Синтез антител. Методика синтеза антител при вирусных инфекциях.

Анализы на антитела (иммуноглобулины, Ig) — важная часть диагностики различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Вырабатываются эти белки иммунной системой и играют ключевую роль в борьбе с вирусами, бактериями, грибками. Какие антитела продуцируют клетки и за что отвечает каждый класс Ig, расскажет MedAboutMe.

Синтез антител. Методика синтеза антител при вирусных инфекциях.

Иммуноглобулины — ключевой компонент специфического иммунитета. Вырабатываются они в ответ на конкретный возбудитель и способны бороться именно с ним. Антитела синтезируются В-лимфоцитами при контакте с инфекцией. Кроме этого, Ig передаются от матери к ребенку и обеспечивают ему защиту на первые полгода жизни.

Существует несколько классов антител, основные из которых — IgA, IgM, IgG. Именно по соотношению разных классов иммуноглобулинов врач может оценить стадию болезни и ее течение. Определяются антитела методом иммуноферментного (ИФА) или иммунохемилюминесцентного (ИХЛА) анализа. Кровь сдается на конкретные виды антител, например, IgM и IgG к вирусу кори или вирусу SARS-CoV-2.

Кроме этого, антитела могут вырабатываться против клеток организма и в дальнейшем их атаковать — в этом случае они называются антителам, а у человека развивается аутоиммунное заболевание.

IgA — антитела, которые обнаруживаются преимущественно в секретах (на слизистых носа и горла, в кишечнике, в мочеполовых путях). Здесь этот класс иммуноглобулинов обеспечивает местную защиту, прежде всего против вирусов.

В меньшем количестве IgA присутствуют в крови. Вырабатываются они достаточно быстро и появляются уже в острой стадии болезни.

IgМ — главный маркер острого заболевания. Такие антитела продуцируются В-лимфоцитами на ранних стадиях болезни, обнаружить их в крови можно в среднем через 5 дней после развития инфекции.

IgM достаточно крупные по размеру, поэтому они не могут проходить через плацентарный барьер. Это объясняет, почему заражение некоторыми инфекциями, например, краснухой, во время беременности несет серьезную опасность для плода.

IgG начинают вырабатываться спустя 14-20 дней после начала инфекционного процесса. Их основная задача — не столько борьба с имеющейся болезнью, сколько защита организма в дальнейшем. Это антитела, отвечающие за иммунитет перед конкретной болезнью.

Синтез IgG — основная задача прививок. С вакциной человек получает ослабленный микроб или его фрагмент, иммунная система реагирует на это и вырабатывает антитела класса G, которые при последующем контакте с инфекцией не дают ей развиться.

Кроме этого, иммуноглобулины G мелкие и могут проникать через плацентарный барьер. А значит, обеспечивают защиту плода.

IgG к разным инфекциям остаются в организме на разное время. Так, антитела к кори и ветрянке могут циркулировать в крови пожизненно, а к сезонным респираторным вирусам — всего 1-3 года.

Продолжительность жизни антител IgG к SARS-CoV-2 вообще зависит от индивидуальных особенностей пациентов.

Так, в The Lancet Microbe было опубликовано исследование, которое показывает, что иммунитет от COVID-19 может не развиться вообще или же оставаться десятилетиями. Ученые наблюдали за 164 пациентами и получили следующие результаты:

  • Не выработаны антитела (около 12%).
  • Быстро убывающие антитела (около 27%).
  • Медленно убывающие антитела (29%) — через полгода IgG еще обнаруживались.
  • Стойкие антитела (около 32%) — уровень IgG не изменился в течение 180 дней.

Релиз-активные антитела в борьбе с простудой и гриппом

Статьи

Опубликовано в журнале:
« ФАРМАТЕКА » № 4 — 2013 Н.П. Княжеская 1, к.м.н., доцент, И.А. Баранова2 , д.м.н., профессор, М.П. Фабрика1 , к.м.н., доцент; А.Р. Татарский2 , д.м.н., профессор

1 Кафедра пульмонологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва 2Кафедра внутренних болезней п/ф ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Москва

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются самыми распространенными инфекционными заболеваниями в развитых странах. Поиски оптимальных методов профилактики и лечения гриппа и других ОРВИ у больных хронической бронхолегочной патологией ведутся практически два десятилетия.

НПФ “Материа Медика Холдинг” на протяжении 10 лет производит широко применяемые в клинической практике препараты на основе релиз-активных антител для профилактики и лечения всех видов гриппа и простуды: Анаферон и Анаферон детский.

В 2011году компания выпустила на рынок принципиально новый противовирусный препарат Эргоферон, обладающий усиленным противовирусным, противовоспалительным и антигистаминным действиями.

Применение Эргоферона у пациентов с хроническими обструктивными заболеваниями легких способствует быстрому купированию ОРВИ и препятствует развитию обострений этих заболеваний, снижает потребность в применении антибактериальных препаратов.

Ключевые слова: острые респираторные вирусные инфекции, хроническая о бструктивная болезнь легких, бронхиальная астма, Анаферон, Эргоферон, релиз-активные антитела

Актуальность

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются острой социальной проблемой – ежегодно они приводят к временной утрате трудоспособности миллионы людей, что наносит экономический ущерб многим странам мира.

По данным Министерства здравоохранения РФ, на их долю приходится 80–90 % всех случаев инфекционной патологии [1]. Эпидемиологические обзоры подтверждают высокую заболеваемость гриппом и другими ОРВИ, которая в 2012 г. в РФ составила около 31 млн. случаев [2].

В настоящее время вопросы эффективного лечения гриппа и других ОРВИ остаются весьма актуальными, что связано с высокой контагиозностью и скоростью распространения возбудителей, изменчивостью антигенных свойств вирусов, быстро развивающейся резистентностью к противовирусным препаратам, специфичностью большинства средств лечения.

Эти заболевания вызывают многочисленные возбудители, среди которых различают основные группы вирусов: гриппа, парагриппа, адено-, рино-, реовирусы, а также более 300 их подтипов.

Отличительные признаки ОРВИ: острота начала болезни, симптомы интоксикации, характер лихорадки и катаральных явлений, тип осложнений.

Например, для гриппа характерны острое начало, высокая температура, выраженные проявления интоксикации, особенно опасно развитие тяжелых форм болезни; для парагриппа – более легкое, чем у гриппа течение, поражение гортани, кашель; для аденовирусной инфекции – менее выраженное, чем у гриппа начало, ангина и лимфаденопатия, поражение конъюнктивы глаз, сильный насморк [3, 4].

Вирусы как возбудители острых респираторных инфекций подавляют функциональную активность различных звеньев иммунной системы и приводят к обострению хронических заболеваний, а также к возникновению вторичных бактериальных осложнений [5].

В начальный период болезни вирус размножается в “воротах инфекции”: носу, носоглотке, гортани, что проявляется в виде насморка, першения в горле, сухого кашля. Температура обычно повышается позже, когда вирус попадает в кровь и вызывает симптомы общей интоксикации: озноб, головная боль, ломота в спине и конечностях.

Иногда в этот процесс вовлекаются слизистые оболочки глаз и желудочно-кишечного тракта [6]. Даже у здоровых людей течение ОРВИ может осложниться присоединением бактериальной инфекции.

Однако есть категории пациентов, которые особо привлекают внимание терапевтической службы в отношении заболеваемости ОРВИ: пациенты с хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей, сахарным диабетом, сердечно-сосудистыми заболеваниями, заболеваниями печени и почек, пациенты, перенесшие хирургические вмешательства, травмы, принимающие ряд лекарственных средств (кортикостероиды, длительная антибиотикотерапия и др.) [7]. Так, ОРВИ является наиболее частой причиной обострения хронических заболеваний легких, в том числе бронхиальной астмы (БА) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

У пациентов с обострением ХОБЛ наблюдается увеличение числа нейтро-филов в бронхоальвеолярном секрете и ослабление функции альвеолярных макрофагов на фоне снижения уровня общих Т-лимфоцитов, дефицита содержания иммуноглобулинов М (IgM) и IgA, уменьшения числа В-клеток.

При БА существенно снижается уровень секреторного IgA, содержания Т- и В-лимфоцитов, отмечается недостаточность Т-хелперов 1-го порядка, что характеризуется снижением выработки интерферона-γ (ИФН-γ). У пациентов, постоянно принимающих системные стероиды, данные изменения особенно выражены [9–11].

Известно, что ОРВИ способствуют повышению реактивности дыхательных путей (в частности, бронхиального дерева) даже у соматически здоровых людей. Одной из возможных причин этого считается прямое взаимодействие вирусных агентов с молекулами межклеточной адгезии ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1).

Эти белковые молекулы располагаются на клеточной мембране фибробластов, эндотелиоцитов, тканевых макрофагов, дендритных клеток и служат механическому взаимодействию клеток между собой [12].

Внедрение в клиническую практику лекарственных препаратов, сочетающих противовирусное, противовоспалительное и антигистаминное действия, весьма актуально. Большое значение в появлении основных симптомов вирусных инфекций придается гистамину.

Высвобождение гистамина из гранул происходит под влиянием нескольких факторов, наиболее важный из которых – взаимодействие с иммунологическим раздражителем.

Именно этот механизм лежит в основе развития клинических симптомов, общих для ОРВИ и аллергических заболеваний респираторного тракта: заложенности носа, ринореи, повышении продукции слизи секреторными клетками, отечности и зуда слизистых оболочек дыхательных путей. Особенно важен этот механизм для пациентов БА.

Применение препаратов, влияющих на уровень гистамина и выраженность гистамин-зависимых реакций, особенно у пациентов с аллергическими заболеваниями при ОРВИ, оправданно с патофизиологической и биохимической точек зрения. Такие препараты путем влияния на каскад инфекционно-воспалительных и воспалительно-аллергических реакций способствуют улучшению состояния больных, уменьшению выраженности основных клинических симптомов [13, 14].

Положительный результат лечения обычно достигается при раннем использовании этиотропных препаратов – начиная с первых суток манифестации заболевания.

Современные препараты способны модулировать воспалительный процесс, индуцировать местные и общие иммунные реакции как специфические, так и неспецифические, а также влиять на экспрессию вируса.

Определенный интерес представляет препарат Эргоферон, созданный на основе релиз-активных1 антител к гамма-интерферону человека (анти-ИФН-γ), CD4 (анти-CD4) и гистамину (анти-Н) и обладающий усиленным противовирусным действием, противовоспалительной и антигистаминной активностью.

Читайте также:  Цитокиновый контроль имунной системы. Местное действие цитокинов. Механизм действия цитокинов на иммунитет.

Введение в организм релиз-активных модификаторов активности биологических молекул наряду с эффективностью, обеспечивает высокую безопасность препарата. Лекарственные препараты, в состав которых входят анти-ИФН-γ, успешно примененяются в профилактике инфекционных заболеваний, а анти-Н – в профилактике обострений язвенной болезни желудка и 12-перст-ной кишки [15, 16].

Ранее применение релиз-активных антител к ИФН-γ было продемонстрировано в ряде опубликованных работ. Так, Л.М. Куделя и соавт. в своих работах показали эффективность и безопасность применения препарата Анаферон для пациентов с обострением БА и ХОБЛ [17, 18]. Действующим веществом Анаферона являются релиз-активные антитела к ИФН-γ человека.

Препарат обладает разносторонним действием на иммунную систему, оказывая влияние на ряд ведущих механизмов противоинфекционной защиты.

За счет комплексного влияния на выработку разных пулов интерферонов (ИФН-α и -γ), Анаферон повышает функциональную активность клеток, участвующих в раннем противовирусном ответе: повышает активность макрофагов и NK-клеток, которые лизируют уже зараженные клетки и защищают окружающие клетки от вирусов.

Важной особенностью релиз-активных антител к ИФН-γ является их способность избирательно оказывать влияние на продукцию и рецепцию ИФН в зависимости от стадии инфекционного заболевания и исходного состояния.

Так, в случае применения релиз-активных антител к ИФН-γ у здоровых или пациентов, находящихся в стадии реконвалесценции (отсутствие вируса в организме) продукция ИФН практически не меняется, но повышается и сохраняется на высоком уровне способность клеток производить ИФН в присутствии вируса (начало и разгар и вирусной инфекции).

Таким образом, Анаферон поддерживает организм в постоянной готовности для борьбы с инфекцией. По данным В.К. Веревщикова, применение Анаферона у пациентов, страдающих хронической сердечно-сосудистой и бронхолегочной патологией, способствует сокращению заболеваемости ОРВИ и гриппом, снижает продолжительность и выраженность острой вирусной респираторной патологии, уменьшает число бактериальных осложнений. И что особенно важно, предупреждает развитие обострений хронической патологии на фоне простудных заболеваний у пациентов из групп риска, а также улучшает показатели клеточного и гуморального звеньев иммунной системы 19–21].

Эргоферон в терапии хронических заболеваний легких В соответствии со стандартами лечения ОРВИ у больных, страдающих хронической патологией органов дыхания, с первых часов должна проводиться этиотропная (противовирусная) терапия. Кроме того, у данной категории пациентов должна назначаться противовоспалительная терапия.

Данным требованиям отвечает новый противовирусный препарат Эргоферон, обладающий комплексной (противовирусной, противовоспалительной и антигистаминной) фармакологической активностью. Эргоферон характеризуется широким спектром противовирусной активности без риска формирования резистентности.

Первый компонент Эргоферона, антитела к ИФН-γ, повышают экспрессию ИФН-γ, ИФН-α/β, а также сопряженных с ним интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и др.), восстанавливают цитокиновый статус, стимулируют функциональную активность NK-клеток, регулируют синтез иммуноглобулинов, модулируют баланс Th1/Th2-активностей.

Кроме того, в ходе клинических исследований показано положительное влияние антител к ИФН-γ на местный иммунитет, что выражалось в увеличении содержания sIgA в носовых смывах пациентов с ОРВИ [19].

Второй компонент препарата – антитела к CD4, регулируют функциональную активность CD4 рецептора, что в свою очередь приводит к повышению функциональной активности CD4 лимфоцитов, нормализации иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, а также субпопуляцион-ного состава иммунокомпетентных клеток (СD3, CD4, CD8, CD16, CD20).

Молекулярной мишенью антител к CD4 является CD4-ко-рецептор Т-клеточного рецептора, локализованного на поверхности Т-лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов, кортикальных тимоцитов, моноцитов, макрофагов, дендритных клеток.

Таким образом, влияние релиз-активных антител к CD4 способствует усилению противовирусной активности и формированию адекватного противовирусного иммунного ответа [22].

Третий компонент Эргоферона – антитела к гистамину (анти-H), уменьшает проницаемость сосудов и снижает агрегацию тромбоцитов, подавляет высвобождение гистамина из тучных клеток и базофилов, оптимизирует продукцию лейкотриенов, сокращая тем самым длительность и выраженность воспалительных изменений слизистых оболочек респираторного тракта [22]. Антитела к гистамину модифицируют гистамин-зависимую активацию периферических и центральных гистаминовых рецепторов и, таким образом, снижает тонус гладкой мускулатуры бронхов, уменьшают проницаемость микрососудов, что приводит к уменьшению выраженности и длительности ринореи, отека слизистой оболочки носа, кашля и чихания. Эти свойства препарата особенно важны для пациентов, имеющих БА и другие аллергические заболевания легких. Экспериментально и клинически доказана эффективность применения компонентов Эргоферона при вирусных инфекционных заболеваниях: гриппе А и В, острых респираторных вирусных инфекциях, вызванных вирусом парагриппа, аденовирусом, респираторно-синцитиальным вирусом, коронавирусом. Использование Эргоферона представляет несомненный интерес для пациентов с ХОБЛ с учетом безопасности и ранее полученных положительных результатов их применения данной категорией пациентов. Ведущее место нарушения контроля БА и прогрессирования ХОБЛ занимают повторные обострения, основной причиной которых являются ОРВИ. Респираторные вирусы способны вызывать обструкцию дыхательных путей и усугублять имеющиеся у больных БА и ХОБЛ нарушения бронхиальной проходимости. Кроме того, при ОРВИ нарушается взаимоотношение колонизирующих микроорганизмов с местными и системными факторами защиты.

Таким образом, иммунный ответ на персистирующую инфекцию не в состоянии эффективно элиминировать инфекционные агенты, а лишь в определенной мере ограничивает безудержный рост бактериальной популяции.

Относительная иммунная недостаточность – важное условие персистенции и пролиферации бактерий в респираторном тракте [23].

Микроорганизмы, действуя практически на все клетки респираторного тракта, запускают каскад реакций с выделением массы провос-палительных медиаторов и хемоаттрактантов, поддерживающих хроническое воспаление.

При обострениях БА и ХОБЛ, связанных с ОРВИ, часто назначают антибиотики, но наряду с противомикробным эффектом наблюдаются побочные эффекты.

В результате использования ряда системных антибиотиков широкого спектра происходит резкое ингибирование биохимической активности кишечной микрофлоры, сопровождающееся выраженным нарушением микробиоценоза кишечника. Широкое применение системных антибиотиков, нередко без должных на то оснований, особенно с использованием неадекватно малых доз и недостаточное по продолжительности, приводит к появлению резистентных к данному антибиотику штаммов возбудителей. Кроме того, при антибиотикотера-пии резко повышается риск развития побочных эффектов и аллергических реакций [24].

Применение Эргоферона в первые часы заболевания дает наиболее выраженный положительный результат. Синергизмом действия антител к ИФН-γ, анти-CD4 и антител к гистамину является формирование адекватного противовирусного ответа.

Влияние релиз-активных антител на рецепцию гистамина и реализацию гистамин-зависимых реакций обеспечивает противоотечный, противовоспалительный и антигистамин-ный эффекты, что является важным преимуществом Эргоферона перед другими противовирусными препаратами.

Эффективность и безопасность Эргоферона в лечении ОРВИ у пациентов с БА и ХОБЛ были изучена на базе аллергологического отделения ГКБ № 57 г. Москвы в ходе сравнительного рандомизированного клинического исследования, проведенного в ноябре 2011 – марте 2012г.

В исследование было включено 66 пациентов в возрасте от 19 до 75 лет, госпитализированных по поводу обострения хронических заболеваний легких на фоне ОРВИ. У всех больных отмечалась лихорадка, признаки интоксикационного и катарального синдромов.

В ходе исследования было показано, что прием Эргоферона пациентами основной группы позволил уже на 1–2-е сутки купировать основные катаральные симптомы и проявления общей интоксикации, нормализовать температуру тела, в 78 % случаев не потребовалось назначения антибактериальных препаратов. В ходе исследования не наблюдалось аллергических реакций и других побочных эффектов на прием препарата, что немаловажно для пациентов такого профиля [25].

Заключение

Использование в клинической практике препаратов на основе релиз-активных антител (Анаферон и Эргоферон) с доказанной клинической эффективностью и высокой безопасностью, без риска формирования резистентности, позволяет занимать им важное место в профилактике и лечении гриппа и ОРВИ широкого спектра действия, в том числе, у пациентов с хроническими заболеваниями легких (ХОБЛ и БА).

Литература

Практическое применение иммуноферментного анализа в диагностике заболеваний — Практическая медицина — Практическая медицина. Журнал для практикующих врачей и специалистов

Л.М. АНЦИЛЕВИЧ, Л.А. ЯГУДИНА

Казанская государственная медицинская академия, 420012, г. Казань, ул. Муштари, д. 11

Анцилевич Лия Михайловна — кандидат биологических наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, тел. (843) 236-09-09, e-mail: yagudinaleila@mail.ru1

Ягудина Лейла Асхатовна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, тел. (843) 236-09-09, e-mail: yagudinaleila@mail.ru1

В статье показаны возможности современного серологического метода исследования — иммуноферментного анализа — в диагностике инфекционных, эндокринных и онкологических заболеваний. Рассмотрены практические примеры диагностики отдельных патологических состояний, факторы, влияющие на результат, диагностическая ценность используемых маркеров.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, антиген, антитело.

L.M. ANTSILEVICH, L.A. YAGUDINA

Kazan State Medical Academy, 49 Butlerova St., Kazan, Russian Federation 420012

Practical application of an enzyme immunoassay in the diagnosis of diseases

Antsilevich L.M. — Cand. Sc. Biology, Associate Professor of the Department of Clinical Pathology, tel. (843) 236-09-09, e-mail: yagudinaleila@mail.ru

Yagudina L.A. — Candidate of Medical Science, Associate Professor of the Department of Clinical Pathology, tel. (843) 236-09-09, e-mail: yagudinaleila@mail.ru

The article explains the possibilities of modern serological method of research — enzyme immunoassay — in the diagnosis of infectious, endocrine and oncological diseases. Were examined the practical examples of individual diagnosis of pathological conditions, factors affecting the result, the diagnostic value of the markers used.

  • Key words:enzyme immunoassay, antigen, antibody.
  • 1. Применение иммуноферментного анализа в диагностике инфекционных заболеваний
  • Иммуноферментный анализ (ИФА) — высокочувствительный и высокоспецифичный метод лабораторного исследования, основанный на специфическом связывании антигенов и антител в пробе с дальнейшим выявлением их ферментной меткой.
Читайте также:  Аулин таблетки 100 мг, гранулы или порошок для приготовления раствора - инструкция по применению

Иммуноферментный анализ имеет наибольшую информативность при диагностике инфекционных заболеваний. Исследования, выполняемые для обнаружения антигенов возбудителя и специфических антител к ним при инфекциях, являются доступными методами лабораторной диагностики [1, 2].

ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных инфекций. Особенно метод незаменим при диагностике вирусных заболеваний, где затруднены прямые методы детекции возбудителя.

Кроме того, в ряде случаев серологические исследования остаются единственным методом скрининговой диагностики инфекций, например токсоплазмоза, токсокароза, трихинеллеза.

ИФА используется в двух направлениях: обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого и определение антигенов возбудителя для установления его родовой или видовой принадлежности.

Учитывая динамику синтеза отдельных классов иммуноглобулинов в иммунном ответе, наличие антител класса IgM свидетельствует о первичной острой инфекции, тогда как обнаружение только IgG маркирует давний процесс или наличие иммунологической памяти без активного заболевания. Также к IgG относятся поствакцинальные антитела.

Определение специфических IgA информативно для дальнейшего контроля излеченности заболевания, т.к. IgA, имея короткий период полураспада, исчезают из циркуляции после успешного лечения в течение 2 недель. Авидность антител класса IgG позволяет судить о давности инфицирования, что особенно важно при скрининге беременных женщин на внутриутробные инфекции. Таким образом, иммуноферментная диагностика применяется для первичного выявления инфекции, определения степени остроты заболевания, давности инфицирования, наличия иммунологической памяти после перенесенных заболеваний или напряженности поствакцинального иммунитета.

Точки приложения ИФА в диагностике инфекционных заболеваний:

  • Первичная (активная инфекция) — может быть идентифицирована определением диагностически значимого уровня антител класса IgM в единственном образце или значимым ростом концентрации антител IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом в 2-4 недели.
  • Реинфекция — выявляется быстрым подъемом уровня антител класса IgG (и/или IgA).
  • Сероконверсия — антитела могут не выявляться в первичном образце и становятся позитивными во втором.
  • Определение давности инфицирования — определение инзкоавидных антител, как правило, характерно для острого процесса со сроками инфицирования не более 4 — 6 месяцев. Тогда как наличие высокоавидных антител свидетельствует о давней инфекции продолжительностью более 6 месяцев.
  • Реконвалесценция — концентрация антител классов IgA и IgG существенно снижается (падение титра в 2-4 раза) во время выздоровления, а антитела класса IgM исчезают.
  • Перенесенная инфекция — отмечается персистенция антител класса IgG без роста их концентрации в парных сыворотках и отсутствие антител классов IgA и IgM.
  • Состояние после успешного лечения — исчезновение или снижение титра в 2-4 раза антител класса IgA при сохраняющихся IgG через 2 недели после курса лечения.
  • Наличие поствакцинального иммунитета — определение специфических антител класса IgG в высоких титрах через 4 недели после вакцинации [3-5].

Разберем применение иммуноферментного анализа на примере диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна — Барр (ВЭБ). К настоящему времени выделены группы антигенов ВЭБ, выявление антител к которым позволяет не только определять наличие инфекции, но также дифференцировать стадии заболевания, прогнозировать его развитие и контролировать эффективность проводимых лечебных мероприятий.

Наибольшую значимость для серодиагностики ВЭБ-инфекции имеет определение антител к капсидным антигенам (VCA). Антитела к вирусному капсидному антигену (anti-VCA) делятся на классы IgM и IgG.

Anti-VCAIgM обнаруживаются на ранней стадии инфекции и определяются в течении 4-6 недель.

Anti-VCAIgG определяются в острой фазе инфекции, и их уровень снижается до неопределяемого в течение 3-6 месяцев.

Антитела к раннему антигену (anti-EA) маркируют активную инфекцию, но у 20% здоровых лиц могут присутствовать годами. Присутствие антител к раннему антигену может указывать также на реактивацию имеющейся инфекции через несколько лет после первичного инфицирования.

Антитела к ядерному антигену EBNA не указывают на острую фазу, но медленно повышаются в течение 2-4 месяцев от начала заболевания и персистируют пожизненно [7-10]. Серологический маркерный спектр при различных формах течения ВЭБ-инфекции представлен в табл. 1 [6].

Таблица 1.

Определение специфических антител к ВЭБ

 ВЭБ заболевания  Антитела к ВЭБ
 ГетерофильныеIgM Anti-VCA  Anti-EA  Anti-EBNA
IgM IgG
Острая первичная ВЭБ-инфекция  +  +  +  +/-  —
Перенесенная ВЭБ-инфекция  —  —  +  —  +
Хроническая ВЭБ-инфекция  —  —  +  +  —
Реактивация инфекции  —  —  +  +  +
Лимфома Беркитта + + +
Назофарингеальная карцинома  —  +  +  +

Наличие anti-VCA, но не anti-EBNA — недавняя инфекция, наличие обоих видов антител — давняя инфекция. Однако результаты лабораторных исследований необходимо учитывать в комплексе с данными клинической картины.

Использование различных антител для диагностики первичной или перенесенной ВЭБ инфекции показано в табл. 2 [6].

Таблица 2.

Использование различных видов антител для диагностики текущей или перенесенной ВЭБ-инфекции

Виды антител Текущая инф. Перенесенная инф.

Диагностика инфекционных заболеваний

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов. Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:

  • бактериологические;
  • серологические;
  • метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне.

Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека.

Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

  • микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
  • выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
  • идентификацию бактерий;
  • определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза).

Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов.

Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды.

Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 — стрептококки;  2 — стафилококки;  3 — диплобактерии Фридленда;  4 — пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 часов. Затем чашки Петри просматривают.

Читайте также:  Таблицы с нормальными показателями УЗИ сердца новорожденных.

Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры.

Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация  — это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма.

В Лаборатории «Ситилаб» идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства: на бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания.

Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R указывает на резистентность, I — умеренную чувствительность, S — чувствительность микроорганизма к данному препарату.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний.

Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца.

В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания.

В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала.

Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 105, свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами.

Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител.

При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентом в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G.

При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100%-й чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей.

В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания.

Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность — характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами.

В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела.

IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген.

Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях.

Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента.

В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать.

Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы.

Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал — сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д.

В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущества ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключаются в следующем:

  • возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и материале, получаемом при биопсии;
  • возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
  • возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
  • высокая чувствительность метода; например, чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0.102 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов — 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0.105 копий/мл).
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector