Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Создавать вакцины против новых инфекций, используя старые испытанные технологии, удается не всегда. Некоторые микроорганизмы, например, вирус гепатита B, практически невозможно вырастить в культуре клеток, чтобы получить инактивированную вакцину.

Во многих случаях вакцины на основе убитых микробов оказываются неэффективными, а живые вакцины — слишком опасными. Большие надежды возлагались на вакцины, полученные на основе рекомбинантных белков-антигенов (именно таким способом в 1980-е годы создали вакцину, защищающую от гепатита B).

Но сейчас стало очевидным, что многие рекомбинантные вакцины вызывают слабый иммунный ответ. Вероятно, причина в том, что в таких препаратах содержится «голый» белок и отсутствуют другие молекулярные структуры, часто необходимые для запуска иммунного ответа.

Чтобы рекомбинантные вакцины вошли в практику, нужны вещества-усилители (адъюванты), стимулирующие антигенную активность.

За последние 10 лет сформировалось новое направление — генетическая иммунизация. Его называют также ДНК-вакцинацией, поскольку в организм вводят не белок-антиген, а нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), в которой закодирована информация о белке.

Реальная возможность использовать эту технологию в медицине и ветеринарии появилась в середине 90-х годов прошлого века. Новый подход достаточно прост, дешев и, самое главное, универсален. Сейчас уже разработаны относительно безопасные системы, которые обеспечивают эффективную доставку нуклеиновых кислот в ткани.

Нужный ген вставляют в плазмиду (кольцо из ДНК) или в безопасный вирус. Такой носитель-вектор проникает в клетку и синтезирует нужные белки. Трансформированная клетка превращается в «фабрику» по производству вакцины прямо внутри организма. Вакцинная «фабрика» способна работать длительный период — до года.

ДНК-вакцинация приводит к полноценному иммунному ответу и обеспечивает высокий уровень защиты от вирусной инфекции.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

ДНК-вакцинация заключается в том, чтобы ввести фрагмент ДНК, кодирующий защитные антигены и цитокины, непосредственно в мышечную ткань. «Заразность» большинства вирусов во многом определяется их структурными белками. Плазмида (кольцевая молекула ДНК) с генами таких белков, введенная в мышцу, стимулирует иммунный ответ, который препятствует развитию заболевания.

Используя один и тот же плазмидный или вирусный вектор, можно создавать вакцины против различных инфекционных заболеваний, меняя только последовательность, кодирующую необходимые белки-антигены.

При этом отпадает необходимость работать с опасными вирусами и бактериями, становится ненужной сложная и дорогостоящая процедура очистки белков.

Препараты ДНК-вакцин не требуют специальных условий хранения и доставки, они стабильны длительное время при комнатной температуре.

Уже разработаны и испытываются ДНК-вакцины против инфекций, вызываемых вирусами гепатитов B и C, гриппа, лимфоцитарного хориоменингита, бешенства, иммунодефицита человека (ВИЧ), японского энцефалита, а также возбудителями сальмонеллеза, туберкулеза и некоторых паразитарных заболеваний (лейшманиоз, малярия). Эти инфекции крайне опасны для человечества, а попытки создать против них надежные вакцинные препараты классическими методами оказались безуспешными.

ДНК-вакцинация — одно из самых перспективных направлений в борьбе с раком. В опухоль можно вводить разные гены: те, что кодируют раковые антигены, гены цитокинов и иммуномодуляторов.

Вакцины «по расчету»: «обратная вакцинология»

Бурное развитие в последнее десятилетие геномики, биоинформатики и протеомики привело к совершенно новому подходу в создании вакцин, получившему название «обратная вакцинология» (reverse vaccinology). Этот термин четко выражает суть нового технологического приема.

Если раньше при создании вакцин ученые шли по нисходящей линии, от целого микроорганизма к его составляющим, то теперь предлагается противоположный путь: от генома – к его продуктам. Такой подход основан на том, что большинство защитных антигенов — белковые молекулы.

Обладая полными знаниями обо всех белковых компонентах любого возбудителя заболевания, можно определить, какие из них годятся в качестве потенциальных кандидатов на включение в состав вакцинного препарата, а какие — нет.

Чтобы определить нуклеотидную последовательность полного генома инфекционного микроорганизма, достаточно если не нескольких дней, то нескольких недель.

Причем предварительная работа по получению «библиотек» клонов ДНК возбудителя уже давно выполняется с помощью стандартных наборов ферментов.

Современные приборы для автоматического определения нуклеотидной последовательности в молекулах ДНК позволяют проводить в год до 14 млн реакций. Полная расшифровка генома и его описание со списком кодируемых белков занимают несколько месяцев.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Рекомбинантные технологии позволяют получить ослабленный вирус за более короткое время. Для этого из генома вируса «вырезают» ген, который отвечает за вирулентность (болезнетворные свойства), но не влияет на размножение и иммуногенность. Получившийся безобидный вирусный штамм используют для изготовления вакцины.

Проведя компьютерный (in silico) анализ генома, исследователь получает не только список кодируемых белков, но и некоторые их характеристики, например, принадлежность к определенным группам, возможная локализация внутри бактериальной клетки, связь с мембраной, антигенные свойства.

Другой подход к отбору кандидатов в вакцины — определение активности отдельных генов микроорганизмов. Для этого одновременно измеряют уровень синтеза матричной РНК всех продуктов генов, производимых в клетке. Такая технология позволяет «вычислить» гены, вовлеченные в процесс распространения инфекции.

Третий подход основан на протеомной технологии. Ее методы дают возможность детализировать количественную и качественную характеристики белков в компонентах клетки. Существуют компьютерные программы, которые по аминокислотной последовательности могут предсказать не только трехмерную структуру изучаемого белка, но и его свойства и функции.

Используя эти три метода, можно отобрать набор белков и соответствующие им гены, которые представляют интерес для создания вакцины. Как правило, в эту группу входит около 20-30% всех генов бактериального генома.

Для дальнейшей проверки нужно синтезировать и очистить отобранный антиген в количествах, необходимых для иммунизации животных. Очистку белка проводят с помощью полностью автоматизированных приборов.

Используя современные технологии, лаборатория, состоящая из трех исследователей, может в течение месяца выделить и очистить более 100 белков.

Впервые принцип «обратной вакцинологии» использовали для получения вакцины против менингококков группы B.

За последние годы таким способом разработаны вакцинные препараты против стрептококков Streptococcus agalactiae и S.

pneumoniae, золотистого стафилококка, бактерии Porphyromonas gingivalis, вызывающей воспаление десен, провоцирующего астму микроорганизма Chlamydia pneumoniae и возбудителя тяжелой формы малярии Plasmodium falciparum.

Важно не только создать вакцину, но и найти наилучший способ ее доставки в организм.

Сейчас появились так называемые мукозальные вакцины, которые вводятся через слизистые оболочки рта или носа либо через кожу.

Преимущество таких препаратов в том, что вакцина поступает через входные ворота инфекции и тем самым стимулирует местный иммунитет в тех органах, которые первыми подвергаются атаке микроорганизмов.

Терапевтические вакцины

Обычные вакцины предназначены для предупреждения болезни: прививку делают здоровому человеку, чтобы заранее «вооружить» организм средствами борьбы с инфекцией (исключение — разработанная Пастером вакцина против бешенства, которую применяют после укуса бешеным животным; ее эффективность объясняется длительным инкубационным периодом этого вирусного заболевания). Но в последнее время отношение к вакцинам исключительно как к профилактическому средству изменилось. Появились терапевтические вакцины — препараты, которые индуцируют иммунный ответ у больных и тем самым способствуют выздоровлению или улучшению состояния. Такие вакцины нацелены на хронические заболевания, вызванные бактериями или вирусами (в частности, вирусами гепатитов B и C, вирусом папилломы, ВИЧ), опухоли (прежде всего, меланому, рак молочной железы или прямой кишки), аллергические или аутоиммунные болезни (рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит).

Существующие терапевтические вакцины для лечения хронических воспалительных заболеваний, вызванных бактериями или вирусами, получают классическими методами. Такие вакцины способствуют развитию иммунитета к входящим в их состав микроорганизмам и активизируют врожденный иммунитет.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Один из традиционных методов ослабления вирусов — выращивание в животных клетках. Сначала болезнетворный вирус выделяют из культуры человеческих клеток. Выращивание вне человеческого организма само по себе ослабляет «заразность» вируса.

Для некоторых заболеваний, например, краснухи, такой подготовки бывает достаточно, чтобы получить вакцинный штамм. Однако в общем случае для того, чтобы получить ослабленный штамм, вирус пересаживают в среду, приготовленную из клеток животных. Благодаря мутациям вирус приспособится к новой среде обитания.

Для создания вакцины ученые отбирают те разновидности вирусов-мутантов, которые плохо растут на человеческих клетках, а значит, не могут вызвать болезнь.

Одна из важнейших целей разработчиков терапевтических вакцин — ВИЧ-инфекция. Уже проведена серия доклинических и клинических испытаний нескольких препаратов. Их способность вызывать развитие клеточного иммунитета у здоровых людей не вызывает сомнений. Однако убедительных данных о том, что вакцины подавляют размножение вируса у больных, пока нет.

Большие надежды в лечении нарушений иммунитета при раковых заболеваниях связаны с дендритными вакцинами. Их делают на основе дендритных клеток — особой разновидности лейкоцитов, которые занимаются поиском потенциально опасных микроорганизмов.

Дендритные клетки «патрулируют», прежде всего, слизистые оболочки и кожу, то есть органы, контактирующие с внешней средой.

Встретив патогенную бактерию или вирус, дендритные клетки поглощают «чужака» и используют его белки-антигены для того, чтобы активизировать иммунную систему на борьбу с врагом.

Схема изготовления дендритной вакцины такова: из крови больного выделяют клетки, которые дают начало дендритным клеткам, и размножают их в лабораторных условиях. Одновременно из опухоли пациента выделяют белки-антигены.

Читайте также:  Видео уроки по акушерству: методы исследование беременных перед родами

Дендритные клетки некоторое время выдерживают вместе с опухолевыми антигенами, чтобы они запомнили образ врага, а затем вводят больному. Такая стимуляция иммунной системы заставляет организм активно бороться с опухолью.

Дендритные вакцины можно использовать для лечения как спонтанных опухолей, так и новообразований, ассоциированных с вирусами. Первые результаты испытания дендритных противораковых вакцин на людях (в небольших группах пациентов IV стадии заболевания) показали безвредность таких вакцин, а в ряде случаев зарегистрирован положительный клинический эффект.

У мышей дендритные вакцины помогают предупредить повторное развитие карциномы после удаления опухоли. Это позволяет надеяться, что они будут эффективны для продления безрецидивного периода онкологических больных после хирургического вмешательства.

В XX веке успехи вакцинологии определялись, прежде всего, победами над очередной опасной инфекцией. С развитием наших представлений о работе иммунной системы сфера применения вакцин постоянно расширяется.

Есть надежда, что в XXI веке вакцины помогут снизить заболеваемость диабетом, миокардитом, атеросклерозом и другими «неинфекционными» болезнями.

Полным ходом идет разработка препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии онкологических заболеваний.

Методы культивирования вирусов

Для выращивания клеточных культур используют питатель­ные среды сложного состава, включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

факторы роста. Клетки чрезвычайно чувствительны к измене­нию рН среды. Для контроля рН в среды добавляют индикатор.

Большинство клеточных:, культур растет в виде монослоя (плас­та, состоящего из одного слоя клетк), прочно прикрепляясь к поверхности контейнера для культивирования — пробирки, пластикового планшета или матрас) (флакон 4-гранной фор­мы). Некоторые типы клеток способы расти также в суспен­зии.

Приготовление первичной культты клеток включает не­сколько последовательных этапов: измельчение ткани, разъ­единение клеток путем трипспозиции отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови).

При оседании клетки довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде Монослоя. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток ее заражают мате­риалом, содержащим вирусы. Упо­мянутые микробы проникают внутрь клеток, где и размножа­ются.

В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.

Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое дей­ствие (ЦПД) на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, появлением вакуолей или включений, представляющих собой внутриклеточные скопления вирусов, образованием ощцития) и нарушением их функций.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами, а также обладают сравнитель­но высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Они пригодны для некоторых вирусов, патогенных для человека.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а. также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) исполь­зуют 8—12-дневные куриные эмбрионы.

К недостаткам данно­го метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие большого количеству белков и других соедине­ний, затрудняющих последующую очистку возбудителя при изготовлении различных препаратор

Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку или в желточный мешок куриного эмбриона (рис.).

Для заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой (границы ее заранее обво­дят карандашом при просвечивании яйца) проделывают не­большое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или специ­ального буравчика. Шприцем вводят 0,1—0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2—3 мм ниже границы воздуш­ной камеры.

Отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48—72 ч ин­кубации при 37 °С).

После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше очерчен­ной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость.

Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматрива­ют хорион-аллантоисную оболочку вокруг места заражения, от­мечая наличие или отсутствие очагов поражения — геморрагии, бляшек и др. Затем пастеровской пипеткой прокалывают хори­он-аллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хо­рион-аллантоисную оболочку, дважды промывают ее изотони­ческим раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных, их возраст определяют репродуктивную способ­ность вирусов. Во многих случаях только новорожденные жи­вотные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки к вирусам Коксаки).

Преимущество метода культивирования облигатных внутриклеточных паразитов в ор­ганизме лабораторных животных перед другими состоит в воз­можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуци­руются в культуре клеток или эмбрионе.

К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма по­допытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры кле­ток для получения чистой культуры данного вируса, что уве­личивает сроки исследования.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Методы индикации вирусов. Для демонстрации при­сутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов.

I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопаттескому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из­менениям клеток.

а) Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. б)Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош­ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ­ные островки.

Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле­ток.

ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не­которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4^-6-й день).

Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп­ределения их видовой принадлежности.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм.

Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара­тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных флюорохромами. В послед­нем случае используют люминесцентную микроскопию.

Для исследования морфологии контаминированных клеток используют специальный инвертированный микроскоп, у ко­торого осветитель располагается сверху, а объективы — снизу от предметного столика.

С помощью такого прибора можно оценивать морфологию клеток, растущих в виде монослоя на поверхности контейнера для культивирования. Морфологичес­кие изменения клеток выявляют при микроскопическом ис­следовании культуры с помощью объектива 8х или 40х.

При сравнении клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с незараженными клетками в контрольной пробе отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток либо другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса.

Для более детального изучения ЦПД в контейнер для культивирования помещают покровное стекло, на котором образуется монослой. В дальнейшем стекло извлекают, зараженные клетки фиксиру­ют и готовят микроскопический препарат, который окрашива­ют флюорохромами и т.д.) и изучают иммерсионным методом.

ЦПД вирусов можно также продемонстрировать с помощью «цветной пробы»: метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вы­зывает изменение цвета индикатора, присутствующего в культуральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.

II. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемаг-глютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты.

Для постановки реакции гемад­сорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клет­ки промывают изотоническим раствором хлорида натрия.

На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилип­шие эритроциты.

III. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обна­ружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жид­кости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Гемагглютинацию — «склеивание» эритроцитов разных видов животных (кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин.Для постановки реакции гемагглюти­нации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов.

В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов.

После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жид­кость отсасывают и разливают по 0,5 мл в пробирки или лунки плексигласовой пластины (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов: (++++) — выражен­ная гемагглютинация — тонкая пленка склеившихся эритроци­тов на дне пробирки, имеющая вид зонтика, (+++) — наличие просветов в пленке, (++) — наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов, (+) — хлопьевидный оса­док эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютиниро­ванных эритроцитов, (—) — резко очерченный осадок эритро­цитов, неотличимый от контроля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольных указы­вает на содержание вируса в исследуемой жидкости. Для оп­ределения титра РГА ставят реакцию с разведениями вируссодержащей жидкости 10″1, 10~2, 10~3 и т.д. За титр РГА при­нимают максимальное разведение, при котором наблюдается гемагглютинация (++). Титр РГА характеризует активность вируса и используется при постановке РТГА.

Для количественного обнаружения вирусных частиц ис­пользуют методы титрования.Титр вируса можно определить в реакции гемагглютинации с 10-кратными разведениями куль­туральной среды, или материала из куриного эмбриона, или по ЦПД в культуре клеток.

Читайте также:  Функциональное нарушение зрения. Обследование функциональных нарушений зрения.

В последнем случае клетки культуры заражают 10-кратными разведениями материала, содержащего вирус. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных куль­тур.

Титр вируса выражают количеством цитопатических (инфекционных) доз (ИД5о)

Более точным количествен­ным методом учета отдель­ных вирусных частиц являет­ся метод бляшек. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тон­ким слоем агара.

После ин­кубирования посевов в тече­ние нескольких суток на по­верхности агара появляются просветленные участки опре­деленной формы (бляшки), представляющие собой участ­ки погибших клеток в сплош­ном монослое культуры клеток.

Каждая бляшка образуется при размножении одной ви­русной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим ме­тодом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Размеры, морфология и сроки появления бляшек разли­чаются не только у разных видов вирусов, но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Перечисленные признаки используют для селекции штаммов и получения так называе­мых чистых линий вирусов.

ПОИСК

    Культивирование, или выращивание, вирусов — процедура более сложная, чем выращивание бактерий, потому что вирусы растут и размножаются только внутри живых клеток. Можно инфицировать целый организм, например растение или животное, однако сейчас стараются, где это возможно, использовать культуры клеток или тканей (рис. 12.11).

Раньше использовали метод культивирования определенных вирусов в куриных эмбрионах во время их роста внутри яйца. Сходная процедура выращивания вирусов в амниотической жидкости, окружающей куриный эмбрион, применялась при изготовлении вакцин против свинки и гриппа. [c.56]

Рис. 12.11. Культуры клеток для выращивания вирусов, инкубируемые в стерильной термальной комнате. Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

    Б. Выращивание вируса в эмбрионах [c.307]

    Использование микроносителей делает сейчас свои первые шаги, но их применение представляется чрезвычайно перспективным для производства клеток в промышленных масштабах, особенно в области выращивания вирусов и производства клетками различных продуктов, которые могут выделяться из культуральной среды, получаемой простым оседанием бус с клетками. [c.43]

    Выращивание вирусов на комарах и их личинках [c.81]

    Биоавтографические методы разработаны также для противовирусных и противофаговых антибиотиков [43—47] (для выращивания вирусов использовали культуры тканей), В качестве [c.9]

    Поскольку в настоящее время большая часть вирусных заболеваний лечится путем введения антисыворотки, выращивание вирусов имеет важное значение как для идентификации вирусов (разд. 14.

3), так и для их использования в получении вакцин.

Эти задачи решаются большей частью с использованием клеточных культур, и многие вирологические отделения клиник обеспечены оборудованием для выращивания клеток и получения вирусов в больших количествах. [c.15]

    Методы выделения вирусов простого герпеса довольно сложны по сравнению с другими вирусами.

Более того, метод, хорошо зарекомендовавший себя при работе с одним штаммом вируса на определенной клеточной линии, может оказаться неприемлемым для других штаммов на той же линии или того же штамма вируса на других клетках. Поэтому мы опишем два метода.

Мы показали, что первый метод можно успешно применять для получения штамма HFEM и некоторых других при условии, что для выращивания вируса используют клетки Нер-2. Данный метод прост и позволяет получать вирусные препараты высокой степени чистоты.

Второй метод позволяет достигнуть удовлетворительных результатов со всеми штаммами вируса и различными типами клеток.

Для выбора оптимальных условий получения высокого выхода вируса и качественного исходного материала для дальнейшей очистки следует вначале изучить кривую роста исследуемого вирусного штамма на различных линиях клеток. На рис. 10.4 показана кривая роста штамма HFEM на клетках Нер-2 при высокой множественности инфекции и культивировании клеток при 32 °С. Оптимальные условия, которые требуются для приготовления исходного материала, в общих чертах описаны в разд. 2.5.1. [c.279]

    В 20-х годах Каррель (1924) использовал культуру тканей для выращивания вируса саркомы Роуса. [c.4]

    Поскольку вирусы являются внитриклеточными паразитами, их нельзя обнаружить с помощью питательной среды, как это делается в случае бактерий. Для их обнаружения необходимо использовать культуру тканей с линией клеток, соответствующей данному вирусу.

Главная трудность при выращивании вирусов в культурах ткани состоит в том, что присутствующие в пробе бактерии могут легко размножиться и уничтожить эту культуру. Поэтому, чтобы предотвратить разрастание бактерий, к питательной среде добавляют антибиотики.

Методы выращивания вирусов на культуре ткани носят достаточно сложный и специальный характер, и в дальнейшем мы их не будем обсуждать, тем более, что в этой области нет недостатка в информации, которую при необходимости читатель может найти в соответствующей литературе.

[c.334]

    Выбор материала. Материал для получения вируса выби-рают в зависимости от содержания в нем вируса, колич е-ства и природы примесей, находящихся в этом материале. Это зависит от специфики вирусной инфекции и свойств ткани зараженцого хозяина.

Естественно, что материал, в котором вирус находится вне клеток, предпочтительнее, чем тот, где вирус находится внутри клеток. Однако среди источников внеклеточного вируса, например, аллантоисная жидкость доступна только для миксовирусов, нлазма крови — для вирусов группы лейкозов и афтозная жидкость — для вируса Я1цура.

Для многих вирусов животных источником является культуральная вируссодержащая суспензия, получаемая при выращивании вирусов in vitro. Из тканей больного животного можно выделять только те вирусы, которые слабо или совсем не размножаются в клеточной культуре ткани.

Очистка мелких вирусов животных из ткани более сложна, так как в гомогенате клеток, кроме частиц вируса, присутствуют субклеточные частицы—рибосомы (293) с близкими коэффициентами седиментации  [c.27]

    В качестве примера выращивания вируса с высоким титров в культуре клеточной ткани приводим работу Ройзмана и Gпиpf [694]. [c.28]

Смотреть страницы где упоминается термин Выращивание вируса: [c.186]    [c.298]    [c.398]    [c.141]    [c.298]    [c.54]    [c.72]   
Смотреть главы в:

Методы исследований в иммунологии -> Выращивание вируса

© 2022 chem21.info Реклама на сайте

4. Выращивание вирусов в культурах клеток

В
настоящее время для выделения и
размножения вирусов животных используются
первичные культуры, штаммы клеток и
установившиеся клеточные линии. В общих
чертах процедура оказывается одинаковой
для всех вирусов.

Среду
удаляют с клеточного монослоя и монослой
промывают сбалансированными буферными
солевыми растворами (СБСР) или
фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для
удаления ингибиторов (антител), которые
могут присутствовать в среде. Вирусные
частицы суспендируются в небольшом
количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются
клетками в течение 30 – 60 мин. После
этого солевые растворы заменяются
свежей средой.

Заражение
вирусами культивируемых клеток вызывает
характерные морфологические изменения
клеток. Конечные дегенеративные клеточные
процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ)
обнаруживаются только через несколько
недель роста в присутствии вирусов, но
в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже
через 12 ч. Детали морфологических
изменений оказываются различными в
случае разных вирусов.

Если
вместо продуктивной инфекции вирус
вызывает клеточную трансформацию, то
это также сопровождается характерными
изменениями морфологии и особенностей
роста клеток.

Предосторожности
при работе с зараженными вирусами
клетками

Вирусы
оказывают цитопатогенное действие и
служат этиологическими агентами при
многих заболеваниях человека и животных.

Кроме того, многие вирусы (например,
онкорнавирусы, вирус герпеса тип II,
аденовирусы, вирус полиомы и SV40) являются,
по-видимому, агентами, вызывающими
развитие опухолей у животных.

Из-за
способности вирусов проходить через
бактериальные фильтры бывает трудно
исключить вирусы из культур незараженных
клеток при наличии вирусных суспензий,
когда возможна передача вируса через
воздух культуральной комнаты.

Указанные
ниже меры предосторожности носят самый
общий характер и применимы только в тех
случаях, когда вирусы не представляют
какой-либо особой опасности.

При
использовании особо опасных вирусов,
представляющих опасность для здоровья
сотрудников лаборатории или людей и
животных окружающего мира, следует
применять дополнительные меры
предосторожности.

К вирусам, представляющим
особую опасность, относятся вирусы
ньюкаслской болезни, вирусы ящура,
вирусы везикулярного стоматита, вирусы
оспы, вирусы бешенства, вирусы герпеса
типа В и так далее. Кроме того, нельзя
быть уверенным, что даже такие вирусы,
как SV40, не представляют опасности для
человека.

  1. Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна использоваться специальная комната или группа комнат.

  2. Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры. Следует принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих контейнеров не были загрязнены вирусными частицами.

  3. При работе с вирусами должны быть использованы специальные защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования.

  4. Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно выносить из помещения, предназначенного для работы с вирусами.

  5. Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специальный бак для автоклавирования.

  6. Оборудование для хранения и обработки вирусного материала должно размещаться внутри помещения для работы с вирусами.

  7. Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми автоклавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

Читайте также:  Серотонин. Функции серотонина при воспалении бронхов.

Обнаружение
вирусов

Обнаружить
присутствие вирусов и определить их
количество можно с помощью целого ряда
различных тестов, например:

1)
Активность вируса измеряется путем
определения количества содержащего
вирус материала, необходимого для того,
чтобы вызвать специфическую реакцию в
организме хозяина. Индуцируемая вирусом
реакция может происходить по типу «все
или ничего» (т.е.

наличие или отсутствие
инфекции), а может быть выражена
количественно, например продолжительностью
времени, необходимого для проявления
инфекции, или числом поражений в слое
чувствительных клеток.

Количественное
определение вирусной активности
называется титрованием.

Наименьшее
количество вируса, способное вызвать
соответствующую реакцию, называется
инфекционной
единицей,

и титр исходной вирусной суспензии
выражается числом инфекционных единиц,
приходящихся на единицу объема.

Например,
если минимальное количество суспензии
вируса гриппа, вызывающее у мыши пневмонию
при интраназальном введении суспензии
ткани инфицированного легкого в
разведении 1:106
равно
0,1 мл, то это значит, что титр вируса
гриппа в исходной суспензии ткани
легкого равен 107
инфекционным
единицам на 1 мл-1/(10~1–10–6) =107.

Как
правило, обязательным компонентом
метода титрования вируса является тест,
позволяющий оценить результат инокуляции
как положительный или отрицательный.

Например, при титровании вирусов животных
таким тестом может быть наличие или
отсутствие видимых поражений в культуре
клеток, воспалительная реакция на месте
инокуляции вируса в кожу или роговицу,
параличи, возникающие у животного в
результате введения вируса в мозг, и
т.д.

Иногда размножение вируса можно
выявить и в отсутствие видимой реакции
со стороны организма-хозяина: на пример,
заражение куриных эмбрионов миксовирусами
можно обнаружить по появлению
гемагглютининов в аллантоисной жидкости.

Наилучшие
результаты дают методы титрования, в
основе которых лежит подсчет числа
дискретных поражений на определенной
площади слоя клеток, зараженных известным
количеством содержащего вирус материала.

В случаях когда число чувствительных
к вирусу и доступных для него клеток
можно практически считать бесконечно
большим, как, например, при заражении
фагом однослойной культуры бактерий
на питательном агаре или при заражении
вирусом сплошной однослойной культуры
животных клеток, поражения, вызываемые
вирусом, или бляшки, образуемые фагом,
в данном смысле подобны колониям бактерий
на плотной питательной среде. Как число
этих колоний пропорционально числу
бактериальных клеток, содержащихся в
титруемом препарате, так и число бляшек
прямо пропорционально количеству
вируса, добавленному к однослойной
культуре образование зараженными
клетками вирусных частиц, которые могут
быть идентифицирован, например, по
природе нуклеиновых кислот и симметрии
частиц.

2)
Образование зараженными клетками
нуклеиновых кислот, которые могут
обладать характерной плотностью при
центрифугировании в градиенте плотности
или характерным размером при электрофорезе
в агарозном геле или центрифугировании
в градиенте концентрации сахарозы.

3)
Образование зараженными клетками или
трансформированными клетками характерных
антигенов, которые могут быть визуализованы
с помощью окрашивания флуоресцирующими
специфическими антителами либо вызывать
изменения в клеточной мембране, приводящие
к адсорбции гема.

В прямом методе
антитела, полученные к вирусным антигенам,
сочетаются с флуорохромом и используются
для окраски зараженных клеток.
Положительная реакция (желто-зеленый
цвет в люминесцентном микроскопе)
указывает на присутствие в клетках
вирусных антигенов.

Этот метод,
следовательно, может быть использован
для выявления клеточной трансформации,
когда антитела вырабатываются, например,
против ранних антигенов вируса SV40, или
для выявления образования зрелых
вирусов, когда получаются антитела
против капсидных белков. В непрямом
методе антитела не сочетаются с
флуорохромом.

Вместо этого после
взаимодействия антител с антигенами в
фиксированных препаратах клеток к ним
добавляются антигамма-глобулиновые
антитела, конъюгированные с флуорохромом.
Этот метод более чувствителен и позволяет
избежать конъюгации каждого индивидуального
антитела с флуоресцентным красителем.

Так, одни и те же флуоресцентные антитела
к антителам кролика (полученные у овец
против кроличьих гамма-глобулинов)
могут быть использованы для окраски
любых антител, образующихся у кроликов
и взаимодействующих с вирусными
антигенами в продуктивно зараженных
или трансформированных клетках.

Еще
более непрямой, но значительно более
чувствительный метод, не требующий
использования флуоресцентного микроскопа
– пероксидазный – антипероксидазный
метод. Согласно этому методу, кроличьи
антитела взаимодействуют с антигенами
фиксированных клеток и затем покрываются
антителами козы к иммуноглобулинам
кролика, конъюгированными с комплексами
пероксидазы хрена и кроличьей
антипероксидазы. После этого препараты
обрабатывают диамино-бензидином и
перекисью водорода; коричневая окраска
указывает на присутствие антигенов.

4)
Наличие антигенов на вирусных частицах
может приводить к реакциям гемагглютинации,
позволяющим проводить количественную
оценку. У многих вирусов имеются антигены,
которые могут адсорбироваться на
эритроцитах и вызывать их слипание. При
взаимодействии большого количества
вирусных частиц и эритроцитов образуется
сеть клеток, и суспензия агглютинирует,
т.е.

эритроциты выпадают в осадок.
Существует некоторая специфичность,
заключающаяся в том, что определенные
вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов
определенных животных, но если обнаружена
активная комбинация, то гемагглютинация
становится быстрым тестом, позволяющим
определить титр вируса.

Кровь отбирают
в гепаринизированный шприц и эритроциты
промывают трехразовым переосаждением
в 0,85%-ном NaCl при 200 g в течение 10 мин.
Окончательный осадок эритроцитов
суспендируют в 200-кратном объеме
0,85%-ного раствора NaCl. Удобнее всего
проводить тест на гемагглютинацию в
микротитровальных пластинках.

В серию
лунок микротитровальной пластинки
вносят по 25 мкл 0,85%-ного NaCl или ФСБ; в
первую лунку вносят 25 мкл суспензии
вируса, и смесь перемешивают (разведение
1:2). 25 мкл переносят затем из первой лунки
во вторую (разведение 1:4) и так далее, до
конечного разведения 1:2048.

После этого
в каждую лунку добавляют по 25 мкл
суспензии эритроцитов, смесь перемешивают
и оставляют при 4°С, комнатной температуре
или 37°С до наступления гемагглютинации
(1–2 ч). В лунках, где произошла
агглютинация, осадок эритроцитов имеет
неправильную форму, а в лунках, где
гемагглютинации не было, клеточный
осадок образует компактную точку на
дне лунки.

Разведение в последней лунке,
в которой происходила гемагглютинация,
рассматривается как титр, и этому
разведению приписывается значение 1
гемагглютинирующей единицы (ГАЕ).
Предшествующее разведение содержит
соответственно 2 ГАЕ и так далее.

  • 5)
    Образование зараженными клетками
    характерных ферментов, или ферментов,
    легко отличаемых по свойствам от
    соответствующих ферментов клеток-хозяев.
  • Культивирование
    пикорнавирусов на примере получения
    полиовируса типа 3 в культуре клеток
    HeLa
  • В
    качестве конкретной методики
    культивирования вирусов можно привести
    способ выращивания полиовируса в
    перевиваемых клетках.
  • Все
    процедуры проводятся в стерильных
    условиях.
  1. Определенные сублинии клеток HeLa (например, HeLa S3) могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция (например, CaS2MEM). Для эффективного заражения существенно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспензии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и ресуспендируют в среде CaS2MEM до концентрации ~ 2.107 кл/мл (~1/20 исходного объема).

  2. К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации 10–50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке в течение 1 ч при 35°С.

  3. Суспензию разводят той же средой до концентрации 2.106 кл/мл и добавляют 100 мкКи [3Н] – уридина.

  4. Клеточную суспензию инкубируют в течение 8 ч, после чего осаждают клетки низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и промывают один раз фосфатным буферным раствором (PBS), не содержащим ионов магния и кальция.

  5. Клетки ресуспендируют в PBS (5–107кл/мл) и проводят три цикла замораживания – оттаивания.

  6. Остатки клеток удаляют центрифугированием.

  7. Супернатант сохраняют для дальнейшей очистки.

Список
литературы

  1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. – М.: Мир, 1983, 263 с.

  2. Вирусология. Методы. / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988, 344 с.

  3. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л.: Медицина, 1976, 224 с.

  4. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Калмыкова Т.П. Культивирование клеток и тканей животных. – Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с.

  5. Животная клетка в культуре под. ред. Л.П. Дьяконова, В.И. Ситькова. – М.: 2000

  6. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. – М.: Мир, 1989, 333 с.

  7. Руководство по ветеринарной вирусологии. / Под ред. В.Н. Сюрина. – М.: Колос, 1965, 687 с.

  8. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных. – М.: Колос, 1976, 303 с.

  9. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных. – М.: Мир, 1977, т. 1, 447 с.

Размещено
на Allbest.ru

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector