Источник ферментов в биотехнологии. Почему нужно выделять ферменты? Изготовление фруктовых соков.

Ферменты, или энзимы — это белковые катализаторы, ускоряющие реакции в клетке. Ферменты катализируют 2000-3000 реакций обмена, вовлечены в передачу сигнала, процесс дыхания, мышечное сокращение, свертываемость крови, транспорт веществ, обезвреживание токсичных и чужеродных соединений, нейротрансмиссию. Ферменты имеют белковую природу, однако обнаружена способность некоторых молекул РНК осуществлять автокатализ. Такие РНК получили название «рибозимы».

  • Ферменты катализируют превращение веществ, которые называются субстратами (S), в продукты (Р). В общем виде ферментативную реакциюможно записать так:
  • Как и другие химические катализаторы, ферменты:
  • увеличивают скорость реакции, но не расходуются в ходе процесса и не претерпевают необратимых изменений;
  • не изменяют состояние равновесия химической реакции, ускоряя как прямую, так и обратную реакцию в равной степени;
  • повышают скорость реакции, понижая энергию активации, тот энергетический барьер, который отделяет одно состояние системы от другого.
  • Ферменты отличаются от небиологических катализаторов следующими свойствами:
  • высокой эффективностью действия — скорость ферментативных реакций обычно в 106-1012 раз выше, чем соответствующих неферментативных реакций;

высокой специфичностью действия — способностью выбирать определенный субстрат и катализировать специфическую реакцию. Для ферментов характерна как высокая субстратная специфичность, так и специфичность пути превращения. Благодаря действию ферментов реакции в клетке не беспорядочны, не перепутываются, а образуют строго определенные метаболические пути; мягкими условиями протекания ферментативных реакций: температура 37°С, нормальное атмосферное давление, рН, близкое к нейтральному. В противоположность этому для эффективного химического катализа часто требуются высокие температура и давление, а также экстремальные значения рН; Хотя на данный момент найдены ферменты способные работать при более жёстких условиях: от 20 до 70°С и рН в диапазоне от 4 до 9. способностью к регуляции. Каталитическая активность многих ферментов может изменяться в зависимости от концентрации веществ-регуляторов больше, чем в зависимости от концентрации их субстратов. Возможность регулирования активности ферментов делает их своеобразными организаторами обменных процессов в клетке. Активный центр — это относительно небольшой участок, расположенный в узком гидрофобном углублении (щели) поверхности молекулы фермента, непосредственно участвующий в катализе. Активные центры ферментов образуются на уровне третичной структуры. Активный центр, кроме каталитического участка, включает субстратсвязывающий участок, который отвечает за специфическое комплементарное связывание субстрата и образование фермент-субстратного комплекса; в активный центр фермента часто входит участок или домен для связывания кофактора. Каталитически активный комплекс фермент-кофактор называется холоферментом. Отделение кофакторов, обычно связанных нековалентными связями с белком, приводит к образованию неактивного апофермента: Апофермент (неактивный)+кофактор > холофермент. Ферменты катализируют реакции, используя в качестве кофакторов как ионы металлов, так и органические соединения, многие из которых являются производными витаминов. Коферменты — это органические вещества, предшественниками которых являются витамины. Некоторые из них (например, NAD, HSKoA, Н4-фо-лат) непрочно связаны с белком, и восстановление их исходной структуры (регенерация) после участия в катализе может катализироваться уже другим ферментом. Есть коферменты, которые прочно (часто кова-лентно) связаны с апоферментом, т.е. представляют собой простетическую группу сложного белка (холофермента). Например, гем и флавиновые коферменты. Принятая в настоящее время классификация ферментов использует в качестве основного отличительного признака их субстратную специфичность, характер проводимых ими реакций.

Класс Реакции Основные поклассы, группы
Оксидоредуктазы Окислительно-восстановительные реакции Авосст + Вокис > Аокис + Восст Дегидрогеназы, оксидазы, редуктазы, гидроксилазы
Трансферазы Перенос групп А-В + С > А + В-С Киназы (фосфатные фуппы), трансаминазы (аминофуппы)
Гидролазы Гидролиз связей (эфирных, пептидных, гликозидных, связей С-С, P-N) А-В + Н20 > А-Н + В-ОН Эстеразы, фосфатазы, протеазы, липазы, нуклеазы, тиолазы
Лиазы Разрыв связей С-С, С-О, C-N, C-S путем элиминирования молекулы с образованием двойных связей. В обратной реакции ускоряют присоединение воды, аммиака и т.д. по двойной связи А(ХН) — В > А-Х+В-Н Альдегидлиазы (альдолаза), угперод-киспородлиазы (фумараза), дегидратазы (енопаза), декарбоксипазы
Изомеразы Взаимопревращение изомеров А — Изо-А Изомеразы, мутазы
Лигазы Соединение 2 молекул, сопряженное с гидролизом АТР: A + B + ATP > A-B + ADP + Pi Карбоксилазы, синтетазы

Все ферменты имеют окончание «аза», прибавленное к названию субстрата или прибавленное к фразе описывающей действие фермента.

Источники получения ферментных препаратов. Ферменты присущи всем живым объектам и находятся практически во всех растениях, животных и микроорганизмах.

Однако процесс биосинтеза ферментов в организме связан с обеспечением метаболизма клеток, и количество синтезируемых ферментов строго определяется жизненной потребностью организма; такие объекты не могут служить источником получения ферментных препаратов.

Для этого пригодны только некоторые растительные организмы или отдельные органы растений и животных, способные накапливать значительное количество ферментов.

Растительное сырье. Источником ферментов может быть пророщенное зерно различных злаков (солод). В тропических и субтропических странах в качестве сырья для промышленного производства протеиназ используют латекс дынного дерева, латекс растений, относящихся к виду фикусовых, например листья, побеги инжира, сок зеленой массы ананаса.

Органы и ткани животных. На всех мясоперерабатывающих комбинатах собирают сырье, содержащее ферменты, консервируют его и используют для получения ферментных препаратов. Таким сырьем являются поджелудочная железа, слизистые оболочки желудков и тонких кишок свиней, сычуги крупного рогатого скота, сычужки молочных телят и ягнят, семенники половозрелых животных.

Поджелудочная железа содержит большое количество разнообразных ферментов: химотрипсин, коллагеназу, эластазу, трипсин, амилазу, липазу и др. Слизистая оболочка желудков свиней и сычугов крупного рогатого скота служит источником пепсина и липазы. Из сычужков молочных телят и ягнят получают реннин (сычужный фермент).

Семенники половозрелого скота содержат фермент гиалуронидазу.

Микроорганизмы. В специально созданных условиях микроорганизмы способны синтезировать огромное количество разнообразных ферментов. Они неприхотливы к составу питательной среды, легко переключаются с синтеза одного фермента на другой и имеют сравнительно короткий цикл роста (16-100 ч).

Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных объектов, так и мутантные штаммы. Продуцентами ферментов могут быть различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты.

Микроорганизмы могут синтезировать одновременно целый комплекс ферментов, но есть и такие, особенно среди мутантных штаммов, которые являются моноферментными и образуют в больших количествах только один фермент.

Из исходных материалов ферменты экстрагируют солевыми растворами. Затем их разделяют на фракции, осаждая солями [обычно (NH4)2SO4] или, реже, органическими растворителями, и очищают методами гель-проникающей и ионо-обменной хроматографии. На заключительных этапах очистки часто используют методы аффинной хроматографии.

Контроль за ходом очистки фермента и характеристику чистых препаратов осуществляют, измеряя каталитическую активность фермента с применением специфических (обычно дающих цветные р-ции) субстратов. За единицу количествава фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин. в стандартных условиях.

Число единиц фермента, отнесенное к 1 мг белка, называют удельной активностью.

Применение ферментов. В неочищенном состоянии ферменты с древнейших времен используют для получения продуктов питания и выделки изделий в хлебопечении, сыроделии, виноделии, обработке кож и т.д.

Достаточно очищенные ферменты применяют в производствеве аминокислот и их смесей для искусственного питания, в производстве сахарных сиропов из углеводсо-держащего сырья, для удаления лактозы из молока и в производстве ряда лекарственных средств (некоторые очищенные ферменты сами используются как лекарственные средства).

Особенно перспективно применение в промышленности иммобилизованных ферментов на полимерных носителях (например, для получения полусинтетических пенициллинов применяют иммобилизованную пенициллинамидазу). Ферменты также активно используют в химическом анализе.

Применение ферментов в пищевой промышленности можно свести в следующую таблицу:

Отрасль Этапы технологически» процессов и технологические цели применения ферментов
Технология переработки зерна Повышение выхода муки и круп, улучшение качества клейковины, производство модифицированной муки зернобобовых
Хлебопечение Сокращение расхода муки, улучшение теста, замедление черстеения изделий, улучшение цвета корочки, производство охлажденного и замороженного теста
Пивоварение Использование неосоложенного сырья, разжижение, усиление ферментируемое™, улучшение фильтрации, контроль содержания ззота, получение низкокалорийного пива, стабилизация пива
Технология молочных продуктов Коагуляция молока, замена сычужного фермента в производстве сыра, модификация молочного белка, создание сырного аромата, получение ферментативно модифицированных сыров, удаление перекиси водорода, получение молочного сахара
Производство вина, фруктовых соков, газированных напитков, консервов Осветление, мацерация сырья, удаление крахмала из сока, увеличение выхода, получение сладких ликеров, стабилизация вин и соков, производство соков с мякотью и пюре
Переработка крахмала Увеличение выхода, модификация крахмала, разжижение, осахаривание, получение глюкозо-фруктовых и зерновых сиропов
Спиртовая промышленность Конверсия сырья, разжижение крахмала, осахаривание, улучшение роста дрожжей, увеличение выхода спирта
Производство кофе Сепарация зерен, контроль вязкости зкетрактов, улучшение вкуса и аромата
Производство белков Гидролиз белков и полисахаридов, снижение вязкости, производство модифицированных пептидов и белков
Производство сахара Удаление крахмала, белков и полисахаридов
Производство ароматизаторов Синтез тонких ароматов, получение натуральных ароматических эфиров и т.д.
Производство масел и жиров Увеличение выхода, модификация жиров, экстракция масла, получение биологически активных веществ (лецитина, токоферолов, каротинов и др.)
Технология мясопродуктов Увеличение выхода, тендеризация мыса, получение мясных экстрактов, текстуризация белков, продление сроков хранения
Производство растительных экстрактов Увеличение экстрактивности, сокращение длительности экстракции, улучшение фильтрации, повышение выхода пигментов, производство чая и чайных экстрактов, сокращение времени экстракции, усиление аромата и цвета
Производство пектина Упрощение технологии, увеличение выхода, регулирование степени этерификации
  1. Продолжается поиск новых возможностей использования ферментов в пищевой промышленности. Основными направлениями исследования являются:
  2. модификация свойств индивидуальных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов;
  3. скрининг новых микроорганизмов-продуцентов ферментов;
  4. получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами;
  5. применение ферментативных реакций для получения ценных пищевых ингредиентов и биологически активных веществ;
  6. разработка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов.
  7. Современные методы модификации ферментов позволяют увеличивать стойкость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН, температурному воздействию; изменять рН оптимума ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов.
Читайте также:  Этиология, распространенность и клиника метатипического рака кожи.

  Источник ферментов в биотехнологии. Почему нужно выделять ферменты? Изготовление фруктовых соков.

Ферменты в пищевых технологиях

Человечество использует ферменты для приготовления продуктов питания с незапамятных времен. Эмпирическим путем люди выяснили, что существуют природные субстраты, которые при внесении их в тот или иной вид сырья вызывают в нем желательные изменения.

Такими субстратами были соки растений и ткани животных, содержащие ферменты, а также виноградный сок, молоко, тесто, самопроизвольно сбродившие в результате попадания в них микроорганизмов. Например, для получения сыра использовали соки растений, содержащие фермент фицин, или ткани желудка птиц и животных, содержащие фермент ренин.

Для тендеризации мяса (размягчения мышечной ткани) использовали сок папайи, содержащий фермент папайи. В пищевых технологиях используют в основном ферменты, присутствующие в пищевом сырье, которые поступают в организм человека при потреблении свежих фруктов и овощей, орехов, молока, сброженных и консервированных продуктов.

В пищевых продуктах ферментов содержится мало — миллиграммы на килограмм продукта. При кулинарной и технологической обработке пищевых продуктов ферменты, как правило, инактивируются. Продолжается поиск новых возможностей использования ферментов в пищевой промышленности.

Основными направлениями исследования являются: • модификация свойств индивидуальных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов; • скрининг новых микроорганизмов-продуцентов ферментов; • получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами; • применение ферментативных реакций для получения ценных пищевых ингредиентов и биологически активных веществ; • разработка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов. Современные методы модификации ферментов позволяют увеличивать стойкость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН, температурному воздействию; изменять рН оптимума ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов. Химическая модификация — наиболее известный вид модификации ферментов . Ее методы должны отвечать следующим требованиям: • используемые химические реагенты должны быть безвредными (особенно в случаях дальнейшего использования ферментов в пищевых технологиях); • условия модификации не должны быть жесткими, приводящими к ухудшению свойств ферментов; модифицированные ферменты должны отделяться от реакционной среды относительно простыми и недорогими способами;

• применение модифицированных ферментов должно быть экономически выгодным.

Отрасль Этапы технологически» процессов и технологические цели применения ферментов
Технология переработки зерна Повышение выхода муки и круп, улучшение качества клейковины, производство модифицированной муки зернобобовых
Хлебопечение Сокращение расхода муки, улучшение теста, замедление черствения изделий, улучшение цвета корочки, производство охлажденного и замороженного теста
Пивоварение Использование неосоложенного сырья, разжижение, усиление ферментируемое™, улучшение фильтрации, контроль содержания ззота, получение низкокалорийного пива, стабилизация пива
Технология молочных продуктов Коагуляция молока, замена сычужного фермента в производстве сыра, модификация молочного белка, создание сырного аромата, получение ферментативно модифицированных сыров, удаление перекиси водорода, получение молочного сахара
Производство вина, фруктовых соков, газированных напитков, консервов Осветление, мацерация сырья, удаление крахмала из сока, увеличение выхода, получение сладких ликеров, стабилизация вин и соков, производство соков с мякотью и пюре
Переработка крахмала Увеличение выхода, модификация крахмала, разжижение, осахаривание, получение глюкозо-фруктовых и зерновых сиропов
Спиртовая промышленность Конверсия сырья, разжижение крахмала, осахаривание, улучшение роста дрожжей, увеличение выхода спирта
Производство кофе Сепарация зерен, контроль вязкости зкетрактов, улучшение вкуса и аромата
Производство белков Гидролиз белков и полисахаридов, снижение вязкости, производство модифицированных пептидов и белков
Производство сахара Удаление крахмала, белков и полисахаридов
Производство ароматизаторов Синтез тонких ароматов, получение натуральных ароматических эфиров и т. д.
Производство масел и жиров Увеличение выхода, модификация жиров, экстракция масла, получение биологически активных веществ (лецитина, токоферолов, каротинов и др.)
Технология мясопродуктов Увеличение выхода, тендеризация мыса, получение мясных экстрактов, текстуризация белков, продление сроков хранения
Производство растительных экстрактов Увеличение экстрактивности, сокращение длительности экстракции, улучшение фильтрации, повышение выхода пигментов, производство чая и чайных экстрактов, сокращение времени экстракции, усиление аромата и цвета
Производство пектина Упрощение технологии, увеличение выхода, регулирование степени этерификации

Примером химической модификации служит модификация ферментов в условиях неполярной (не водной) среды.

Происходящее при этом снижение активности воды в реакционной системе существенно изменяет свойства ферментов: реакция сдвигается в сторону синтеза; образуются оптически активные продукты; повышается термостабильность фермента и стабильность при хранении; фермент приобретает способность катализировать новые реакции, не протекающие в водной среде (синтез пептидов, алифатических амидов и др.); ферменты проявляют активность в органических растворителях при температуре выше 100 °С. Данный способ химической модификации использован при модификации таких ферментов, как липазы, химотрипсин , трипсин, субтилизин , термолизин , полифенолоксидазы , глюкоамилазы , папаин , химозин . С помощью физико-химических методов модификации изменяют силы электростатического взаимодействия, водородные связи и гидрофобные взаимодействия в молекулах белков.

Источник ферментов в биотехнологии. Почему нужно выделять ферменты? Изготовление фруктовых соков.

Например, широко используемый для изомеризации глюкозы в фруктозу фермент ксилозоизомераза модифицируется в направлении увеличения его термостабильности, снижения значения рН оптимума, изменения предпочтения активирующего катиона металла, изменения субстратной специфичности от ксилозы к глюкозе. К активно развивающимся областям энзимологии относится разработка биологических методов модификации ферментов. Особенно многообещающим является направление, получившее название «белковая инженерия». Методы белковой инженерии, основанные на знании зависимости между аминокислотной последовательностью, трехмерной структурой и каталитической активностью ферментов, позволяют успешно модифицировать ферменты для улучшения их технологических свойств. Широко используется способ замены определенных аминокислот в структурах .молекул ферментов.

Показано, что замена в молекуле фосфолипазы А2 Asn89 на Asp и Glu92 на Lys вблизи N-терминального конца спирали 5 увеличивает ккал/моль , а замена Asp56 на Ser, Ser60 на Gly и Asn67 на Туr значительно увеличивает активность и средство фосфолипазы А2 к фосфолипидным мицеллам .

Путем замены аминокислот в структурах молекул ферментов изменяют также их субстратную специфичность .

Изменение соотношения активности к растворимому и нерастворимому субстратам у целлобиогидролаз достигается путем замены внешних остатков ароматических аминокислот, которые захватывают конец молекулы полисахарида и направляют ее внутрь активного центра.

Увеличение стабильности ферментов к температуре и экстремальным значениям рН достигается путем таких замен среди сближенных в его третичной структуре аминокислотных остатков, которые приводят к образованию дополнительных нековалентных гидрофобных связей, солевых мостиков или ковалентных S-S-связей, повышающих общую стабильность глобулы молекулы фермента. Во многих случаях замены осуществляются на основе сопоставления совершенствуемых структyp с соответствующими структурами аналогов из экстремофильных родственных организмов (термо-, ацидо- и алкалофильных).

Рекомбинатный фермент Организм — продуцент Область применения
α-ацетолактатдекарбоксилаза Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Производство напитков
Аминогелтидаэа Trichoderma reese Trichoderma lonqibrachiatum Производство молочных продуктов
α -Амилаза Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Производство напитков, хлебопечение
Арабинофуранозидаза Aspergillu niger Производство напитков
Каталаза Aspergillu niger Производство продуктов, содержащих куриные яйца
Химозин Aspergillu niger Производство сыров
Циклодекстрингликозил трансфераза Bacillus licheniformis Переработка крахмала
α -Глюканаза Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Производство напитков
Глюкоамилаза Aspergillu niger Производство напитков, хлебопечение
Глюкозоизомераза Streptomyces lividans Переработка крахмала
Глюкозооксидаза Aspergillu niger Хлебопечение
Глюкозооксидаза Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Хлебопечение, переработка крахмала
Липаза, триацилглицерол Aspergillus oryzae Производство жиров
Мальтогенная амилаза Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Хлебопечение, переработка крахмала
Пектинлиаза Aspergillu niger Производство напитков
Пектинэстераза Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum Производство напитков
Фосфолипаза А Trichoderma reesei Triclioderma longibrachiatum Хлебопечение, переработка жиров
Фосфолипаза В Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum Хлебопечение, переработка крахмала
Полигалактозидаза Trichoderma reesei Trichoderma longibrachiatum Производство напитков
Протеаза Aspergillus oryzae Производство сыров
Пуллуланаза Bacillus licheniformis Переработка крахмала
Ксиланаза Aspergillu niger Производство напитков, хлебопечение

Иногда повышение стабильности ферментов достигается введением в его структуру специального термостабилизующего модуля, обнаруженного у некоторых бактерий.

Повышение стабильности ферментов к протеолизу осуществляется либо путем удаления сайтов узнавания протеаз из структуры доменов, либо путем увеличения степени гликозилирования через введение в них аминокислот; служащих сайтами О- или N-гликозилирования.

Модификация ферментов осуществляется также с помощью изменения их модульной структуры путем включения или удаления субстратсвязывающего домена. Например, в результате введения в молекулы гликозилтрансфераз целлюлозосвязывающего домена они приобретают способность «сшивать» оборванные концы молекул в аморфных участках на поверхности целлюлозного волокна.

Удаление «ненужных» модулей уменьшает массу молекулы, в результате чего повышается эффективность диффузии фермента в субстрат. Изменение характера действия и субстратной специфичности ферментов достигается, например, делецией петель, перекрывающих активный центр экзогидролаз, что превращает их в родственные эндогидролазы .

Один из видов биологической модификации — знзиматическая модификация ферментов. Ферменты используют для модификации протеинов уже более 20 лет. В пищевых технологиях ферменты используются для регулирования функционально-технологических и нутритивных свойств белков, а также для регулирования функционально-физиологических свойств пищевых белков. В 90-х гг XX в.

Читайте также:  Вирусный энтерит гусей. Гепаднавирусы.

ферменты начали использовать для модификации других ферментов. Сложность осуществления таких реакций обусловлена стерическими факторами, затрудняющими взаимодействие молекул ферментов. Одним из немногочисленных примеров подобной модификации является модификация фосфолипазы А2 тканевой трансглутаминазой .

Все шире используются в качестве продуцентов ферментов генетически измененные микроорганизмы. Модификация их генома производится с целью увеличения гиперпродукции продуцируемых этими микроорганизмами ферментов или создания возможности синтеза нехарактерных для данного микроорганизма ферментов.

С целью увеличения гиперпродукции ферментов микроорганизмы подвергают воздействию различных мутагенов (ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, химических агентов), вызывающих как гибельную мутацию у большей части микробной популяции, так и мутации, способствующие увеличению продукции ферментов.

Для каждого мутагена и микроорганизмы подбирают условия мутагенной обработки, позволяющие увеличить количество выживших мутировавших клеток. Оставшиеся жизнеспособными микробные клетки подвергают скринингу по геномным вариантам, отбирая наиболее активных продуцентов определенных ферментов. Данный метод, называемым методом классической мутации, впервые был описан в конце 30-х гг.

XX в, и активно использовался в 1950-1970 гг. Ему на смену пришли методы модификации генома микроорганизмов, основанные на достижениях генной инженерии. В частности рекомбинантная ДНК (рДНК) технология, позволяющая внедрять в геном микроорганизма гены, ответственные за синтез необходимых ферментов.

В настоящее время налажено промышленное производство микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных ферментов. Например, ген, ответственный за выработку фермента химозина, выделенный из эукариотического организма, внедряют в геном микроорганизмов Escherihia coli, Kluyveromyces lactis или Aspergillus awamori, которые становятся продуцентами данного фермента .

Бактерии Bacillus subtilus используют как продуценты рекомбинантного фермента ацетолактатдекарбоксилазы . Использование микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных ферментов имеет ряд преимуществ. Один и тот же микроорганизм может использоваться как продуцент различных ферментных препаратов, что унифицирует технологию их получения.

Выход ферментов значительно увеличивается, например выход глюкоамилазы и эндоксиланазы. продуцируемых рекомбинантными штаммами Aspergillus. превышает выход этих ферментов из традиционных штаммов в 10-30 раз. Рекомбинантные ферменты отличаются высокой чистотой, что имеет особое значение в пищевых технологиях.

Например, использование свободных от протеазной активности амилаз в хлебопечении позволяет улучшить реологические свойства теста, поскольку не происходит разрушения структуры белков клейковины. Рекомбинантные ферменты широко применяются в пищевых технологиях (табл. 2).

Однако, если в непищевых отраслях промышленности рекомбинантные ферменты применяют без ограничений, то пищевые продукты, полученные с использованием рекомбинантных ферментов, должны быть соответственно маркированы для информирования потребителя. Кроме как из природных источников, ферменты могут быть получены путем искусственного синтеза. Перспективен синтез ферментов, не имеющих полипептидных структур, но содержащих аналоги активных центров существующих ферментов. Созданы ферменты, содержащие синтетические полимеры циклодекстринов и металлопроизводных стероидов, являющиеся матриксом, в котором дополнительные реакционные группы ориентированы как активные центры ферментов . Циклодекстрины широко используются для создания синтетических ферментов, поскольку способны к гидрофобному связыванию в центральной полости активных соединений. На основе β-циклодекстрина получены различные синтетические гидролитические ферменты , ферменты с химотрипсиновой , трансамилазной и рибонуклеазной активностью.Синтетический химотрипсин был получен путем включения в молекулу β -циклодекстрина каталитических групп — имидозолилбензоиной кислоты или других имидазольных соединений.

Поскольку синтетические ферменты не содержат аминокислотных остатков, они менее подвершены действию таких факторов, как температура, рН, ионная сила, чем природные ферменты, для конформационной стабильности и биологических функций которых данные факторы являются лимитирующими. Эти свойства синтетических ферментов расширяют возможности ферментативных технологий, в том числе и в пищевой промышленности.

Ферменты (энзимы)

Органические катализаторы белковой природы, обладающие специфичностью к субстрату. Они обеспечивают последовательность и взаимосвязанность многих сложных биохимических превращений в клетках растений, животных и микроорганизмов. Выделенные из клеток специальными методами, они сохраняют свои каталитические свойства и могут быть использованы в производстве пищи.

Многие процессы производства продуктов питания возможны только под действием ферментов.

Образование ферментов естественным путём осуществляется медленно, поэтому такие производства связаны с большой затратой времени. Так, тестообразование длится 5…7 ч, созревание мяса – 24…

36 ч, созревание сыров – несколько месяцев, весьма продолжительны многие процессы в пивоваренной и винодельческой промышленности.

По рациональной номенклатуре всем ферментам присвоено окончание «-аза». Фермент называют по субстрату, на который он действует, или по реакции, которую он ускоряет.

Так, ферменты, расщепляющие белки (протеины) называют протеазами, а ферменты, расщепляющие жиры (липиды) – липазами. По принципу катализируемых реакций обычно называют группы ферментов. Например, ферменты, ускоряющие реакции гидролиза, называют гидролазами.

Наиболее важное значение среди гидролаз имеют а-, β-амилазы, а-глюкозидаза, β-фруктофуранозидаза и пептидазы.

Для ускорения процессов переработки продовольственного сырья применяются вносимые извне ферментные препараты (ФП), которые позволяют активизировать процессы тестообразования, созревания мяса и рыбы, брожения сахара, увеличить выход сока из плодов и овощей и т.д. Это даёт возможность снизить себестоимость готовой продукции и ускорить сроки её получения. Потребность в ферментах стала настолько большой, что привела к развитию целой области микробиологического синтеза.

Ферментные препараты отличаются от ферментов тем, что помимо каталитически активного белка содержат балластные вещества.

Подавляющее большинство получаемых препаратов являются комплексными, содержащими кроме основного ещё значительное количество сопутствующих ферментов, хотя существуют ферментные препараты, в состав которых входит какой-либо один фермент. В комплексном препарате один фермент может преобладать и иметь наибольшую активность.

В производстве ферментных препаратов прежде всего выращиваются определённые виды микроорганизмов – бактерии, плесневые грибы, дрожжи и т.п., которые в ходе обмена веществ для собственных нужд синтезируют определённые ферменты и их комплексы.

Подбирая оптимальные условия, усиливают синтез нужных ферментов с целью их промышленного использования. После окончания синтетических процессов ферменты выделяют из культуральной жидкости, затем очищают до концентрации товарных препаратов.

Название ФП российского производства формируется так: сокращённому названию основного фермента добавляют видовое название продуцента и заканчивают название суффиксом «-ин».

Например, амилолитические препараты, получаемые из культур Aspergillus oryzae и Bacillus subtilis, называются соответственно амилоризином и амилосубтилином.

Протеолитический препарат,получаемый из культуры Bacillus subtilis, называется протосубтилином.

В названии препарата отражается способ культивирования микроорганизмов: при глубинном способе после названия ставится буква Г, а при поверхностном – П; далее следует обозначение 2х, Зх, 10х, 15х или 20х, отражающее возрастающую степень очистки препарата от балластных веществ. Если в названии не стоит буква х, то это неочищенная культура продуцента.

  • Все ФП перед использованием подвергаются тщательному токсико-гигиеническому исследованию и нормируются соответственно установленным ПДК.
  • Рассмотрим применение некоторых ферментов в пищевой промышленности более подробно.
  • Хлебопечение

Качество хлеба характеризуется его рыхлостью (пористостью), которая обуславливается углекислым газом, выделяющимся в процессе жизнедеятельности дрожжей и спиртового сбраживания ими Сахаров. Дрожжи – это большая систематическая группа живых микроорганизмов из класса сумчатых грибов.

В быту этот термин используют обычно для обозначения хлебопекарских и пивных дрожжей – ценного диетического продукта в виде прессованной влажной, сухой или жидкой массы, получаемой по многоступенчатой технологии в процессе дрожжевого производства.

Дрожжи живут и размножаются в растворах содержащих сахара, поэтому их называют сахаромицетами (сахарными грибами). Оптимальная температура для жизнедеятельности дрожжей 30°С, при 60вС они погибают.

Подавляет развитие дрожжей углекислый газ, скапливающийся при брожении теста, поэтому его следует удалять путём обминки теста. Отрицательное влияние на развитие дрожжей оказывает присутствие в тесте большого количества жира и сахара.

В этих случаях жир добавляют в конце процесса приготовления теста или дрожжи заменяют химическими разрыхлителями – пишевой содой (гидрокарбонатом натрия) или углеаммонийными солями – карбонатом и гидрокарбонатом аммония (см. гл. 12).

В состав дрожжей входит комплекс ферментов, которые гидролизуют дисахариды до моносахаридов и подвергают последние спиртовому брожению:

С6Н12О6 → 2СО2 + 2С2Н5ОН + 118 кДж

Наряду с главными продуктами спиртового брожения – спиртом и углекислым газом – образуются многочисленные побочные продукты (глицерин, янтарная, уксусная и молочная кислоты, изоамиловый и изопропиловый спирты, сложные эфиры этих кислот и спиртов). Эти вещества участвуют в формировании вкуса и аромата изделия.

Благодаря наличию полноценных белков, минеральных веществ и витаминов хлебопекарные дрожжи не только создают пористую структуру, но и повышают пищевую ценность дрожжевых мучных изделий.

Хлеб, выпеченный с прибавлением к обычным дрожжам 20% гриба Torulopsis utilis, дольше сохраняет свой вкус и в пищевом отношении является более ценным. Производство хлебопекарных дрожжей основано на их размножении в жидких питательных средах.

Читайте также:  Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота. Аденовирусные инфекции птиц.

В качестве питательной среды используют патоку (мелассу), являющуюся отходом сахарного производства. Её предварительно разводят водой и обогащают минеральными солями, содержащими фосфор и азот. Выращивают дрожжи вначале в лаборатории, затем в отделении чистых культур, откуда их передают в производство.

Накопление основной массы дрожжей идёт в дрожжерастительных аппаратах с непрерывным притоком питательной среды, обогащённой воздухом. Дрожжи выращивают в течение 12…48 часов при 30°С. Затем их отделяют от бражки, промывают, сепарируют, прессуют, фасуют и охлаждают до 2…4°С.

22-6 Производство ферментов

22.6. Производство ферментов имеет
определенную специфику их получения с
помощью биотехнологии. Определите эту
специфику в соответствии со свойствами
самих ферментов.

Культивирование микроорганизмов —
продуцентов ферментов целесообразно
в средах строго детерминированного
состава, обеспечивающих направленный
биосинтез нужного Ф.

Синтез многих Ф репрессируется
легкоусвояемыми источниками углерода
(глюкозой, фруктозой, маннозой и др.);
этот эффект носит название катаболитной
репрессии (иногда глюкозньм эффектом).
Катаболитной репрессии подвержен
биосинтез таких Ф, как -амилаза,
целлюлаза, глюкоамидаза, инвертаза и
др.

Ферменты, катализирующие превращение
азотсодержащих субстратов, также
регулируются по механизму катаболитной
репрессии; их биосинтез репрессируется
ионами аммония или быстроусвояемыми
аминокислотами.

Аминокислоты в анаэробных
условиях культивирования инициируют
биосинтез соответствующих декарбоксилаз.
При наличии в среде большой концентрации
мочевины стимулируется биосинтез
уреазы. Введение в среду культивирования
аргинина индуцирует биосинтез аргиназы.

Источниками органического азота могут
служить пептон, триптон, дрожжевой
экстракт, гидролизат казеина или любая
их смесь.

Наличие в среде культивирования различных
биополимеров обусловливает одновременное
накопление комплекса протеаз, амилаз,
нуклеаз, липаз.

На рост микроорганизмов и биосинтез Ф
существенное влияние оказывают ионы
кальция, марганца, цинка и др. Ионы железа
и магния активируют и стабилизируют
протеолитические ферменты.

Присутствие
ионов железа и меди в среде культивирования
существенно для биосинтеза железо- и
медьсодержащих Ф, участвующих, как
правило, в окислительно-восстановительных
реакциях (утилизации и превращения
энергии).

Отсутствие таких ионов может
негативно отразиться на скорости многих
метаболических процессов и на биосинтезе
Ф, катализирующих эти процессы.

Продуценты Ф, относящиеся к строгим
анаэробам, требуют полностью бескислородных
условий культивирования и очень богатых,
полноценных сред. Процесс культивирования
в этом случае можно проводить в более
простых ферментерах, так как не нужна
аэрация и перемешивание.

Оптимизация питательных сред и условий
культивирования для обеспечения
направленного биосинтеза продуцентом
целевого продукта является важным
этапом разработки биотехнологического
процесса получения высокоочищенных Ф.
Преимущественный биосинтез культурой
нужного продукта с минимальным содержанием
посторонних белков позволяет в дальнейшем
существенно упростить выделение и
очистку Ф.

Переработка культуральной жидкости

Большинство Ф промышленного производства
относится к внеклеточным, поэтому они
находятся в культуральной жидкости.
При выделении внутриклеточных Ф
(изоферментов) основной задачей является
сбор клеток, содержащих Ф.

Глубинная культура представляет собой
суспензию, содержащую остатки питательных
веществ, продукты метаболизма (в том
числе внеклеточные Ф), взвешенные клетки
продуцента.

В период культивирования
обычно происходит ограниченный лизис
микробных клеток и в суспензии появляется
неконтролируемое количество внутриклеточных
метаболитов.

Из этой достаточно сложной
и многокомпонентной смеси приходится
выделять и очищать один Ф.

Технологический процесс начинают с
разделения растворимых и нерастворимых
веществ, концентрирования и фракционирования,
заканчивают разнообразными способами
хроматографической очистки.

Фильтрация жидкости, содержащей
мелкодисперсный клеточный материал,
частично разрушенные клетки и
внутриклеточные полимеры, сопряжена с
определенными трудностями. Фильтруемый
раствор вязок, склонен к гелеобразованию,
осадок сжимается и закупоривает поры
фильтра. Для избежания этого применяют
крупнопористые фильтрующие материалы
— диатомиты, кизельгур, бентонит,
фильтроперлит и др.

Сепарацию клеточной массы и сопутствующих
конгломератов осуществляют с помощью
центрифуг

Дезинтеграция биомассы. Основное
количество Ф обычно находится внутри
клеток, где он образует комплексы с
другими биополимерами.

Клеточные
структуры могут быть разрушены в
результате прямого механического
воздействия (баллистическими, УЗ-,
экструзионными, ферментативными методами
— см. гл. 5.7).

После дезинтеграции биомассы
продуцента фермента получается вязкая,
опалесцирующая суспензия, содержащая
фрагменты клеточных стенок, субклеточных
структур и продукты их деградации, а
также самые разнообразные высоко- и
низкомолекулярные органические вещества.

Если ферменты мембраносвязанные,
необходимо экстрагировать их. Наиболее
часто используемым экстрагентом для
ферментов используют водные буферные
растворы.

Если ферменты находятся в
растворенном состоянии, на одной из
первой стадий обработки клеточного
гомогената должны быть удалены
нерастворимые частицы. Для этого
применяют скоростное центрифугирование.

Образуется прозрачный клеточный
экстракт, содержащий только растворенные
биополимеры и низкомолекулярные
компоненты. Среди нежелательных
процессов, которые могут происходить
в таком растворе – протеолиз собственными
клеточными протеазами.

Инактивацию протеаз осуществляют
обработкой клеточного экстракта
специфическими ингибиторами-комплексонами
(ЭДТА, о-фенантролин, оксихинолин), солями
ртути или серебра.

Денатурацию нуклеиновых
кислот в процессе очистки Ф обусловливает
низкая ионная сила или основность среды.
Можно использовать специальные осадители,
образующие с нуклеиновыми кислотами
нерастворимые комплексы.

С этой целью
применяют бромистый цетилтриметиламмоний,
стрептомицинсульфат, протаминосульфат,
полиэтиленимин.

Фракционирование белков растворителями.
Обычно для фракционирования растворов
Ф применяют этанол и ацетон. При повышенной
температуре (более 4 °С) в водно-органических
смесях Ф денатурируют, поэтому работы
с органическими растворителями проводят
при низких температурах.

Органический
растворитель охлаждают до (-30) — (-40 °С)
сухим льдом или жидким азотом; температура
смеси поддерживается при этом на уровне
от -10 до -20 °С.

Осадок центрифугируют,
затем растворяют в небольшом объеме
буферного раствора, удаляя следы
органических растворителей диализом
или ультрафильтрацией через гель.

Тонкие методы очистки ферментов

Для более эффективной очистки ферментов
используют ионнообменную, аффинную
хроматографию и гель-фильтрацию. Наиболее
эффективная очистка Ф достигается
ионно-обменной хроматографией с
использованием сорбентов на основе
сополимеров метакриловой кислоты и
различных гидрофобных мономеров.

В
препаративной энзимологии применяют
иониты на основе натуральных или
полусинтетических полисахаридных
матриц (ионно-обменные целлюлозы). Среди
многих производных целлюлозы чаще
используют ДЭАЭ-, ТЭАЭ-, КМ- и фосфоцеллюлозы
(первые два — аниониты, последние —
катиониты).

Предпочтительна гранулированная
целлюлоза, гидродинамические свойства
которой позволяют проводить
хроматографический процесс с большой
скоростью.

Фракционирование смесей Ф, имеющих
различный размер молекул, проводят
гель-фильтрацией на разных типах
сефадексов — модифицированных производных-
линейного полисахарида полидекстрана.

Для фракционирования крупномолекулярных
смесей применяют поперечносшитые
акриламиды под названием ультрагелей
и агарозу в поперечно-сшитом состоянии
(сёфарозы СЬ 2В, 4В и 6В).

В поперечно-сшитых
агарозах хроматографический процесс
можно осуществить в широком интервале
рН и температуры, использовать буферные
растворы, содержащие органические
растворители, соли.

Наряду с Натуральными и полусинтетическими
полисахаридными матрицами для
гель-фильтрации используют синтетические
поликриламидные гели. Большое количество
аминогрупп в их структуре придает
полимеру гидрофобные свойства, хорошую
набухаемость в воде с образовании
пористой структуры геля.

Для гель-хроматографии, в отличие от
других методов хроматографического
разделения белков, не требуется
обессоливать пробу, корректировать рН,
не нужны специальные элюирующие буферы.

Смесь белков, продвигаясь по сорбенту,
освобождается от солей и распределяется
в порядке уменьшения м.м. Белки и другие
компоненты смеси с сорбентом не
взаимодействуют.

Из колонки вначале
выходят самые крупные молекулы, затем
— меньшими м.м. и, наконец, соли.

Аффинная хроматография характеризуется
высокими выходом и степенью очистки
выделяемого .белка. Основа этого
биоспецифического метода состоит в
том, что в многокомпонентной смеси между
одним или несколькими белками-ферментами
и полимерными сорбентами образуется
стабильная связь, в результате чего эти
белки из раствора переходят на
нерастворимый сорбент.

Чем меньше белков
связывает сорбент, тем выше его
селективность (идеальная селективность
— связывание одного Ф). Центром связывания
служат субстраты, их аналоги, обратимые
ингибиторы, коферменты, антитела и
другие вещества, называемые лигандами,
присоединенные к матрицам. Лиганды
специфически взаимодействуют с активными
центрами выделяемого Ф.

В качестве
лигандов используют синтетические
аналоги субстратов или коферментов.

Строгая специфичность аффинного сорбента
к выделяемому Ф значительно улучшает
сам — хроматографический процесс,
состоящий из последовательно сменяющихся
этапов сорбции, удаления несорбированных
белков и элюирования сорбированного
Ф. Условия сорбции подбираются таким
образом, чтобы выделяемый Ф сорбировался
наиболее полно, а сопутствующие белки
не задерживались.

Это зависит от рН,
ионной силы, природы буферных растворов,
температуры. После отмывки сорбента от
несорбированных белков резко изменяется
Один или нескольких из указанных
параметров, в результате разрушается
комплекс фермента с сорбентом и Ф
высвобождается.

Элюирование Ф проводят,
добавляя в элюент специфически
взаимодействующие с ферментом вещества
— субстраты, коферменты, растворимые
ингибиторы.

Как правило, это повышает эффективность
очистки, так как специфические агенты
не разрушают неспецифические комплексы
между сорбентом и сопутствующими
белками.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector