, широкую
линейку которого производит Sartorius.

Но
у этого подхода есть и потенциальные
преимущества над традиционными живыми
вакцинами. Все дело в феномене
антител-зависимого усиления.

У некоторых
вирусов – и у коронавируса атипичной
пневмонии, «предка» нового коронавируса
– есть неприятная особенность: часто
переболев одним подтипом нового вируса,
человек может остаться повышенно
уязвимым к повторному заражению чуть
иным подтипом.

В этом случае живая
вакцина может даже снизить шансы
вакцинированного на успешное противостояние
возбудителю.

А
вот если вакцина была получена
рекомбинантным методом, то иммунная
система получает с прививкой только
нужный антиген и не получает взаимодействия
с самим вирусом. В этом случае
антител-зависимое усиление не срабатывает.
Из-за этого нельзя исключить, что именно
рекомбинантная вакцина окажется самым
эффективным вариантом в борьбе с новой
болезнью.

На сегодня пока трудно определенно сказать, какой именно путь окажется наиболее перспективным. Среди российский клиентов Sartorius (часть из них не хотят себя называть, чтобы не афишировать ведущиеся ими работы над вакциной) есть сторонники разных подходов к созданию вируса.

В публичном поле новых вакцин от коронавируса, создаваемых в нашей стране, числится девять вариантов.

Среди них шесть – в работе у «Вектора», из которых одна рекомбинантная, одна векторная и одна на основе матричной РНК. Еще две создает компания БИОКАД, из них одна «живая».

Еще один вариант разрабатывает «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток» – и это вакцина на основе белков нового коронавируса.

Автоматизировать борьбу с вирусом

Для того, чтобы оптимальным образом выращивать вирус, надо сперва разобраться, в каких условиях он лучше всего себя чувствует. Для этого надо подобрать такую клеточную линию-хозяина, в которой коронавирусу будет проще всего размножаться. Последовательно подбирать оптимальные культуры было бы слишком долго, поэтому существуют наборы оборудования типа ambr® 15.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.ambr® 15, биореактор, с возможностью культивирования выращиваемых патогенов с подпиткой, позволяющий работать с плотными культурами / ©sartogosm.ru

Это высокопроизводительный автоматизированный биореактор, в котором можно проводить параллельное культивирование не одной, а сразу множества клеточных культур – ведь в нем до 48 сосудов объемом 10–15 миллилитров.

Такая линия может за один раз запустить сразу 48 процессов культивации – а затем ученые в режиме онлайн отслеживают параметры развития клеток, где выращивают вирус, и определяют наиболее успешные клеточные линии, с которыми и будут работать далее.

Волкова так поясняет важность внедрений новых автоматизированных систем работы с вирусом: «Чем меньше какого-то ручного труда, тем лучше.

Во-первых, результаты работы автоматизированными системами проще отслеживать, они более устойчиво воспроизводятся, легче масштабируются.

При большой доле ручного труда в первичной, базовой работе с вирусами, выше риск контаминации, загрязнения изучаемого образца неловким движением лаборанта».

По словам Ирины Волковой, у компании есть и ряд других систем, потенциально полезных для работы с новым вирусом, но пока не все они поставлялись в Россию. Например, Sartorius делает высокоэффективный счетчик вирусов. Речь идет о совсем новой разработке, которая автоматизировано без участия человека определяет число вирусов в той или иной среде.

На данный момент счетчик еще не используется для подсчета единиц нового коронавируса, потому что адаптация под новые виды требует времени. Для работы счетчик использует лазер, подсвечивающий поток образцов.

Чтобы лазер мог выявить именно целевой вирус, нужно, чтобы был краситель, связывающийся именно с ним, но не связывающийся с другими вирусами. «К сожалению, пока разработаны красители не для всех вирусов, и для коронавируса их еще нет.

Над этим мы пока только работаем».

Другая важная компонента в борьбе против нового вируса – программное обеспечение, используемое в вирусологических лабораториях.

Sartorius поставляет и такое ПО, которое позволяет моделировать многие процессы выращивания вирусов – не производя их физически, в лаборатории.

За счет моделирования будущих процессов можно подобрать оптимальные параметры для реальных лабораторных исследований, значительно сэкономив драгоценное время работы на реальном оборудовании.

Но и после окончания исследовательского процесса, уже при производстве живых вакцин в биореакторах, важность ПО не снижается.

«У нас есть программное обеспечение, которое позволяет контролировать критические точки на биотехнологическом производстве. В режиме реального времени оно способно сообщать оператору или технологу о том, что где-то что-то в технологическом процесс идет не так.

Представьте себе крупное биотехнологическое производство, которое состоит из огромного количества разных этапов, и сбой на каждом из этих этапов может быть критическим, – продолжает Волкова. – И вот мы в программе пишем: вот этот этап критический, его нужно отслеживать, чтобы он соответствовал таким-то параметры.

Чтобы, например, pH среды не ушел из области нужных значений, не сорвал наработку, или чтобы температура не вышла в недопустимый диапазон, или требующийся белок куда-то не делся».

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.BIOSTAT® B, универсальный контроллер, следящий за параметрами культивации микроорганизмов и позволяющий исследователям в режиме реального времени контролировать процесс / ©Sartotius

Если где-то что-то выходит за рамки указанных параметров, система дает сигнал еще до того, как критический этап полностью выйдет из-под контроля. Тогда оператор удаленно вмешается и не допустит дальнейшего падения параметров подсистемы.

В ходе текущего коронавирусного кризиса Sartorius действует также, как и в периоды вспышки вируса Эболы или Зика: консультирует и снабжает своих клиентов оборудованием, позволяющим успешно разрабатывать и производить вакцины.

Для этих целей создан специальный раздел с подробной информацией по решениям для борьбы с COVID -19.

Но сами по себе центрифуги, дозаторы, фильтры, высокопроизводительные биореакторы и многое другое – это еще далеко не все, что нужно для победы вакцинации над новым коронавирусом.

Для этих целей создан специальный раздел с подробной информацией по решениям для борьбы с COVID -19.

Чтобы действительно добиться успеха, лаборатории по всему миру — в том числе, и в России – должны будут еще и успеть в кратчайшие сроки провести испытания уже наработанных вакцин.

Не все из упомянутых выше девяти вариантов смогут сделать это в сжатые сроки.

Хотя вакцинная гонка уже началась, ее окончание займет еще долгие месяцы – и чем меньше их будет, тем меньше будет удар пандемии по здоровью людей и мировой экономике.

Ученый из МФТИ раскрыл процесс создания вакцины от коронавируса | РБК Тренды

1

Об эксперте: Павел Волчков — кандидат биологических наук, вирусолог, генетик, заведующий Лабораторией геномной инженерии Московского физико-технического института (МФТИ).

Существует много разных подходов к созданию вакцины от COVID-19. Она может быть вирусной, инактивированной, векторной, на основе нуклеиновых кислот. Какая из них окажется самой эффективной — пока никто точно не знает.

Если вы разработчик, то можете выбрать любую и принять участие в большой мировой гонке по созданию долгожданной прививки.

А можете, как ученые из МФТИ, сознательно отказаться от возможных бенефитов и неспешно заняться разработкой экспериментальной вакцины нового типа.

Одни из самых популярных на сегодняшний день — это рекомбинантные или векторные вакцины. Они изготавливаются на основе вирусов-носителей или вирусных векторов.

Как это работает? Вы берете какие-то вирусные частицы, «вычищаете» из них все патогенные составляющие и на их место вставляете нужные вам элементы — генетический материал вируса, против которого изготавливается вакцина. По такому принципу была создана прививка от вирусного гепатита B или ротавирусной инфекции.

И по такому же принципу сегодня многие разработчики создают вакцину от COVID-19. В частности, в России векторную вакцину от коронавируса разработали в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.

Павел Волчков:

«Чем хорош вирусный вектор? Он способен инфицировать клетки только один раз и не может размножаться в организме человека дальше. Такая особенность делает рекомбинантные вакцины довольно безопасными.

При этом в качестве вирусного вектора можно использовать буквально любой вирус из библиотеки человеческих патогенов. Выбор зависит от того, для какого заболевания вы изготавливаете вакцину.

Потому что одни вирусы лучше заражают мышцы, другие — легкие, третьи — центральную нервную систему. Например, та же вакцина Центра Гамалеи выполнена на аденовирусном векторе».

Аденовирусы — ДНК-вирусы. Относятся к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и характеризуются поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, конъюнктив, лимфоидной ткани.

Читайте также:  Связь клетчатки подключичной области с соседними областями. Отверстия подключичной области. Сообщения подключичной области.

Большинство аденовирусных инфекций представляют собой легкую форму инфицирования. Существует семь видов аденовирусов человека (от А до G) и 57 серотипов.

Подразделение на серотипы связано с различными способами заражения.

Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

Аденовирус под микроскопом ( Wellcome Images)

В качестве векторов для вакцин, аденовирусы применяются довольно давно. Эти вирусы хорошо изучены. Согласно данным сайта ClinicalTrials.gov, клинические испытания на людях успешно прошли или проходят более сотни различных вакцин на основе аденовирусных векторов.

Среди главных преимуществ этих вирусов — их естественный механизм взаимодействия с клетками человека. Они способны обеспечивать довольно длительную экспрессию антигена, а это успешно активирует врожденный иммунный ответ.

Антигены — это любые вещества, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках (или выделяемые ими), которые несут в себе признаки генетически чужеродной информации, и которые потенциально могут быть распознаны иммунной системой организма.

Павел Волчков:

«При всех плюсах, у аденовирусов есть и ряд минусов. Первое — они обладают провоспалительным эффектом. То есть могут чрезмерно драйвить иммунную систему. Проще говоря — вызывать сильный иммунный ответ. Это один из возможных побочных эффектов вообще всех аденовирусных вакцин. Но есть еще один нюанс.

Большинство аденовирусов — это естественные патогены человека. Многие из нас сталкивались в течение жизни с аденовирусными инфекциями. А что это значит? Что в крови у таких людей уже есть нейтрализирующие антитела к этому вирусу. Они могут связываться с компонентами вакцины и блокировать ее действие.

Поэтому для некоторых из нас такая вакцина будет совершенно неэффективна».

Тема 7. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

Начало применения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) для выращивания вирусов приходится на 1928 — 35 гг.

Этот период австралийский ученый Бернет назвал «первой золотой эпохой» развития вирусологии, поскольку она открыла возможность культивирования вирусов на довольно удобной живой лабораторной модели, как правило, интактной в отношении многих возбудителей инфекционных болезней. По сути, это был первый биотехнологический процесс накопления вирусов, пригодный для промышленного и массового производства противовирусных вакцин.

РКЭ являются универсальным и простым для манипуляций объектом.

Это обусловлено тем, что куриный эмбрион содержит четыре различных естественных питательных субстрата для накопления вирусов: амниониотическую и аллантоисную жидкость, хорионаллантоисную оболочку (ХАО) и желточный мешок, клетки которых, как клетки самого эмбриона, являются высокочувствительными к различным вирусам.

Вследствие этого куриные эмбрионы пригодны для выделения вирусов из патологического материала, получения антигенов, определения титров инфекционности вирусов, постановки реакции нейтрализации и так далее. В силу высокой производительности РКЭ используют для получения вакцин против ряда болезней животных и человека.

Для получения РКЭ используют яйца от белых леггорнов, имеющие тонкую скорлупу. Они должны быть снесены не позднее десяти суток назад. В противном случае развитие зародыша, несмотря на оплодотворение, сильно задерживается. Яйца должны быть чистыми, но не мытыми.

Инкубацию проводят в обычных инкубаторах с автоматическим приспособлением для переворачивания яиц, вентилятором, термометром и гигрометром, при температуре 37,2 — 37,8 °С и влажности 60 -70%.

Возраст РКЭ, используемых для работы, зависит от вида вируса, которым будут заражать куриные эмбрионы.

Однако независимо от этого яйца нужно овоскопировать на 3-4 сут инкубации, для того чтобы удалить неоплодотворенные (болтуны) и яйца с погибшими эмбрионами.

Дальнейшее развитие эмбрионов проводят с соблюдением вышеуказанных условий. Обычно развивающиеся куриные эмбрионы заражают в возрасте 7-12 сут.

Работу по заражению РКЭ проводят в стерильном боксе, где имеются рабочие столы, стулья, куда подведены вода, газ, вакуум. Перед началом работы стол дезинфицируют. Заранее готовят необходимые инструменты, дезинфицирующий раствор, йодированный спирт, пробойник для вскрытия скорлупы.

Заражение эмбрионов проводят с помощью стерильных специальных шприцов и игл. Здесь должен быть расплавленный парафин для заливки отверстий в скорлупе после заражения. Кроме того, необходима емкость с дезинфицирующей жидкостью для использованного инструмента.

В боксе должна иметься специальная подставка для яиц. Вне зависимости от патогенности используемых вирусов работа производится в масках, защитных очках, резиновых перчатках или в специальных костюмах для стерильных помещений.

Подготовленный таким образом бокс облучают в течение 1 — 2 ч до начала работы УФ — светом.

В настоящее время согласно международным требованиям (GMP) работу вируссодержащим материалом проводят в ламинарных боксах, обеспеченных избыточным поддувом стерильного воздуха, прошедшего через мембранные фильтры.

Перед заражением РКЭ просвечивают с целью определения жизнеспособности эмбриона и удаляют погибшие эмбрионы. При необходимости делают разметку места заражения эмбрионов.

Заражение РКЭ проводят заранее подготовленным вирусом в определенном титре. Чтобы иметь стерильную (свободную от бактерий) суспензию вируса к инокулируемому вирусному материалу добавляют по 100 -1000 мг стрептомицина и 100 — 1000 ЕД пенициллина.

Заражение в аллантоисную полость осуществляют на 10-11-суточными куриных эмбрионах. При этом яйцо фиксируют тупым концом вверх, отметив предварительно границу воздушной камеры (пути) и расположение эмбриона.

В области воздушной камеры скорлупу дезинфицируют иодированным спиртом и прожигают. Потом прокалывают ее зондом и в образовавшееся отверстие вносят 0,1 — 0,2 мл инокулированной жидкости с оттитрованным вирусом. При этом инъекционную иглу вводят на 1 — 2 мм ниже границы пуги.

После заражения эмбриона отверстие в скорлупе заливают парафином и яйцо помещают в инкубатор.

Заражение в амнион проводят на 8 — 9-суточных эмбрионах. Иглу от шприца вводят через отверстие в скорлупе со стороны пуги (под контролем осветительной лампы) до места предлежания эмбриона, отмеченное ранее крестиком.

Перед введением вируса в амнион иглу необходимо поджигать. Если эмбрион повторяет движения иглы, то, следовательно, игла попала в амнион. Доза заражения в амнион также составляет 0,1-0,2 мл вирусной суспензии.

После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

Заражение на ХАО осуществляют на 10 — 12-суточных эмбрионах. Этот способ требует особой осторожности, так как не допускаются травмирования как самой ХАО, так и подскорлуповой пленки.

Отверстие в скорлупе делают в том месте, где нет кровеносных сосудов (под контролем лампы) и с помощью шприца и иглы вводят 0,1-0,2 мл вирусной суспензии. Если возникло кровотечение, то яйцо выбраковывают.

Отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

Заражение в желточный мешок проводят на 5 — 7-суточных эмбрионах. Иглу вводят до упора в скорлупу. Отверстие в скорлупе заливают парафином и продолжают инкубировать.

После заражения ежедневно эмбрионы контролируют на патогенное действие вируса. Для этого их подвергают овоскопии. Яйца с погибшими эмбрионами выбраковывают, а для получения вируса без эритроцитов, на которых он может адсорбироваться, эмбрионы умершвляют путем выдержки яйца в течение 10 — 12 ч при 4 °С.

Следует заметить, что при производстве противовирусных вакцин методы заражения куриных эмбрионов в амнион и желточный мешок применяют редко из-за их трудоемкости и недостаточной производительности.

В промышленных условиях на биопредприятиях при объемном производстве антигенов и противовирусных вакцин наиболее часто применяют метод заражения куриных эмбрионов в аллантоисную полость на ХАО. Поэтому мы наиболее подробно изложим технологию получения вирусного материала из РКЭ, зараженных в аллантоисную полость.

Перед получением вируса скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют и отделяют ее ножницами или пинцетом. Нижнюю пленку подскорлуповой оболочки, формирующую пугу, и хорионаллантоисную оболочку прокалывают и отсасывают пипеткой или с помощью специального аппарата аллантоисную жидкость.

Из одного эмбриона, в зависимости от его возраста, можно собрать до 8 -10 см аллантоисной жидкости. Аллантоисную жидкость можно получить без эритроцитов, подвергнув ее центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 -30 мин.

После получения аллантоисной жидкости ее проверяют на стерильность путем высевов на питательные среды, а также на содержание вируса и его количества путем титрования в какой-либо иммунологической реакции (например, в реакции гемагглютинации).

Способ культивирования вирусов в аллантоисной полости куриных эмбрионов в биопромышленности используют при получении антигенов для диагностики гриппозных инфекций у людей, лошадей, птиц, а также для получения живых и инактивированных вакцин против гриппа у людей, животных и птиц, болезни Ньюкасла птиц из штамма «Н», инфекционного ларинготрахеита птиц и др.

В ряде случаев живые вакцины готовят из вирусов, выращенных на ХАО куриных эмбрионов (например, сухая эмбрион-вакцина из голубиного вируса против оспы птиц). Для получения вирусного материала в таком случае яйцо разрезают вдоль до конца воздушной камеры.

Эмбрион, желточный мешок и белок удаляют, а хорионаллантоисную оболочку собирают пинцетом, переносят в сосуд для промывания в растворе Хенкса.

При просмотре ХАО на темном фоне можно хорошо видеть множество очагов некроза, число которых указывает на степень размножения вирусов

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector