Цитокины в развитии меланом.

Меланома кожи, от древнегреческого «melas» (черный) и «oma» (опухоль), агрессивное злокачественное образование, развивающееся в результате необратимого генетического перерождения меланобластов и меланоцитов.

Данные клетки продуцируют пигмент меланин и отвечают за цвет кожи, способность к загару и образование невусов (родинок). На протяжении последних десятилетий наблюдается неуклонный рост заболеваемости.

Эту тенденцию чаще всего объясняют возросшим воздействием ультрафиолетовых лучей и модой на загар.

Меланоциты синтезируют пигменты, отвечающие за окрашивание кожи, цвет глаз, волос. Пигментированные образования, переполненные меланином,  называются родинками и могут проявляться в течение всей жизни. Определенные причинные факторы экзогенного (от греч. «exo» — внешнего) и эндогенного («endo» — внутреннего) характера способны вызвать озлокачествление невусов.

Вследствие этого, риску развития меланомы подвергаются участки тела, где имеются врожденные или приобретенные невусы: кожа, реже слизистые оболочки и сетчатка глаза. Измененные клетки способны бесконтрольно размножаться и расти, формируя опухоль, метастазируя. Чаще всего, среди доброкачественных «собратьев», обнаруживают одиночное злокачественное новообразование.

Цитокины в развитии меланом.

Клиническая картина разнообразна. Размеры, очертание, поверхность, пигментация, плотность опухоли варьируются в широких пределах. Любые изменения, происходящие с родинкой, должны насторожить.

Характерные черты

Опухоль меланома, развивающаяся из невуса, отличается продолжительным нарастанием изменений (вплоть до нескольких лет) и последующей агрессивной трансформацией (1-2 месяца). Ранняя самодиагностика и своевременный осмотр у специалиста помогут выявить симптомы меланомы:

  • Гладкая зеркальная поверхность, с исчезновением кожных борозд.
  • Увеличение размеров, рост по поверхности.
  • Неприятные ощущения в области родинки: зуд, покалывание, жжение.
  • Сухость, шелушение.
  • Изъязвление, кровотечение.
  • Признаки воспалительного процесса в области родинки и окружающих ее тканей.
  • Появление дочерних образований.

Внезапное появление подкожных уплотнений и узелков также может свидетельствовать о развивающемся заболевании.

Клиническая классификация. Виды меланомы

Меланома проявляется в различных формах, выделяют 3 основных типа:

  1. Поверхностно-распространенная.

Опухоль меланоцитарного происхождения. Наиболее часто встречающееся заболевание (от 70 до 75% случаев) среди людей европеоидной расы, среднего возраста. Сравнительно небольшая, сложной формы с неровными краями.

Окрас неравномерный, рыже-бурый или бурый, с мелкими вкраплениями синюшного оттенка. Новообразование имеет тенденцию к дефекту ткани, сопровождающемуся выделениями (чаще кровянистыми). Рост возможен как по поверхности, так и вглубь.

Переход к фазе вертикального роста может занимать месяцы и даже годы.

Как выглядит меланома на фото?

Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.
Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.Цитокины в развитии меланом.

Нодулярное (уменьшительное от лат. «nodus» — узел) образование встречается реже (14-30%). Наиболее агрессивная форма. Рак меланома характеризуется быстрым ростом (от 4 месяцев до 2 лет). Развивается на объективно неизмененной коже без видимых повреждений или из пигментного невуса. Рост вертикальный. Окрас равномерный, темно-синий или черный. В редких случаях подобная опухоль, имеющая сходство с узелком или папулой может быть не пигментированной.

Заболеванию подвержены лица пожилого возраста (после 60 лет) и выявляется в 5-10% случаев. Открытые участки кожного покрова (лицо, шею, руки) захватывают узелки темно-синего, темно- или светло-коричневого цвета диаметром до 3мм. Медленный радиальный рост опухоли в верхних отделах кожи (20 лет и дольше до вертикальной инвазии в глубокие слои дермы) может захватывать волосяные фоликулы.

Первые признаки меланомы

  • Меланома – это приобретение клетками неблагоприятных признаков малигнизации (свойств озлокачествления), выраженное различными симптомами.
  • Для удобства запоминания признаков меланомы используют правило «ФИГАРО»:
  • Форма – вздутая над поверхностью;
  • Изменения – ускоренный рост;
  • Границы – ажурные, неправильные, изрезанные;
  • Асимметрия – отсутствие зеркальной схожести двух половинок образования;
  • Размер – критической величиной считается образование диаметром более, чем 6 мм;
  • Окраска – неравномерность цвета, включение беспорядочных пятен черного, синего, розового, красного цвета.
  • В широкой практике также популярен англоязычный вариант, суммирующий основные, наиболее типичные признаки – «правило ABCDE»:
  • Asymmetry – асимметричность, при которой, если провести воображаемую черту, делящую образование пополам, одна половина не будет похожа на другую.
  • Border irregularity – край неровный, фестончатый.

Color – цвет, отличный от других пигментных образований. Возможны вкрапления участков синего, белого, красного цветов.

Diameter – диаметр. Любое образование более 6 мм требует дополнительного наблюдения.

  1. Evolution – изменчивость, развитие: плотности, структуры, размера.
  2. Без специальных исследований сложно определить тип невуса, но вовремя замеченные изменения в характере пятна помогут обнаружить озлокачествление.

Диагностика

  1. Визуальный метод. Осмотр кожных покровов, с использованием «правила злокачественности».
  2. Физический метод. Пальпация доступных групп лимфоузлов.
  3. Дерматоскопия. Оптическое неинвазивное поверхностное исследование эпидермиса при помощи специальных приборов, дающих 10-40-кратное увеличение.
  4. Сиаскопия.

    Аппаратный спектрофотометрический анализ, заключающийся в интракутантном (глубинном) сканировании образования.

  1. Рентген.
  2. УЗИ внутренних органов и регионарных лимфоузлов.
  3. Цитологическое исследование
  4. Биопсия. Возможен как забор образования целиком, так и его части (эксцизионная или инцизионная).

Стадии меланомы

Опухоль имеет несколько стадий развития.

  • При нулевой и первой – клетки опухоли располагаются во внешнем слое дермы (локально);
  • На второй и третьей – развитие изъязвлений в поражении, распространением на ближайшие лимфоузлы (локально-регионально);
  • На четвертой – поражение лимфоузлов, органов, других участков кожи человека (отдаленное метастазирование).

Лечение

  • Лечение локальных местных повреждений состоит в своевременном выявлении и хирургическом вмешательстве. Удаление чаще всего проводится под инфильтрационной анестезией. Для иссечения образований большого размера возможно применение общего обезболивания. Помимо злокачественных образований, существует ряд предмеланомных заболеваний, в которых показан хирургический метод.
  • Локально-регионарные повреждения. Лечение включает в себя иссечение с увеличенным захватом площади и лимфодиссекцию пораженных лимфатических узлов. Разновидности нерезектабельных, транзиторно метастазирующих опухолей подвергают изолированной регионарной химиоперфузии. В определенных случаях отлично зарекомендовал себя комбинированный подход, с проведением дополнительной терапии, стимулирующей иммунитет.
  • Лечение отдаленных метастазов выполняется монорежимной химиотерапией. Определенные виды мутаций подвергаются воздействию прицельных таргетных препаратов.

Меланома. Прогноз выживаемости

Толщина новообразования, глубина инвазии, локализация, наличие изъязвлений и радикальность вмешательства при лечении болезни имеет важное прогностическое значение.

Радикальное воздействие на поверхностные меланомы обеспечивает пятилетнюю выживаемость в 95 процентах заболеваемости. Опухоль с поражением лимфатических узлов снижает этот процент до 40.

Противопоказания

Принадлежность человека к светочувствительному фототипу, большое количество невусов, атипичные родинки, наличие наследственной предрасположенности, иммунных и эндокринных нарушений – дополнительные факторы в пользу внимательного отношения к кожным новообразованиям. Противопоказано:

  • Травматизация
  • Самодеятельное удаление родинок
  • Длительное пребывание под УФ-излучением без средств защиты кожи

Лечение после операции

При локальных стадиях наблюдение проводится в течение 5 лет. 10 лет – при других формах. Этот срок считается достаточным для обнаружения появления рецидива заболевания. Пациент инструктируется о применении соответствующих средств защиты от УФ лучей, в условиях естественного и искусственного излучения.

Некоторые иммуногистохимические особенности меланоцитарных образований кожи — современные проблемы науки и образования (сетевое издание)

1

Новикова И.А. 1

Максимова Н.А. 1

Позднякова В.В. 1

Максимова М.И. 1

Ильченко М.Г. 1

Ульянова Е.П. 1

Гранкина А.О. 1
1 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
В последние годы в разных странах мира отмечается значительный рост заболеваемости меланомой кожи (МК).

Она варьирует от 5 до 30 случаев и более на 100 000 населения в год, а частота ее составляет 1-4% всех злокачественных опухолей. Изучение белков, определяющих инвазивный потенциал клеток, может способствовать разработке новых стратегий диагностики, прогнозирования и лечения меланоцитарных образований кожи (МОК).

Мы изучили экспрессию некоторых молекулярно-биологических маркеров, контролирующих апоптоз (р53), пролиферацию (ki-67), ангиогенез (CD31, VEGF) в ткани МОК у 15 больных с пигментными доброкачественными образованиями (из них 5 больных с диспластическими невусами) и у 11 больных с МК.

При оценке пролиферативного потенциала МОК выявлено наличие умеренной пролиферативной активности ki-67 у 11 больных (100%) МК и у 5 (33,3%) с невусами, которые были определены как диспластические. Положительная экспрессия р53 (˃25%) наблюдалась у 54,5% (6) пациентов с МК, тогда как в группе с невусами данная экспрессия не была отмечена.

Нами выявлены достоверно значимые различия в экспрессии VEGF среди исследуемых групп, где среднее содержание клеток VEGF+ составило 32,5 ± 2,9%, тогда как в невусах 23,8 ± 2,1% (р˂0,05).

При количественной оценке внутриопухолевой микрососудистой плотности выявлено, что среднее количество сосудов микроциркуляторного русла в поле зрения при меланоме и невусах составило 10,0±0,9 и 4,1±0,4 соответственно, результаты экспрессии CD31 статистически достоверны (р˂0,05).

Хотя и прослеживается достоверная разница в экспрессии ki-67, р53, VEGF и CD31 между меланомами и невусами, но достаточно высокая чувствительность данных иммуногистохимических маркеров не всегда сопровождается необходимой специфичностью, что не позволяет, в частности, дифференцировать различные виды невусов.

молекулярно-биологических маркерымеланоцитарные образования кожи

1.

Архипова О.Е., Черногубова Е.А., Лихтанская Н.В., Тарасов В.А., Кит О.И., Матишов Д.Г. Анализ встречаемости онкологических заболеваний в Ростовской области. Пространственная статистика // Фундаментальные исследования. — 2013. — № 7-3. – С. 504-510.
2. Константинова М.М.

Ингибиторы внутриклеточной передачи сигнала при меланоме: перспективы и разочарования таргетной терапии // Современная онкология. — 2007. — Т. 9, № 3. — С. 46.
3. Мазуренко Н.Н. Генетические особенности и маркеры меланомы кожи // Успехи молекулярной онкологии. — 2014. — № 2. — С. 26-35.
4. Петров С.В., Райхлин Н.Т.

Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. – Казань, 2012. – С. 84, 409.
5. Саламова И.В. и др. Роль иммуногистохимии в дифференциальной диагностике новообразований кожи меланоцитарного генеза // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. – 2015. – №. 1. – С. 77.
6. Франциянц Е.М., Позднякова В.В., Максимова Н.А., Курышова М.И., Ильченко М.Г.

Некоторые молекулярно-биологические аспекты патогенеза меланомы кожи // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 1-2. — URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=20062 (дата обращения: 05.08.2016).
7. Bandovkina V., Kit O., Frantsiyants E. et al. Activity of components of plasminogen activation system in dynamics of transplantable B16/F10 melanoma development // J. Clin. Oncol. – 2016. — 34 (suppl; abstr e21062).
8. Curtin J.A., Fridlyand J., Kageshita T. et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma // N. Engl. J. Med. – 2005. – 353 (20):2135–47.
9. Li L.X. [et al.] A zonal comparison of MIB1-Ki67 immunoreactivity in benign and malignant melanocytic lesions // Am. J. Dermatopathol. – 2000. – Vol. 22 (6). – P. 489-95.
10. Vredeveld L.C., Possik P.A., Smit M.A. et al. Abrogation of BRAFV600E-induced senescence by PI3K pathway activation contributes to melanomagenesis. Genes Dev. – 2012. – 26 (10):1055–69.

Меланома кожи (МК) — злокачественная опухоль из клеток меланоцитарной системы и одно из наиболее агрессивно протекающих злокачественных новообразований человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом [2]. Около 75% больных к моменту начала специального лечения уже имеют распространенный процесс [1; 9]. Развитие меланомы – сложный процесс, в который вовлечены различные факторы. В 75% случаев МК возникает из отдельных кожных меланоцитов, а в 25% – из предсуществующих невусов [6-8]. Некоторые исследователи рассматривают всю совокупность меланоцитов организма как своеобразную эндокринную или цитокринную меланогенную систему, ответственную за выработку пигмента. Степень функционирования этой системы организма во многом зависит от факторов внешней среды (прежде всего уровня инсоляции) и регулируется продукцией меланостимулирующего гормона, вырабатываемого передней долей гипофиза. В клинической практике внимание уделяется признакам активизации невусов, которые свидетельствуют об усилении пролиферативной активности клеток невуса или даже его малигнизации [3; 5]. Считается, что диспластический невус является недостающим звеном между доброкачественным и злокачественным меланоцитарным поражением. С другой стороны, диспластические невусы десятилетиями остаются без изменений, и для их малигнизации нужны дополнительные генетические нарушения [10]. За последнее десятилетие, начиная с 2002 г., когда была открыта мутация BRAF, достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных механизмов канцерогенеза меланомы. Так, мутации NRAS обнаруживают в 94,7% случаев врожденных меланоцитарных невусов, которые характеризуются повышенным риском трансформации в меланому [3]. Способность опухолевых клеток к инвазии в ткань дермы является критическим событием в развитии меланомы кожи и в итоге индикатором плохого прогноза для пациентов. Изучение некоторых молекулярно-биологических параметров меланоцитарных образований кожи и молекулярных процессов, связанных с приобретением инвазивного фенотипа, может способствовать раскрытию новых звеньев патогенеза меланомы и поиску дополнительных диагностических критериев.

  • Цель исследования
  • Изучить экспрессию некоторых молекулярно-биологических маркеров, контролирующих апоптоз (р53), пролиферацию (ki-67), ангиогенез (CD31, VEGF) в ткани меланоцитарных образований кожи.
  • Материал и методы исследования

В исследование были включены 15 больных в возрасте от 21 до 49 лет с пигментными доброкачественными образованиями, включая 5 больных с диспластическими невусами. Невусы, взятые для исследования, располагались на коже туловища, конечностей, лица и шеи. Их размеры по длине колебались от 5 до 25 мм, по ширине – от 2 до 18 мм, по толщине – от 2 до 8 мм.

И 11 больных с меланомой кожи. Меланомы, взятые для исследования, располагались на коже спины и нижних конечностей.

Их размеры по длине колебались от 1,3 до 8,5 мм, по ширине – от 1,0 до 2,5 мм, при поверхностно-распространяющейся меланоме, толщина по Бреслоу составила от 1,3 до 7,0 мм, при узловой меланоме кожи толщина по Бреслоу – от 1,0 до 3,5 мм, уровень инвазии по Кларку составил от II до IV.

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител ki-67, р53, CD31, VEGF. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в таблице.

Панель использованных в исследовании антител

Специфичность Клон Фирма Разведение Буфер для «демаскировки антигенов»
Антиген ki-67, пролиферативная активность (ядерное окрашивание) SP6 Thermo scientific 1:200
  1. 10 мМTris,
  2. 1 мМ EDTA
  3. (рН 6,0)
Нормальный и мутантный тип p53 (ядерное окрашивание) DO-7 CELLMARQUE 1:150
  • 10 мМTris,
  • 1 мМEDTA
  • (рН 8,0)
CD31/PECAM-1 Ab-6 (мембранное окрашивание эндотелиальных клеток) 1A10 Thermo scientific 1:100
  1. 10 мМTris,
  2. 1 мМEDTA
  3. (рН 6,0)
VEGF Ab-7 (стимулятор ангиогенеза) VG1 Thermo scientific 1:150 10 мМTris, 1 мМEDTA (рН 8,0)

Депарафинизацию и регидратацию проводили по стандартной методике, «демаскировку» антигенов в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 °C, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 °C и дальнейшее охлаждение до 65 °C.

Затем стёкла промывали в течение 1–3 минут TBSIHCWashBuffer (CELLMARQUE) и помещали в иммуноавтостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме.

Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Ultra Vision Quanto Detection System HRPDAB. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount.

Оценку экспрессии маркеров изучали как минимум на 10 случайно выбранных полях зрения с применением светового микроскопа Zeiss Primo Star под увеличением х10, х40.

  • В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:
  • 1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%, и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток;
  • 2) для оценки пролиферативной активности (ПА) подсчитывали количество ki-67-положительных клеток, приходящихся на 200–300 опухолевых клеток. Индекс ki-67 определяли по формуле:
  • ПА= число ki-67 положительных клеток х 100/общее количество клеток.
  • Маркеры пролиферативной активности расценивали на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности: 0–20% – низкая пролиферативная активность, 21–50% – умеренная пролиферативная активность, 51 –100% – высокая пролиферативная активность;
  • 3) опухоль считали положительной по VEGF (VEGFопухоль+), если окрашено более 25% опухолевых клеток. Мы также в каждом конкретном случае количественно подсчитывали долю клеток (в%), окрашенных антителами к VEGF;

4) для оценки ангиогенеза использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumormicrovesseldensity – MVD). Микрососуды окрашивали антителом CD31.

Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40 с использованием программы AxioVs40 v-4.8.1.0.

Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoftInc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).

Результаты исследования и их обсуждение

Наиболее ранними событиями в процессах канцерогенеза и прогрессирования опухолей являются нарушение механизмов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках. На этой стадии теряются нормальные механизмы контроля клеточного деления и апоптоза.

Способность к неограниченному размножению является одной из главных особенностей опухолевых клеток. Одним из методов определения пролиферативной активности (ПА) опухоли служит индекс ki-67-положительных клеток.

При оценке пролиферативного потенциала меланоцитарных образований выявлено наличие умеренной пролиферативной активности ki-67у 11 больных (100%) меланомой кожи и у 5 (33,3%) с невусами, которые были определены как диспластические.

Низкая пролиферативная активность отмечалась у 66,7% (10) больных с доброкачественными образованиями и отсутствовала у больных меланомой. Высокая пролиферативная активность в нашем исследовании не встречалась ни в одной из исследуемых групп.

Доля пролиферирующих ki-67-положительных клеток в группе больных меланомой находилась в пределах от 30 до 45% клеток, в среднем составив 38,3 ± 3,6%. В группе доброкачественных образований доля ki-67-позитивных клеток находилась в пределах от 4 до 25%, где их среднее содержание составило 14,9 ± 1,2%, причем доля пролиферирующих клеток в диспластических невусах была максимальной и составляла 20-25% (рис. 1).

Цитокины в развитии меланом.

Рис. 1. Экспрессия ki-67. Ув. × 400. А – внутридермальный невус, Б – узловая меланома, веретеноклеточный вариант

Полученные нами данные, так же как и литературные, подтверждают, что иммунореактивность ki-67 хорошо коррелирует с доброкачественностью или злокачественностью меланоцитарных поражений и может помочь в дифференциальной диагностике доброкачественных невусов от меланом [9].

Другим не менее важным маркером биологического потенциала клеток является белок р53, который выполняет три основные функции: регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза (в случаях, когда повреждения ДНК клетки не могут быть репарированы), стабилизацию генома.

Нарушение регуляции клеточного цикла, связанное с изменением активности р53, ведет к развитию и прогрессированию злокачественного процесса. Мутации гена p53 ведут к «сверхэкспрессии» этого белка, которые иммуногистохимическим методом выявляются с помощью анти-р53 антител.

Считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит от наличия мутантного типа р53 [4]. Экспрессия р53 в ядрах опухолевых клеток меланомы составила 22,0 ± 2,1%, тогда как в клетках невусов 2,1 ± 0,2% (различия статистически достоверны, р< 0,05).

Положительная экспрессия р53 (>25%) наблюдалась у 54,5% (6) пациентов с меланомой кожи, тогда как в группе с невусами данная экспрессия не была отмечена. В основном преобладала единичная экспрессия р53в клетках невусов — 66,7% (10).

У пациентов с меланомой разброс количества окрашенных клеток находился в пределах от единичного окрашивания до 35% клеток, и в 18,2% (2 из 11) достиг точки разделения cut-off в 25% ядер опухолевых клеток (рис. 2).

Цитокины в развитии меланом.

Рис. 2. Экспрессия p53. Ув. × 400. А – внутридермальный невус, Б – узловая меланома, веретеноклеточный вариант

Ангиогенез, как необходимая стадия в развитии новообразований, является сложным процессом, в который включено взаимодействие стромальных и опухолевых клеток. В индукцию ангиогенеза включены опухолеассоциированные макрофаги, которые имеют диагностическое и прогностическое значение при некоторых опухолях.

VEGF занимает позицию главного митогена эндотелиальных клеток, и его присутствие требуется для образования незрелых сосудов при васкулогенезе или неоангиогенезе. Именно он и заставляет кровеносную систему организма закладывать новые сосуды, пронизывающие опухоль и образующие в ней разветвлённую сеть.

Плотность микрососудов, которая отражает количество/объём образования новых сосудов, значительно больше в ткани, поражённой раком, чем в здоровой, и она находится в определённом соотношении с распространением опухоли.

Важным показателем развития опухолевой прогрессии является микрососудистая инвазия опухоли, которую иммуногистохимически можно выявить с помощью антител к CD31. По уровню экспрессии CD31 производится подсчет плотности микрососудов в опухоли, которая является важным прогностическим признаком [4].

Экспрессия VEGF выявлена в цитоплазме клеток меланомы в 100% случаев (11), тогда как в доброкачественных образованиях – в 66,7% (10). Отсутствие экспрессии в клетках невусов отмечалось в 33,3% (5).

Разброс окрашенных клеток антителами к VEGF и в меланомах, и в невусах очень неоднороден и составляет от менее 5% и до 50%.

Нами выявлены достоверно значимые различия в экспрессии VEGF среди исследуемых групп, где среднее содержание клеток VEGF+ составило 32,5 ± 2,9%, тогда как в невусах 23,8± 2,1% (р

Меланома — симптомы и лечение

Сколько проживет больной после установления диагноза зависит от уровня инвазии слоёв кожи, её толщины (уровень по Бреслоу) в миллиметрах (до 0,75 мм, 0,76-1,5 мм, 1,51-4 мм, 4 мм и более), митотического индекса, наличия/отсутствия признаков регресса и инвазии сосудов, степени лимфоцитарной инфильтрации опухоли. Также нужно учитывать расположение меланомы, а также возраст и пол пациента.

Толщина опухоли и наличие изъязвления является одним из наиболее важных прогностических факторов (15,18,19).

Так, 5-летняя выживаемость при стадии IA (толщина опухоли до 1 мм включительно, без изъязвления и метастазов, T1aN0M0) составляет 95%. А при IV стадии (опухоль с метастазами во внутренние органы) 5-летняя выживаемость — 7-10%.

Необходимо отметить, что по данным многочисленных исследований тип удаления опухоли (тип биопсии) не влияет ни на общую, ни на безрецидивную выживаемость.[18][19]

Основной фактор риска развития меланомы и иных опухолей кожи — ультрафиолетовое облучение, которое происходит по ряду естественных (солнечные ожоги) и искусственных причин (посещение солярия). Поэтому защита от ультрафиолета лежит в основе первичной профилактики. Риск образования меланомы повышают солнечные ожоги, полученные в детском и подростковом возрасте.

Пациенты с множественными и/или диспластическими родинками, а также с I и II фототипом кожи также относятся к группе риска, поэтому им следует регулярно наблюдаться у онкодерматолога. Наличие меланомы в анамнезе, в том числе среди ближайших родственников, также является показанием к регулярным профилактическим осмотрам.

Цитокины в развитии меланом. 

Рекомендации после лечения меланомы

  • проводить регулярный осмотр кожи;
  • ограничивать пребывание на солнце, не посещать солярии;
  • регулярно использовать солнцезащитные средства.

В некоторых исследованиях показано, что при соблюдении рекомендаций по ограничению инсоляции и регулярном применении средств, защищающих от УФ излучений, у лиц с диспластическими невусами появляется меньше новых пигментных новообразований, а дети, которых защищают от инсоляции в семьях высокого риска, также имеют меньше невусов.  

Проблема ограничения инсоляции в качестве профилактики меланомы кожи существует во всём мире. Загар считается показателем красоты, молодости и здоровья (особенно у женщин). Но на самом деле УФ излучения вызывают повреждение ДНК, преждевременное старение кожи, а также способствуют иммуносупрессии.

В связи с этим Всемирная организация здравоохранения относит УФ установки , используемые в соляриях, к канцерогенам. Но не смотря на это женщины активно пользуются соляриями.

Так, по данным Европейского онкологического института, только в 2008 году в европейских странах было зарегистрировано 3438 новых случаев меланомы, которые возникли у женщин после посещения соляриев.[20]

Наибольшее повреждение коже наносят ультрафиолетовые лучи с длиной волны 320-400 нм (УФО-А) и 290-320 нм (УФО-В). Применение солнцезащитных средств с фильтрами широкого спектра при правильном использовании эффективно защищают кожу от солнечных лучей.

Также для профилактики необходимо:

  • избегать нахождения под открытым солнцем с 11:00 до 16:00 (периода наиболее интенсивного излучения УФ);
  • носить одежду. Защищающую от прямых солнечных лучей (рубашки с длинными рукавами, шляпы с широкими полями, солнцезащитные очки).

Первичная профилактика меланомы кожи — непростая задача, которая требует не только наблюдения у специалиста, но и соблюдения его рекомендаций пациентами.

Основной фактор увеличения продолжительности жизни людей с меланомой кожи — ранняя диагностика опухоли. Этот способ профилактики является вторичным.

Поэтому знание факторов риска, симптомов заболевания, а также дерматоскопия и патогистология очень важны в клинической практике дерматолога и онколога.

Необходимо активно выявлять людей с повышенным риском развития меланомы и проводить динамическое наблюдение.

Клеточные линии меланоцитов и их биология при меланоме — научное обозрение. педагогические науки (научный журнал)

1

Антонова Е.И. 1

Бармина С.А. 1

Волкова Е.С. 1

Костина О.М.  1
1 ФГБОУ ВО «УлГПУ им. И.Н.

 Ульянова» Научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии
В работе представлен анализ результатов исследований по изучению биологии клеточных линий эпидермальных меланоцитов человека – отросчатых пигментных клеток кожи, которые имеют неврогенное происхождение, на предмет проявления свойств онкогенности и оптимизации протоколов ведения клеточных линий меланоцитов in vitro, выделенных из биопсийного материала пациентов с диагнозом меланома кожи – одной из наиболее агрессивных злокачественных опухолей в онкодерматологии. Применение метода культур клеток in vitro и метода световой микроскопии позволило нам изучить биологию онкогенных меланоцитов, а так же оптимизировать протокол культивирования на основе данных о состоянии культур в различные временные промежутки эксперимента. В ходе эксперимента производилось изучение как цитологических характеристик каждой линии: расположение и количество клеток, образование комплексов, размеры и формы клеток, форма и размеры ядра, ядерно-цитоплазматическое соотношение, количество и форма ядрышек, наличие митозов, так и их жизнеспособность. Результаты исследований биологии опухолеродных меланоцитов и возможность их выращивания вне живого организма способны помочь в развитии методов ранней диагностики и в поиске методов лечения злокачественных новообразований меланоцитарной природы.

1. Хейнштейн В.А. Патоморфологоческая характеристика спектра веретеноклеточных меланом: дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2015. – 147 с.
2. Попова М.Ю., Танурова К.С. Увеальная меланома: особенности диагностики и лечения (литературный обзор) // Вестник Совета молодых учёных и специалистов Челябинской области. – 2016. – Т. 1; № 4 (15). – С. 62–64.
3. Кичигина Т.Н., Грушин В.Н., Беликова И.С., Мяделец О.Д. Меланоциты: строение, функции, методы выявления, роль в кожной патологии // Вестник ВГМУ. – 2007. – Т. 6; № 4. – 1–16 с.
4. Малюк Е.А., Целуйко С.С., Красавина Н.П. Морфофункциональная характеристика эпидермиса в норме и при действии экстремальных факторов // Дальневосточный медицинский журнал. – 2016. – № 1. – С. 113–117.
5. Кузнецов С.Л., Горячкина В.Л., Цомартова Д.А., Заборова В.А., Луцевич О.А. Современные представления о структуре и функциях эпидермиса // Российский журнал кожных и венерических болезней. – 2013. – № 2. – С. 26–32.

Меланоциты – гетерогенная группа клеток, развивающаяся из мультипотентных клеток нейроэктодермального гребня [1].

Меланоциты кожи – отростчатые пигментные клетки неврогенного происхождения, локализующиеся в эпидермисе, и составляющие примерно 15 – 25 % от общего числа клеток эпидермиса, и дерме [2].

Меланоциты имеют характерную ультраструктуру. В их цитоплазме содержится значительное количество различных органелл. Цитоплазматическая сеть выражена хорошо, количество митохондрий значительно.

В клетках сильно развит пластинчатый комплекс Гольджи. В цитоплазме много везикул, рибосом и небольшое количество лизосом.

Ядро имеет неровные контуры мембраны с неглубокими впячиваниями и очень плотной нуклеоплазмой [3].

Отростки меланоцитов содержат множество меланосом, рибосом и контактируют с несколькими кератиноцитами при помощи десмосом. Каждый меланоцит секретирует гранулы меланина в связанные с ним кератиноциты. Это партнерство «меланоцит – кератиноцит» называют меланиновой эпидермальной единицей. Один меланоцит контактирует с 36 (40) кератиноцитами [4, 5].

Последствия нарушения работы меланоцитов объединяют в 3 группы: гиперпигментация, гипопигментация и смешанные гипер- / гипопигментационные расстройства.

Одним из наиболее распространённых и сложных заболеваний является одна из наиболее агрессивных злокачественных опухолей – меланома кожи, составляющая не более 4,0 % всех новообразований кожи, которая, согласно статистике, является причиной примерно 80 % случаев летальных исходов в онкодерматологии [1], что связано с недостаточной изученностью проблемы диагностики и лечения этого заболевания. Заболеваемость меланомой кожи в период с 2000 по 2010 г. увеличилась с 3,18 до 3,95 случая на 100 тыс. населения. Среднегодовой темп прироста составил 1,99 %, а общий прирост заболеваемости 21,81 %.

Меланома кожи относится к наиболее агрессивно протекающим злокачественным новообразованиям, характеризующимся быстрым развитием метастазирования и резистентностью к стандартной цитостатической терапии, поэтому 5 летняя выживаемость больных с метастатическим процессом находится в пределах 10–15 % .

Целью нашего исследования является изучение клеточных линий меланоцитов и их биологии при меланоме, а также оптимизация протоколов культивирования меланоцитов для возможности дальнейшего углубленного изучения вопроса.

Эксперимент был поставлен на меланоцитах, выделенных из злокачественных новообразований кожи больных меланомой. Каждой клеточной линии был присвоен индивидуальный код. После забора материал сразу помещали в транспортную среду на сутки при комнатной температуре.

В лаборатории Клеточных технологий НИЦ ФППББ УлГПУ биоптаты механически измельчались на фрагменты размером около 5х5 мм, и инкубировались в 0,25 % растворе трипсина 18 часов при температуре 37°С, в СО2 – инкубаторе («Binder», Германия) с содержанием СО2=5 %.

Далее проводили отделение слоя эпидермы от дермы, фрагменты эпидермы и опухоли помещали в 0,05 % раствор ЭДТА на 5 минут для дезагрегации клеток. Суспензию центрифугировали при 1500 об/мин 5 минут. После этого сбрасывали супернатант и к полученной взвеси клеток приливали 5 мл готовой полной среды.

Для культивирования было выбрано 2 основные среды – RPMI-1640 и Melanocytes Growth Medium с содержанием ЭТС 5 % и 20 %. Полученную смесь помещали в культуральные флаконы объемом 25 см3 и культивировали в СО2–инкубаторе. Культивирование осуществляли на протяжении 8 пассажей, каждый из которых высевали на 15 флаконов.

Подсчёт клеток вели с использованием счетчика клеток («Bio – Rad TC10», Сингапур), красителем трипановый синий. Через 48 часов после инокуляции осуществляли замену среды. В дальнейшем среду меняли при необходимости (около одного раза в неделю), исходя из визуальных характеристик, таких как: – цвет среды – светло – розовая с желтизной, что говорит об изменении рН.

После формирования монослоя (спустя 2 – 4 недели), наличие которого просматривали на инвертированном микроскопе Axio Vert. A1 («Carl Zeiss», Германия), клетки снимали с поверхности флакона 0,25 % раствором трипсина – Версена (1:1) и проводили пересадку, предварительно обработав флакон PBS.

Для определения цитологических характеристик полученные клетки окрашивали гематоксилином Карацци и водно-спиртовым раствором эозина.

При увеличении: х40; х100 определяли: размеры и количество клеток, образование комплексов, размеры и формы клеток и ядра, ядерно-цитоплазматическое отношение, количество и форму ядрышек, наличие митозов. Размеры ядер и клеток измеряли с помощью программного обеспечения ZEN («Carl Zeiss», Германия).

Форма клеток показывает уровень их дифференцировки и развития. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) – отношение между площадями цитоплазмы и ядра живой клетки является важной морфологической характеристикой, которая оценить уровень метаболизма, выявить проявление компенсаторных реакций.

Изменение размеров ядер и ядерно-цитоплазматического отношения могут служить индикатором воспалительных процессов, а также проявлениями некоторых форм онкологических заболеваний. Если ЯЦО равно или больше 1, это значит, что в клетке большое ядро и мало цитоплазмы, что указывает на низкий уровень метаболизма этих клеток.

Такие клетки функционально неактивны, однако они обладают способностью делиться, в норме. Наоборот, клетки, у которых ЯЦО меньше 1, имеют большой объем цитоплазмы и, следовательно, большое количество органелл. Они высокодифференцированы и способны активно функционировать.

  • В первой экспериментальной модели – культивирование меланоцитов на среде RPMI-1640, было сформировано 2 подгруппы:
  • 1) с содержанием ЭТС – 5 % (клеточные линии Mel I, Mel II);
  • 2) с содержанием ЭТС – 20 % (клеточные линии Mel III, Mel IV).
  • Для среды RPMI-1640 с содержанием ЭТС 5 % количество клеток х105/мл = 3,95±1,01, из них процент живых клеток составил – 40,07 % в пятом пассаже.
  • В соответствии с измеряемыми параметрами для каждой клеточной линии была составлена характеристика.

Проведенный анализ позволил выявить, что для линии онкомеланоцитов Mel I свойственны следующие характеристики: клетки варьируют по размеру от 306,7 мкм2 до 1250,6 мкм2 и лежат разрозненно.

Формы клеток данной линии различны от полигональной до звездчатой и трёхгранной. Встречаются атипичные клетки с крупными ядрами (до 230,2 мкм2), округлой формы. ЯЦО составляет 0,17. Количество ядрышек чаще от 2 до 4.

При визуальном исследовании препарата, в поле зрения был выявлен один митотически делящийся меланоцит.

В линии онкомеланоцитов Mel II клетки варьируют по размеру от 170,4 мкм2 до 2441,4 мкм2. Клетки расположены разрозненно и имеют полигональную, звездчатую, трёхгранную и веретеновидную формы.

Встречаются и гигантские клетки с крупными ядрами (до 571,8 мкм2), округлой формы. ЯЦО составляет 0,26. Количество ядрышек колеблется от 2 до 4.

В поле зрения было выявлено 2 митотически делящихся меланоцита.

Для среды RPMI-1640 с содержанием ЭТС 20 % количество клеток х105/мл = 5,97±1,5, из них процент живых клеток составил – 72,33 % (пятый пассаж).

Линии онкомеланоцитов Mel III свойственны следующие характеристики: клетки варьируют по размеру от 289,7 мкм2 до 590,9 мкм2.

Фиксировалось как разрозненное расположение клеток, так и плотные скопления. Размер ядра варьирует от 35,7 мкм2 до 166,5 мкм2, округлой, либо вытянутой формы. ЯЦО составляет 0,25.

Количество ядрышек чаще от 2 до 3. В поле зрения выявляется митотически делящийся меланоцит.

Клеточная линия опухолевидных меланоцитов Mel IV имела размер клеток от 134,4 мкм2 до 747,4 мкм2. Меланоциты группировались в плотные скопления, но местами были заметны и единичные, разрозненно лежащие клетки. Форма меланоцитов полигональная, трёхгранная, веретеновидная.

Размер ядра варьирует от 25,4 мкм2 до 91,4 мкм2, округлой, либо вытянутой формы. ЯЦО составляет 0,18. Количество ядрышек чаще от 1 до 5.

Во второй экспериментальной модели – культивирование меланоцитов на среде Melanocytes Growth Medium, было сформировано 2 подгруппы:

  1. 1) с содержанием ЭТС – 5 % (клеточные линии Mel V, Mel VI);
  2. 2) с содержанием ЭТС – 20 % (клеточные линии Mel VII).
  3. Для среды Melanocytes Growth Medium с содержанием ЭТС 5 % количество клеток х105/мл = 5,74±0,9, из них процент живых клеток составил – 53,20 % (пятый пассаж).

Для линии онкомеланоцитов Mel V свойственны следующие характеристики: клетки варьируют по размеру от 122,8 мкм2 до 712,8 мкм2, лежат разрозненно.

Форма клеток: полигональная, звездчатая, трёхгранная, веретеновидная, округлая. Размеры ядер клеток варьируют от 41,0 мкм2 до 251,0 мкм2. По форме ядра округлые. Количество ядрышек чаще 1 – 4, редко встречается 5.

В поле зрения было выявлено четыре митотически делящихся меланоцита.

Линии Mel VI характерны следующие измерения: клетки варьируют по размеру от 199,3 мкм2 до 2321,4 мкм2 и местами группируются в неплотные скопления. Форма различна от полигональной, звездчатой, трёхгранной, округлой. Ядра клеток размерами от 31,0 мкм2 до 609,1 мкм2, округлой формы. ЯЦО = 0,31, количество ядрышек чаще 1 – 4. В поле зрения было выявлено 4 митотически делящихся меланоцита.

Для среды Melanocytes Growth Medium с содержанием ЭТС 20 % количество клеток х105/мл = 6,51±1,2, из них процент живых клеток составил – 94,00 % (пятый пассаж).

Онкомеланоцитам Mel VII свойственны следующие характеристики: клетки варьируют по размеру от 149,2 мкм2 до 1076,0 мкм2, расположены они разрозненно, но местами могут группироваться в неплотные скопления. Были выявлены клетки полигональной, звездчатой, трёхгранной формы.

Ядра клеток размерами от 50,4 мкм2 до 235,8 мкм2, округлой формы. ЯЦО =0,21. Количество ядрышек чаще 1 – 4, в крупных клетках может быть больше.

В ходе эксперимента по изучению биологии меланоцитов мы пришли к выводу о том, что оптимальной средой для культивирования клеточных линий меланоцитов является среда Melanocytes Growth Medium с содержанием ЭТС 20 %, так как именно среди клеток линии, культивируемых на этой среде, наблюдалась наибольшая численность живых меланоцитов (94 %).

Наиболее благоприятным для культивирования оказался пятый пассаж.

Также была выявлена ведущая морфологическая форма онкомеланоцитов – полигональная (Mel I, Mel II, Mel VI, Mel VII), трёхгранная (Mel III, MelV), веретеновидная форма (Mel IV), преобладающее количество отростков у звёздчатых меланоцитов – 5–6. Наибольшее ядерно-цитоплазматическое отношение = 0,31 у линии Mel VI, культивируемой на среде Melanocytes Growth Medium с содержанием ЭТС 5 %, что указывает на пониженный уровень метаболизма и вероятную онкогенность клеток.

Библиографическая ссылка

Антонова Е.И., Бармина С.А., Волкова Е.С., Костина О.М.  КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ МЕЛАНОЦИТОВ И ИХ БИОЛОГИЯ ПРИ МЕЛАНОМЕ // Научное обозрение. Педагогические науки. – 2019. – № 5-2. – С. 15-18;
URL: https://science-pedagogy.ru/ru/article/view?id=2158 (дата обращения: 26.04.2022). Цитокины в развитии меланом.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector