Люминесцентная микроскопия. Электронная микроскопия. Радиоавтография. Конфокальная микроскопия.

Люминесцентная микроскопия — исследование, связанное со свечением объектов. Большинство из них не видны, т.к. используется ультрафиолетовое излучение. В некоторые образцы добавляют красители, взаимодействующие с соединениями.

Люминесцентная микроскопия — это исследование объектов, окрашенных специальными красителями.

Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.

В 1930-х гг. ученые-биологи стали окрашивать бактерии и клетки флюорохромами, способствующими свечению. Был придуман микроскоп для подобных исследований.

Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.

Что такое люминесцентная микроскопия

При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться.

Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.

Методы исследования

В люминесцентной микроскопии применяются различные методы исследований. Микробиологи используют флюорохромирование и реакцию иммунной флуоресценции. Вторую часто называют также методом флуоресцирующих тел.

Существует другой вид изучения молекул — конфокальная микроскопия. Она дает возможность исследовать частицы на той или иной глубине.

Флюорохромирование

Метод является распространенным в исследовании органов и тканей человека. Вторичную люминесценцию получают, обрабатывая образцы флюорохромами. Каждый предназначен для каких-либо целей.

Акридиновый оранжевый применяется для диагностики раковых заболеваний и инфаркта на ранних сроках. Ишемические участки имеют зелено-желтое свечение. Флюорохром применяют, чтобы выявлять кислые мукополисахариды. Если он взаимодействует с ДНК, появляется зеленая флуоресценция. Для реакции красителя на РНК характерна красная.

Флюорохромирование — это обработка флуорохромом с целью увеличения контрастности свечения.

Кофеин 5 и родамин применяются для определения гликогена в печени. Фосфин 3Р — для выявления липидов. Аналогичными свойствами обладает смесь растворов бензпирена и кофеина. Второй должен быть насыщенным. При наличии липидов появляется бело-голубая люминесценция.

Тиофлавин окрашивает особые белковые соединения при амилоидозе. Для него характерно зеленое свечение. При такой болезни внутренних органов в них образуются амилоиды.

Морин используют для определения содержания кальция в тканях. После обработки спиртовым раствором образцы имеют зеленую люминесценцию.

Черный солохром применяют для выявления алюминия. Он сопровождается желто-оранжевым свечением.

Родамин 6Ж необходим для определения сурфактанта в тканях легких. На его наличие указывает оранжевая люминесценция.

Реакция иммунной флюоресценции

Благодаря методу флуоресцирующих тел выявляют антитела, гормоны, продукты метаболизма и др. Реакция иммунной флюоресценции определяет рак и инфекции на ранних стадиях. Возможности таких исследований расширило развитие иммунохимии. Сейчас небелковые соединения в тканях выявляют искусственными гаптенами.

Особенности исследования отдельных молекул и микроорганизмов

В теории можно сделать изображение какой-либо молекулы, используя оптические устройства, красящие вещества, ультрафиолет и светофильтр. Объект исследования должен флюоресцировать на темном фоне, а остальные частицы нет. Их цветовое значение близко к нулю.

Детектор микроскопа распознает не только излучение нужной молекулы, но и реагирует на иные фотоны. Они попадают на люминесцентное устройство от других источников света.

Сейчас для детального анализа образца применяют оптико-механические приборы и электронно-вычислительную технику. С помощью современного программного обеспечения ее подключают к монитору. На него выводится трехмерное изображение. После получения информации о координатах новых частиц компьютер микроскопа запоминает их расположение. Они исчезают с экрана.

Для осуществления наблюдения нужен стереомикроскоп.

Получить изображение объекта легко с помощью оптики, дополнительной техники и ПО. Качество снимка будет ниже, чем при применении люминесцентного устройства. Иногда для наблюдений такой способ допускается, т.к. не всегда требуется сверхвысокое разрешение.

Для осуществления наблюдения понадобятся:

• простой стереомикроскоп;
• источник возбуждения излучения;
• светофильтры для блокировки света возбуждения и удерживания свечения объектов, создающих ненужный фон;
• система для проецирования полученной картинки на фотокамеру;
• компьютер с ПО для запечатления и обработки изображений.

Сфера применения люминесцентной микроскопии

Флюоресцентный микроскоп незаменим в биологии, медицине, а также смежных областях. Он позволяет проводить точные исследования клеток и тканей организмов. Главным преимуществом люминесцентной микроскопии считается возможность увидеть образец изнутри. Остальные приборы изучают лишь поверхность объекта.

Метод люминесцентной микроскопии применяется для исследования клеток организма.

Флюоресцентные устройства часто используют криминалисты. Они сравнивают образцы тканей и веществ для установления их принадлежности. Свечение применяется в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Оно помогает выделять бактерии и клеточные структуры из-за способности взаимодействовать лишь с нужными красителями.

Явление флуоресценции открыли в 1852 г., но громоздкие микроскопы имели плохое разрешение. Новейшие технологии позволяют использовать люминесцентные ферментные метки, делающие устройства компактными. Их разрешение обладает высоким качеством.

Метод люминесцентной микроскопии является незаменимым для:

• анализа кровяных клеток костного мозга;
• диагностики инфекционных болезней;
• исследования клеток организма и глазных тканей сетчатки.

Применение эффекта свечения нужной длины волны у молекул помогает распознать вирусы и бактерии с высочайшей точностью.

Другие микроскопы выявляют только наличие инфекции. Благодаря разрешению 1 нм получают четкие и яркие изображения.

Принцип работы люминесцентного микроскопа

Принцип работы устройства заключается в испускании излучения объектом исследования вслед за светом возбуждения — электромагнитной волной с ультрафиолетовым диапазоном. Иногда используются зеленые или синие лучи. Они являются видимыми.

Принцип работы заключается в испускании излучения объектом исследования.

В микроскоп устанавливают зеркало, направляющее на исследуемый образец поток света. Его источником является ксеноновая или ртутная лампа. Отдельные лучи поглощаются материалом, остальные отражаются и направляются в пространство.

Под ним подразумевается и глаз человека. Отраженное свечение источника забирает слабое излучение — собственное свечение микрообъекта. Для его отделения от ультрафиолета перед линзами устройства размещают светофильтр.

Он отсекает лучи с более короткой электромагнитной волной.

Люминесценция отличается двойственным происхождением.

Большинство веществ светятся самостоятельно из-за воздействия ультрафиолетовых лучей. В других случаях к образцам добавляют флюорохромы.

Преимущества люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия имеет множество достоинств. Основным является возможность изучения живых клеток и микроорганизмов. Исключается опасность их соединения или окрашивания, что провоцирует гибель. Поэтому ученые могут:

• наблюдать за клеточной структурой образца;
• фиксировать динамику происходящих биологических изменений.

Пример наглядности результата

Ярким примером служит изучение глиальной ткани человеческого мозга с помощью оптического и фазово-контрастного устройства. При сравнивании изображения выводы может сделать любой человек, не имеющий специальных знаний.

При применении оптического микроскопа клетки мозга выглядят прозрачными. Можно увидеть только части, имеющие выраженное преломление, к примеру мембрану или ядро. Полученная картинка не подходит для подробного изучения образца.

При использовании метода фазового контраста детали хорошо различимы. На четком изображении видны мельчайшие клеточные структуры и места их соединения друг с другом.

Как интерпретировать

Образцы, окрашенные флюорохромами, рассматривают, увеличивая в 200-630 раз. Однако чаще используется значение 400. При изучении препаратов после обработки карболовым фуксином изображение увеличивают в 1000 раз. Поэтому поле зрения объектива на люминесцентном микроскопе намного больше, чем простом.

Например, при диагностике туберкулеза методом флуоресцентной микроскопии есть свои тонкости. Приводится рекомендуемое количество полей для просмотра. Мазок оценивают как отрицательный, применяя различную степень увеличения.

Методы люминесцентной микроскопии – Статьи на сайте Четыре глаза

Главная »
Статьи и полезные материалы »
Микроскопы »
Статьи о микроскопах, микропрепаратах и исследованиях микромира »
Световая, люминесцентная, электронная микроскопия – разные методы исследований

Люминесцентная микроскопия

В люминесцентной микроскопии используется явление свечения веществ при облучении их ультрафиолетом. Разделяют понятия первичной и вторичной люминесценции. Первичную демонстрируют лишь редкие образцы, вторичная проявляется у всех веществ, окрашенных красителями (флюорохромами).

При люминесцентном методе исследований образец поглощает короткие волны и излучает длинные, которые можно наблюдать в видимом диапазоне. Люминесцентная микроскопия в микробиологии используется для изучения нуклеиновых кислот в клетках, бактериоскопии возбудителей инфекций, цитохимических исследований живых микроорганизмов.

Метод незаменим в диагностике заболеваний и широко применяется в медицине.

Методы люминесцентной микроскопии

В люминесцентной микроскопии применяются несколько методов исследований. В микробиологии обычно используют два из них: окрашивание флюорохромами (флюорохромирование) и метод флюоресцирующих антител.

Последний еще называется реакцией иммунной флюоресценции (РИФ). Мы не будем углубляться в тщательное описание каждого метода, так как объема одной статьи для этого не хватит.

Отметим, что существует еще конфокальная микроскопия – тоже метод люминесценции, который позволяет изучать образцы на некоторой глубине.

Поляризационная, конфокальная, электронная, люминесцентная микроскопия – это методы изучения микромира. Некоторые появились вместе с первыми микроскопами, другие же были придуманы в последние сто лет. Наука не стоит на месте, а способы наблюдений меняются, совершенствуются и становятся все более эффективными.

Вы тоже можете совершенствовать свои умения, используя более современную и актуальную оптическую технику. В нашем интернет-магазине вы найдете микроскопы не только для любителей, но и для профессионалов. Наши консультанты готовы ответить на любые ваши вопросы, рассказать о выгодных предложениях и акциях.

Звоните или пишите!

4glaza.ru
Март 2019

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Рекомендуемые товары

Другие обзоры и статьи о микроскопах, микропрепаратах и микромире:

• Видео! Как выглядит крыса под микроскопом? Что можно увидеть в карманный микроскоп? (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: наблюдение лесной флоры и фауны (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видеосравнение фильтрованной и нефильтрованной воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: жизнь в капле воды с болота (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видео радиоактивной воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видеообзор (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видео соленой воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
• Медицинские микроскопы Levenhuk MED: обзорная статья на сайте levenhuk.ru
• Видео! Портативный микроскоп Bresser National Geographic 20–40x и другие детские приборы линейки: видеообзор (канал «Татьяна Михеева», Youtube.com)
• Книги знаний издательства Levenhuk Press: подробный обзор на сайте levenhuk.ru
• Видео! Книга знаний в 2 томах. «Космос. Микромир»: видеопрезентация (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Видео бактерий под микроскопом Levenhuk Rainbow 2L PLUS (канал «Микромир под микроскопом», Youtube.ru)
• Обзор микроскопа Levenhuk Rainbow 50L PLUS на сайте levenhuk.ru
• Видео! Подробный обзор серии детских микроскопов Levenhuk LabZZ M101 (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
• Обзор набора оптической техники Levenhuk LabZZ MTВ3 (микроскоп, телескоп и бинокль) на сайте levenhuk.ru
• Видео! Микроскоп Levenhuk DTX 90: распаковка и видеообзор цифрового микроскопа (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
• Видео! Видеопрезентация увлекательной и красочной книги для детей «Невидимый мир» (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Большой обзор биологического микроскопа Levenhuk 3S NG (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
• Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L PLUS
• Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow и LabZZ (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Микроскоп Levenhuk Rainbow 2L PLUS LimeЛайм. Изучаем микромир
• Выбираем лучший детский микроскоп
• Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L PLUS: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 50L: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 50L PLUS: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Микроскоп Levenhuk Rainbow D2L: видеообзор цифрового микроскопа (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Микроскоп Levenhuk Rainbow D50L PLUS: видеообзор цифрового микроскопа (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Обзор биологического микроскопа Levenhuk Rainbow 50L
• Видео! Видеообзор школьных микроскопов Levenhuk Rainbow 2L и 2L PLUS: лучший подарок ребенку (канал KentChannelTV, Youtube.ru)
• Видео! Как выбрать микроскоп: видеообзор для любителей микромира (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Галерея фотографий! Наборы готовых микропрепаратов Levenhuk
• Микроскопия: метод темного поля
• Видео! «Один день инфузории-туфельки»: видео снято при помощи микроскопа Levenhuk 2L NG и цифровой камеры Levenhuk (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Видео! Обзор микроскопа Levenhuk Rainbow 2L NG Azure на телеканале «Карусель» (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
• Обзор микроскопа Levenhuk Фиксики Файер
• Совместимость микроскопов Levenhuk с цифровыми камерами Levenhuk
• Как работает микроскоп
• Как настроить микроскоп
• Как ухаживать за микроскопом
• Типы микроскопов
• Техника приготовления микропрепаратов
• Галерея фотографий! Что можно увидеть в микроскопы Levenhuk Rainbow 50L, 50L PLUS, D50L PLUS
• Сетка или шкала. Микроскоп и возможность проведения точных измерений
• Обычные предметы под объективом микроскопа
• Насекомые под микроскопом: фото с названиями
• Инфузории под микроскопом
• Изобретение микроскопа
• Какой микроскоп лучше: подробная инструкция по выбору оптического прибора
• Как выглядят лейкоциты под микроскопом
• Что такое лазерный сканирующий микроскоп?
• Микроскоп люминесцентный: цена высока, но оправданна
• Микроскоп для пайки микросхем
• Иммерсионная система микроскопа
• Измерительный микроскоп
• Микроскопы от самых больших профессиональных моделей до простых детских
• Микроскоп профессиональный цифровой
• Силовой микроскоп: для серьезных исследований и развлечений
• Лечение зубов под микроскопом
• Кровь человека под микроскопом
• Галогенные лампы для микроскопов
• Французские опыты – микроскопы и развивающие наборы от Bondibon
• Наборы препаратов для микроскопа
• Юстировка микроскопа
• Микроскоп для ремонта электроники
• Операционный микроскоп: цена, возможности, сферы применения
• «Шкаловой микроскоп» – какой оптический прибор так называют?
• Бородавка под микроскопом
• Вирусы под микроскопом
• Принцип работы темнопольного микроскопа
• Покровные стекла для микроскопа – купить или нет?
• Увеличение оптического микроскопа
• Оптическая схема микроскопа
• Схема просвечивающего электронного микроскопа
• Устройство оптического микроскопа у теодолита
• Грибок под микроскопом: фото и особенности исследования
• Зачем нужна цифровая камера для микроскопа?
• Предметный столик микроскопа – что это и зачем он нужен?
• Микроскопы проходящего света
• Органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа
• Паук под микроскопом: фото и особенности изучения
• Из чего состоит микроскоп?
• Как выглядят волосы под микроскопом?
• Глаз под микроскопом: фото насекомых
• Микроскоп из веб-камеры своими руками
• Микроскопы светлого поля
• Механическая система микроскопа
• Объектив и окуляр микроскопа
• USB-микроскоп для компьютера
• Универсальный микроскоп – существует ли такой?
• Песок под микроскопом
• Муравей через микроскоп: изучаем и фотографируем
• Растительная клетка под световым микроскопом
• Цифровой промышленный микроскоп
• ДНК человека под микроскопом
• Как сделать микроскоп в домашних условиях
• Первые микроскопы
• Микроскоп стерео: купить или нет?
• Как выглядит раковая клетка под микроскопом?
• Металлографический микроскоп: купить или не стоит?
• Флуоресцентный микроскоп: цена и особенности
• Что такое «ионный микроскоп»?
• Грязь под микроскопом
• Как выглядит клещ под микроскопом
• Как выглядит червяк под микроскопом
• Как выглядят дрожжи под микроскопом
• Что можно увидеть в микроскоп?
• Зачем нужны исследовательские микроскопы?
• Бактерии под микроскопом: фото и особенности наблюдения
• На что влияет апертура объектива микроскопа?
• Аскариды под микроскопом: фото и особенности изучения
• Как использовать микропрепараты для микроскопа
• Изучаем ГОСТ: микроскопы, соответствующие стандартам
• Микроскоп инструментальный – купить или нет?
• Где купить отсчетный микроскоп и зачем он нужен?
• Атом под электронным микроскопом
• Как кусает комар под микроскопом
• Как выглядит муха под микроскопом
• Амеба: фото под микроскопом
• Подкованная блоха под микроскопом
• Вша под микроскопом
• Плесень хлеба под микроскопом
• Зубы под микроскопом: фото и особенности наблюдения
• Снежинка под микроскопом
• Бабочка под микроскопом: фото и особенности наблюдений
• Самый мощный микроскоп – как выбрать правильно?
• Рот пиявки под микроскопом
• Мошка под микроскопом: челюсти и строение тела
• Микробы на руках под микроскопом – как увидеть?
• Вода под микроскопом
• Как выглядит глист под микроскопом
• Клетка под световым микроскопом
• Клетка лука под микроскопом
• Мозги под микроскопом
• Кожа человека под микроскопом
• Кристаллы под микроскопом
• Основное преимущество световой микроскопии перед электронной
• Конфокальная флуоресцентная микроскопия
• Зондовый микроскоп
• Принцип работы сканирующего зондового микроскопа
• Почему трудно изготовить рентгеновский микроскоп?
• Макровинт и микровинт микроскопа – что это такое?
• Что такое тубус в микроскопе?
• Главная плоскость поляризатора
• На что влияет угол между главными плоскостями поляризатора и анализатора?
• Назначение поляризатора и анализатора
• Метод изучения – микроскопия на практике
• Микроскопия осадка мочи: расшифровка
• Анализ «Микроскопия мазка»
• Сканирующая электронная микроскопия
• Методы световой микроскопии
• Оптическая микроскопия (световая)
• Световая, люминесцентная, электронная микроскопия – разные методы исследований
• Темнопольная микроскопия
• Фазово-контрастная микроскопия
• Поляризаторы естественного света
• Шотландский физик, придумавший поляризатор
• Механизм фокусировки в микроскопе
• Что такое полевая диафрагма?
• Микроскоп Микромед: инструкция по эксплуатации
• Микроскоп Микмед: инструкция по эксплуатации
• Где найти инструкцию микроскопа «ЛОМО»?
• Микроскопы Micros: руководство пользователя
• Какую функцию выполняют зажимы на микроскопе
• Рабочее расстояние объектива микроскопа
• Микропрепарат для микроскопа своими руками
• Метод висячей капли
• Метод раздавленной капли
• Тихоходка под микроскопом
• Аппарат Гольджи под микроскопом
• Чем занять детей дома?
• Чем заняться на карантине дома?
• Чем заняться школьникам на карантине?
• Выбираем микроскоп: отзывы имеют значение?
• Микроскоп для школьника: какой выбрать?
• Немного об оптовой закупке микроскопов и иной оптической техники
• Во сколько увеличивает лупа?
• Где купить лампу-лупу – косметологическую модель с подсветкой?
• Какую купить лампу-лупу для маникюра?
• Можно ли купить лампу-лупу для наращивания ресниц в интернет-магазине?
• Лампа-лупа косметологическая на штативе: купить домой или нет?
• Лупа бинокулярная с принадлежностями
• Как выглядит лупа для нумизмата?
• Лупа-лампа – лупа для рукоделия с подсветкой
• «Лупа на стойке» – что это за оптический прибор?
• Лупа – проектор для увеличенного изображения
• Делаем лупу своими руками
• Основные функции лупы
• Какую лупу выбрать: советы и рекомендации
• Лупа бинокулярная – цена возможностей
• Лупа канцелярская: выбираем оптическую технику для офиса
• Как выглядит коронавирус под микроскопом?
• Как называется главная часть микроскопа?
• Где купить блоки питания для микроскопа?
• Строение объектива микроскопа
• Как выглядят продукты под микроскопом
• Что покажет музей микроминиатюр
• Особенности и применение методов окрашивания клеток

МИКРОСКОПИ́Я ОПТИ́ЧЕСКАЯ

Авторы: А. А. Шехонин

МИКРОСКОПИ́Я ОПТИ́ЧЕСКАЯ, об­щее на­зва­ние ме­то­дов на­блю­де­ния объ­ек­тов, не раз­ли­чи­мых че­ло­ве­че­ским гла­зом, с ис­поль­зо­ва­ни­ем оп­тич. мик­ро­ско­па.

Струк­ту­ру объ­ек­та мож­но раз­ли­чить, ес­ли раз­ные его час­ти­цы по-раз­но­му по­гло­ща­ют и от­ра­жа­ют свет ли­бо от­ли­ча­ют­ся од­на от дру­гой (или от сре­ды) по­ка­за­те­ля­ми пре­лом­ле­ния.

Эти свой­ст­ва обус­лов­ли­ва­ют раз­ли­чие ам­пли­туд и фаз све­то­вых волн, про­шед­ших че­рез раз­ные уча­ст­ки объ­ек­та, и от это­го за­ви­сит кон­тра­ст­ность изо­бра­же­ния. Раз­ные ме­то­ды на­блю­де­ния, при­ме­няе­мые в М. о., вы­би­ра­ют­ся в за­ви­си­мо­сти от свойств изу­чае­мо­го объ­ек­та (пре­па­ра­та).

при­ме­ня­ет­ся при ис­сле­до­ва­нии про­зрач­ных пре­па­ра­тов с вклю­чён­ны­ми в них аб­сор­би­рую­щи­ми (по­гло­щаю­щи­ми свет) час­ти­ца­ми. Та­ко­вы, напр., тон­кие ок­ра­шен­ные сре­зы жи­вот­ных и рас­тит. тка­ней, тон­кие шли­фы ми­не­ра­лов. В от­сут­ст­вие пре­па­ра­та лу­чи от ис­точ­ни­ка све­та 1 (см. рис. к ст.

 Мик­ро­скоп) че­рез кол­лек­тор 2 и кон­ден­сор 5 про­хо­дят че­рез объ­ек­тив 7 и да­ют рав­но­мер­но ос­ве­щён­ное по­ле в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 9 оку­ля­ра 10.

Ес­ли в пре­па­ра­те, рас­по­ло­жен­ном на пред­мет­ном сто­ли­ке 6, име­ет­ся аб­сор­би­рую­щий эле­мент (ча­сти­ца), то он час­тич­но по­гло­ща­ет и рас­сеи­ва­ет па­даю­щий на не­го свет, вслед­ст­вие че­го ам­пли­ту­да све­та, про­шед­ше­го че­рез эту час­ти­цу, бу­дет мень­ше, и час­ти­ца вы­гля­дит тём­ным пят­ном на свет­лом фо­не, что и обу­слов­ли­ва­ет, со­глас­но ди­фрак­ци­он­ной тео­рии, воз­ник­но­ве­ние изо­бра­же­ния. Ме­тод мож­но ис­поль­зо­вать и в слу­чае не­аб­сор­би­рую­щих частиц, ес­ли они рас­сеи­ва­ют ос­ве­щаю­щий пу­чок так силь­но, что б. ч. пуч­ка не по­па­да­ет в объ­ек­тив.

при­ме­ня­ет­ся для на­блю­де­ния не­про­зрач­ных объ­ек­тов, напр. шли­фов ме­тал­лов. Ос­ве­ще­ние пре­па­ра­та 4 (рис. 1) про­из­во­дит­ся от ос­ве­ти­те­ля 1 и по­лу­про­зрач­но­го зер­ка­ла 2 свер­ху че­рез объ­ек­тив 3, ко­то­рый вы­пол­ня­ет од­но­вре­мен­но и роль кон­ден­со­ра.

Про­ме­жу­точ­ное изо­бра­же­ние соз­да­ёт­ся в плос­ко­сти 6 объ­ек­ти­вом со­вме­ст­но с ту­бус­ной лин­зой 5. Струк­ту­ра пре­па­ра­та вид­на вслед­ст­вие раз­ли­чия от­ра­жаю­щей спо­соб­но­сти его эле­мен­тов.

На свет­лом фо­не наблюда­ют­ся тём­ные изо­бра­же­ния не­од­но­род­но­стей струк­ту­ры по­верх­но­сти.

при­ме­ня­ет­ся для по­лу­че­ния изо­бра­же­ний про­зрач­ных, не­аб­сор­би­рую­щих объ­ек­тов. Свет от ис­точ­ни­ка 1 (рис. 2) че­рез кол­лек­тор 2 про­хо­дит спец. кон­ден­сор тём­но­го по­ля 4, со­дер­жа­щий коль­це­вую диа­фраг­му 3. Ка­ж­дая точ­ка пре­па­ра­та 5 ос­ве­ща­ет­ся све­то­вым пуч­ком в ви­де по­ло­го ко­ну­са.

В от­сут­ст­вие рас­сеи­ваю­щих эле­мен­тов свет не­по­сред­ст­вен­но в объ­ек­тив 6 не по­па­да­ет. Объ­ек­тив соз­да­ёт в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 7 оку­ля­ра 8 изо­бра­же­ние толь­ко тех эле­мен­тов пре­па­ра­та, на ко­то­рых про­изош­ло рас­сея­ние све­та.

На тём­ном фо­не вид­ны свет­лые изо­бра­же­ния час­тиц, от­ли­чаю­щих­ся от ок­ру­жаю­щей сре­ды по­ка­за­те­лем пре­лом­ле­ния.

Этот ме­тод, ис­поль­зуе­мый так­же в ульт­ра­мик­ро­ско­пах (в них пре­па­рат ос­ве­ща­ют пер­пен­ди­ку­ляр­но на­прав­ле­нию на­блю­де­ния), да­ёт воз­мож­ность об­на­ру­жи­вать сверх­мел­кие де­та­ли, раз­ме­ры ко­то­рых (по­ряд­ка 2 нм) зна­чи­тель­но мень­ше пре­де­лов раз­ре­ше­ния наи­бо­лее силь­ных мик­ро­ско­пов. Од­на­ко при этом изо­бра­же­ния час­тиц име­ют вид ди­фрак­ци­он­ных то­чек и их ис­тин­ную фор­му нель­зя оп­ре­де­лить.

ис­поль­зу­ет­ся для ис­сле­до­ва­ния не­про­зрач­ных пре­па­ра­тов (напр., шли­фов ме­тал­лов) с вы­со­ким ко­эф. от­ра­же­ния. Ос­ве­ти­тель­ный ка­нал со­сто­ит из ис­точ­ни­ка све­та 1, кол­лек­то­ра 2, до­пол­нит. лин­зы 4, в фо­ку­се ко­то­рой ус­та­нав­ли­ва­ют коль­це­вую диа­фраг­му 3 (рис. 3).

Све­то­вой по­ток в ви­де по­ло­го ци­лин­д­ра, от­ра­жа­ясь от по­лу­про­зрач­но­го зер­ка­ла 5, по­па­да­ет на па­ра­бо­лич. зер­ка­ло 6 (эпи­кон­ден­сор). Ка­ж­дая точ­ка пре­па­ра­та 7 ос­ве­ща­ет­ся све­то­вым пуч­ком в ви­де по­ло­го ко­ну­са. При от­сут­ст­вии к.-л.

де­фек­тов или рас­сеи­ваю­щих эле­мен­тов на по­верх­но­сти объ­ек­та свет, зер­каль­но от­ра­жа­ясь от по­верх­но­сти, не­по­сред­ст­вен­но в объ­ек­тив 8 не по­па­да­ет.

Объ­ек­тив со­вме­ст­но с ту­бус­ной лин­зой 9 соз­да­ёт в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 10 оку­ля­ра 11 изо­бра­же­ние толь­ко тех эле­мен­тов пре­па­ра­та, на ко­то­рых про­изош­ло диф­фуз­ное рас­сея­ние све­та. На тём­ном фо­не вид­ны свет­лые изо­бра­же­ния час­тиц струк­ту­ры по­верх­но­сти.

(ме­тод на­блю­де­ния в про­хо­дя­щем и от­ра­жён­ном по­ля­ри­зо­ван­ном све­те) при­ме­ня­ет­ся для ис­сле­до­ва­ния ани­зо­троп­ных объ­ек­тов (ми­не­ра­лы, ру́­ды, зёр­на в шли­фах спла­вов, не­ко­то­рые жи­вот­ные и рас­тит. тка­ни и клет­ки).

При на­блю­де­нии в па­рал­лель­ных лу­чах (ор­то­ско­пи­че­ский ме­тод) с по­мо­щью ана­ли­за­то­ров и ком­пен­са­то­ров, ко­то­рые вклю­че­ны в оп­тич. сис­те­му, изу­ча­ет­ся из­ме­не­ние по­ля­ри­за­ции све­та, про­шед­ше­го че­рез пре­па­рат.

В этом слу­чае мож­но оп­ре­де­лить ани­зо­тро­пию по­ка­за­те­лей пре­лом­ле­ния и по­гло­ще­ния об­раз­ца, его оп­тич. ак­тив­ность и др. При вклю­че­нии в оп­тич.

сис­те­му мик­ро­ско­па линз Ла­зо и Бер­тра­на на­блю­де­ние объ­ек­та про­ис­хо­дит в схо­дя­щих­ся лу­чах (ко­но­ско­пи­че­ский ме­тод); при этом ис­сле­ду­ют­ся ори­ен­ти­ров­ка кри­стал­ла, ко­ли­че­ст­во и на­прав­ле­ние его осей.

слу­жит для по­лу­че­ния изо­бра­же­ний про­зрач­ных и бес­цвет­ных объ­ек­тов (напр., жи­вых не­ок­ра­шен­ных жи­вот­ных тка­ней), не­ви­ди­мых при на­блю­де­нии ме­то­дом свет­ло­го по­ля.

Да­же при ма­лом раз­ли­чии по­ка­за­те­лей пре­лом­ле­ния объ­ек­та и сре­ды или их тол­щин све­то­вая вол­на, про­шед­шая сквозь них, пре­тер­пе­ва­ет разл. из­ме­не­ния по фа­зе и при­об­ре­та­ет т. н. фа­зо­вый рель­еф.

Эти фа­зо­вые из­ме­не­ния с по­мо­щью фа­зо­вой пла­стин­ки (фа­зо­во­го коль­ца), рас­по­ло­жен­ной вбли­зи зад­не­го фо­ку­са объ­ек­ти­ва, пре­об­ра­зу­ют­ся в из­ме­не­ния яр­ко­сти (ам­пли­туд­ный рель­еф).

Лу­чи, про­шед­шие че­рез пре­па­рат, пол­но­стью про­хо­дят че­рез фа­зо­вое коль­цо, ко­то­рое из­ме­ня­ет их фа­зу на $π$/2. Лу­чи, рас­се­ян­ные в пре­па­ра­те (от­кло­нён­ные), не по­па­да­ют в фа­зо­вое коль­цо и не по­лу­ча­ют до­пол­нит. сдви­га фа­зы.

С учё­том фа­зо­во­го сдви­га, вне­сён­но­го са­мим пре­па­ра­том, раз­ность фаз ме­ж­ду от­кло­нён­ны­ми и не­от­кло­нён­ны­ми лу­ча­ми ока­зы­ва­ет­ся близ­кой к 0 или $π$. В ре­зуль­та­те ин­тер­фе­рен­ции све­та в плос­ко­сти изо­бра­же­ния пре­па­ра­та фор­ми­ру­ет­ся кон­тра­ст­ное изо­бра­же­ние его струк­ту­ры, в ко­то­ром рас­пре­де­ле­ние яр­ко­стей вос­про­из­во­дит фа­зо­вый рель­еф.

со­сто­ит в том, что ка­ж­дый луч, вхо­дя­щий в мик­ро­скоп, раз­дваи­ва­ет­ся: один про­хо­дит сквозь на­блю­дае­мую час­ти­цу, а вто­рой – ми­мо неё.

В оку­ляр­ной час­ти мик­ро­ско­па оба лу­ча со­еди­ня­ют­ся с раз­но­стью хо­да $δ=Nλ=(n_{ ext{ч}}-n_{ ext{ср}})d$ и ин­тер­фе­ри­ру­ют.

(Здесь $n_{ ext{ч}}$, $n_{ ext{ср}}$ – по­ка­за­те­ли пре­лом­ле­ния час­ти­цы и ок­ру­жаю­щей сре­ды, $d$ – тол­щи­на час­ти­цы, $λ$  – дли­на вол­ны све­та, $N$ – по­ря­док ин­тер­фе­рен­ции.)

Сход­ст­во ме­то­дов ин­тер­фе­рен­ци­он­но­го и фа­зо­во­го кон­тра­ста со­сто­ит в том, что оба они ос­но­ва­ны на ин­тер­фе­рен­ции лу­чей, про­шед­ших че­рез мик­ро­час­ти­цу и ми­но­вав­ших её. От­ли­чие ин­тер­фе­рен­ци­он­но­го ме­то­да от ме­то­да фа­зо­во­го кон­трас­та за­клю­ча­ет­ся гл. обр.

в воз­мож­но­сти с вы­со­кой точ­но­стью (до $λ$/300) из­ме­рять раз­но­сти хо­да лу­чей, вно­си­мые мик­ро­объ­ек­том, ис­поль­зуя оп­тич. ком­пен­са­то­ры. На ос­но­ва­нии этих из­ме­ре­ний мож­но рас­счи­тать, напр., об­щую мас­су и кон­цен­тра­цию су­хо­го ве­ще­ст­ва в клет­ках био­ло­гич. пре­па­ра­тов.

ос­но­ва­на на яв­ле­нии лю­ми­нес­цен­ции, ли­бо свой­ст­вен­ной са­мо­му мик­ро­объ­ек­ту, ли­бо по­лу­чен­ной им по­сле спец. ок­ра­ски. Под мик­ро­ско­пом изу­ча­ет­ся зе­лё­но-оран­же­вое све­че­ние объ­ек­та, воз­ни­каю­щее при его ос­ве­ще­нии си­не-фио­ле­то­вым или УФ-из­лу­че­ни­ем.

Для этой це­ли пе­ред кон­ден­со­ром и по­сле объ­ек­ти­ва мик­ро­ско­па вво­дят со­от­вет­ст­вую­щие све­то­фильт­ры. Пер­вый из них про­пус­ка­ет от ис­точ­ни­ка-ос­ве­ти­те­ля толь­ко из­лу­че­ние, вы­зы­ваю­щее лю­ми­нес­цен­цию объ­ек­та, вто­рой (по­сле объ­ек­ти­ва) про­пус­ка­ет к гла­зу на­блю­да­те­ля толь­ко свет лю­ми­нес­цен­ции.

Ме­тод при­ме­ня­ет­ся в мик­ро­био­ло­гии, ци­то­ло­гии, мик­ро­хи­мич. ана­ли­зе, де­фек­то­ско­пии и т. п.

по­зво­ля­ет уве­ли­чить пре­дель­ную раз­ре­шаю­щую спо­соб­ность мик­ро­ско­па, про­пор­цио­наль­ную 1/$λ$. Этот ме­тод рас­ши­ря­ет воз­мож­но­сти мик­ро­ско­пич. ис­сле­до­ва­ний так­же за счёт то­го, что час­ти­цы мн.

ве­ществ, про­зрач­ные в ви­ди­мом све­те, силь­но по­гло­ща­ют УФ-из­лу­че­ние оп­ре­де­лён­ных длин волн и, сле­до­ва­тель­но, лег­ко раз­ли­чи­мы на УФ-изо­бра­же­ни­ях. Изо­бра­же­ния в УФ-мик­ро­ско­пии ре­ги­ст­ри­ру­ют фо­то­гра­фи­ро­ва­ни­ем, с по­мо­щью элек­трон­но-оп­тич.

пре­об­ра­зо­ва­те­ля, при­ём­ни­ка за­ря­до­вой свя­зи, лю­ми­нес­ци­рую­ще­го эк­ра­на.

Для на­блю­де­ния в ИК-лу­чах так­же не­об­хо­ди­мо пре­об­ра­зо­ва­ние не ви­ди­мо­го для гла­за изо­бра­же­ния в ви­ди­мое пу­тём его фо­то­гра­фи­ро­ва­ния, ви­део­съём­ки или с по­мо­щью элек­трон­но-оп­тич. пре­об­ра­зо­ва­те­ля. ИК-мик­ро­ско­пия по­зво­ля­ет изу­чать внутр. струк­ту­ру объ­ек­тов, не­про­зрач­ных в ви­ди­мом све­те, напр. тём­ных стё­кол, не­ко­то­рых кри­стал­лов, ми­не­ра­лов.

Световая микроскопия и электронная микроскопия: суть метода

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

• Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.
• Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль.
• Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.

Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Виды световой микроскопии

1. Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа.
2. Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.

3. Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.

4. Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа.

   В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом).

5. Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).
6. Темнопольная микроскопия.

   При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами

Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света.

При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета.

Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.).

Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом.

Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи.

В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом.

Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам.

По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки.

Темнопольная микроскопия

При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив.

В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

1. Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы.
2. Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.
3. Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Фазово-контрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона.

При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

• Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.
• Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света.
• Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный.

Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы.

Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды.

Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.

Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).

Электронная микроскопия

Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию.

Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете.

Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

1. Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной).
2. При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.
3. Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными.

Электронные микроскопы: системы

В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом.

Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца.

Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран.

Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование.

Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов

1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране.

Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров).

Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ.STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем.

При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме.

Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов.

При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение.

В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами.

Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа

• 1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;
• 2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;
• 3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;
• 4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

• Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера.
• Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.
• Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа.

Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения.

Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.