Виды микробиологических исследований. Классификация микробиологических исследований. Микроскопический метод исследования. Микробиологический метод. Биологический метод исследования.

1

Медведева Л.С. 1

Суворова М.Г. 1
1 ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. академика Е. А. Вагнера Минздрава России
По данным ВОЗ (2002), около 95% взрослого населения планеты и 80% детского населения имеют те или иные признаки пародонтопатий. На сегодняшний день имеется тенденция к увеличению количества больных с заболеваниями пародонта.

Высокая распространенность заболеваний пародонта является одной из наиболее сложных и актуальных проблем в современной стоматологии. В последнее время увеличивается резистентность пародонтопатогенов к традиционной терапии, в связи с этим возникает проблема микробиологической диагностики для назначения адекватного лечения.

Распространенность заболеваний периодонта среди взрослого населения в мире превышает 75 %, антимикробная терапия при данных заболеваниях является важным этапом эндодонтического лечения.

В статье рассматриваются возможные варианты методов микробиологической диагностики при заболеваниях паро- и периодонта, преимущества и недостатки каждого из методов, что дает возможность врачу-стоматологу выбрать тот метод, который будет отвечать его целям, экономическим и техническим возможностям.

С помощью описанных микробиологических методов исследования врач-стоматолог сможет оценить количественный и качественный состав микрофлоры биологического материала при заболеваниях паро- и периодонта, а также определить эффективность антибактериальной терапии при данных заболеваниях.

методы микробиологической диагностики.

1. Александрова А. А.

Оценка стоматологического статуса и разработка комплекса индивидуальной гигиены полости рта у беременных с сахарным диабетом: (На правах рукописи). — Санкт-Петербург, 2017. — 137 с.
2. Аникаев А. Ю., Ломоносов А. М. Применение секвенирования нового поколения (NGS) в клинической Практике / А.Ю. Аникаев, А.М. Ломоносов // Лабораторная служба. – 2014. – № 1. – С. 32-36.
3.

Быкова Л. П., Годовалов А. П., Сибиряков Д. А. Изучение антимикробной активности SalviaOfficinalisL. и FucusVesiculosusL. // Актуальные проблемы медицины (27 янв. 2015 г., г. Гродно) – Гродно, 2015. – С. 96-97.
4. Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики // Москва: ИнтерЛабСервис, 2010. — 36 с.
5. Годовалов А. П., Быкова Л. П.

Антимикробная активность производных некоторых растений / А. П. Годовалов, Л. П. Быкова // Современные научные исследования и разработки. – 2017. – Т. 2, № 1. – С. 58-61.
6. Данилевский Н.Ф., Борисенко А.В. Заболевания пародонта / Н. Ф. Данилевский, А. В. Борисенко. – Киев: Здоровье, 2000. – 464 с.
7. Заболевания пародонта // Л. Ю. Орехова. – Москва: Поли Медиа Пресс, 2004. – С.

432.
8. Касоян К. Т., Джангирова Т. В., Шабалова И. П. Анализ результатов последовательного приготовления препаратов традиционным методом и методом жидкостной цитологии из материала из шейки матки / К. Т. Касоян, Т. В. Джангирова, И. П. Шабалова, Л. Г. Созаева // Новости клинической цитологии России. – 2012. – Т. 16, № 3-4. – С. 49.
9. Колчанова Н. Э.

Роль микрофлоры и ее способность формировать биопленку в патогенезе хронического периодонтита / Н. Э. Колчанова // Вестник Витебского государственного медицинского университета. – 2017. –Т. 16, № 5. – С. 127-135.
10. Лопухов Л. В., Эйдельштейн М. В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л. В. Лопухов, М. В.

Эйдельштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2000. – Т. 2, № 3. – С. 96-106.
11. Митронин А. В., Царёв В. Н., Ясникова Е. Я. Особенности контаминации экосистемы корневых каналов на этапах эндодонтического лечения острого периодонтита / А. В. Митронин, В. Н. Царёв, Е. Я. Ясникова, Д. А. Черджиева // Оригинальные статьи. – 2008. – № 1. – С. 26-32.
12.

Мозговая Л. А., Задорина И. И., Быкова Л. П. Микрофлора корневых каналов зубов в динамике лечения хронических форм апикального периодонтита / Л. А. Мозговая, И. И. Задорина, Л. П. Быкова, А. П. Годовалов // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2013. – Т. 9, № 3. – С. 447-449.
13. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR)/ Екимов А.Н., Шипулин Г.А.

, Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. http://www.interlabservice.ru/catalog/faq/?id=3422 (дата обращения 03. 10. 2018)
14. Токмакова С. И., Чудова Л.В. Состав микрофлоры пародонтального кармана при тяжелых формах пародонтита, устойчивых к стандартному лечению / С. И. Токмакова, Л. В. Чудова // Проблемы стоматологии. – 2014. – № 6. – С. 20-23.
15. Шибаева А. В. Исследование бактериальных консорциумов в качестве этиологического фактора развития болезней пародонта: — Москва, 2017 — 201 с.
16. Шишкин А. В. Выявление грибов рода Candida в составе микробных ассоциаций в дентине корневых каналов зубов при хронических периодонтитах / А. В. Шишкин // Вестник новых медицинских технологий. – 2011. –Т. 18, № 2. – С. 221-223.
17. Юдина Н. А. Диагностика болезней периодонта / Н. А. Юдина // Современная стоматология. – 2011. – № 1. – С. 26-32.

Лечение и реабилитация пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта являются одной из наиболее сложных проблем в стоматологии, что находит подтверждение в огромном количестве предложенных для этих целей средств и методов, которые далеко не всегда оказываются эффективными и необходимости использования лекарственных антимикробных препаратов избирательного действия [3, 7, 12].

Для определения вида возбудителя, назначения эффективного лечения и его оценки необходим микробиологический анализ патологического материала. Кроме того, с помощью микробиологической диагностики врач сможет конкретизировать диагноз и составить прогноз развития болезни [14].

Наиболее важными показаниями к проведению микробиологической диагностики являются такие заболевания как:

1. Острый язвенно-некротический гингивит.
2. Хронический пародонтит с частым рецидивированием и абсцедированием.
3. Болезни паро- и периодонта, устойчивые к лечению.
4. Агрессивные формы болезней пародонта (препубертатный, ювенильный пародонтит, быстропрогрессирующий у взрослых).
5. Тяжелые формы патологии пародонта на фоне системных заболеваний.
6. Комплексное лечение заболеваний пародонта с проведением системной антимикробной терапии, лоскутных операций, в случаях сложного протезирования или внутрикостной имплантации зубов, связанных с большими финансовыми затратами.

• Сегодня актуальна выработка стандартов диагностических исследований при заболеваниях пародонта, которые могут использоваться в повседневной практике врача-стоматолога [17].
• Цель исследования: на основе данных литературы сделать обзор методов диагностики микрофлоры при заболеваниях пародонта, рассмотреть преимущества и недостатки каждого из методов, что даст возможность врачу-стоматологу выбрать тот метод, который будет отвечать его целям, экономическим и техническим возможностям.
• Цитологический метод исследования

Содержимое пародонтального кармана изучают по методике П. М. Покровского и М. С. Макаровой в модификации И. А. Бенюмовой (1962). Пародонтальные карманы предварительно промывают изотоническим раствором хлорида натрия, стерильной корневой иглой с турундой производят забор материала.

Забор содержимого из корневого канала проводится на этапе механической обработки корневых каналов стерильным эндодонтическим инструментом (H-файлом) (методика А. А. Кунина, 2003) [16].

Исследуемый материал распределяется на предметном стекле. Препарат фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Граму и Гимзе-Романовскому. Далее материал высушивается и микроскопируется при помощи светового микроскопа [1, 6].

1. Преимущества: простота в использовании
2. Недостатки: не позволяет определить вид возбудителя и его чувствительность к антибактериальным препаратам
3. Метод жидкостной цитологии
4. Жидкостная тонкослойная цитология – это способ получения монослойных цитолологических препаратов при переносе клеток из фиксирующего или транспортного растворов с использованием методов центрифугирования, осаждения и/или фильтрации.

С помощью урогенитального зонда или стоматологических бумажных адсорбентов производится забор материала из пародонтального пространства.

Материал сразу помещается в специальный контейнер (виалу) и отправляется в лабораторию.

В лаборатории виалы в базовых штативах помещаются в цитопроцессор, проводится обработка цитологического материала с полным сохранением клеточных и субтканевых структур. Производят окрашивание по методу Папаниколау [10].

• Преимущества:
• – быстрый и удобный микроскопический анализ: препарат занимает небольшую площадь, клетки располагаются в один слой, в скоплениях хорошо видна структура ядер;
• – возможность неоднократного приготовления препаратов из одного и того же контейнера;
• – более высокая информативность по сравнению с традиционным цитологическим методом за счет обеспечения сохранности клеточных структур.
• Недостатки:
• – более высокая, по сравнению с традиционной цитологией, стоимость пробоподготовки;
• – необходимость дополнительного оборудования для приготовления препаратов;
• – необходимость дополнительного обучения для интерпретации результатов [8].
• Бактериологический метод исследования

Забор содержимого пародонтального кармана проводят стерильной ватной турундой на глубине 2 мм. Затем концевую часть турунды промывают в 10 мл физиологического раствора и получают взвесь микроорганизмов [6].

Забор содержимого корневого канала проводится следующим образом. Коронку зуба очищают от зубного налета гигиенической полировочной щеткой с последующей обработкой 3 %-ой перекисью водорода.

После препарирования кариозной полости, раскрытия полости зуба, обеспечения эндодонтического доступа в канале H-файлом № 15-20 инструментальными движениями с ирригацией физиологическим раствором создают суспензию инфицированного состава, которую забирают с помощью стерильного бумажного штифта [11].

Образцы полученных проб помещают в транспортные системы и в течение 24 часов доставляют в бактериологическую лабораторию.

Далее делают секторальный посев по методике Мельникова-Царева на 5 % кровяном агаре  Шедлера, для идентификации микроорганизмов в современных условиях используют специальные тест-системы [9].

Определяют чувствительность выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также к препаратам растений, действие которых активно изучают в последнее время [3, 5].

1. Преимущества:
2. – позволяет установить видовой состав микрофлоры;
3. – возможность определения чувствительности микроорганизмов к определенным антибактериальным препаратам
4. Недостатки:
5. – дороговизна;
6. – чувствительность к забору материала, транспортировке и условиям проведения
7. ПЦР
8. Сбор мягкого зубного налета производят методом смыва из пародонтального кармана (в случае патологии) или из десневой бороздки (в случае нормы) с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов [15].

Сбор твёрдого зубного налета производят следующим образом. После предварительного полоскания ротовой полости водой проводят обработку ватным тампоном зуба с целью полного удаления мягкого налета и соскабливают поддесневой твердый налет, используя кюрету Грейси [14].

Исследуемый материал помещают в пробирки с транспортной средой, предварительная обработка материала не требуется. ПЦР проходит в 3 этапа: выделение ДНК/РНК, амплификация ДНК/РНК-фрагментов, детекция ДНК/РНК-продуктов амплификации. Современные ДНК/РНК тесты способны идентифицировать от 3 до 11 периодонтопатогенов [4, 11, 13, 17].

• Преимущества:
• – высокая специфичность;
• – высокая чувствительность;
• – возможность анализа до 96 образцов за один запуск (использование при скрининговых исследованиях большого числа пациентов) [2];
• – не требует специальных транспортных сред (для проведения анализа необязательно присутствие живых микроорганизмов);
• – быстрый результат (весь процесс с момента передачи в лабораторию занимает не более одного рабочего дня);
• – за счет автоматической интерпретации полученных результатов снимается проблема субъективной оценки;
• – возможность определения чувствительности к антибактериальным препаратам
• Недостатки:
• – дороговизна;
• – ограничение оценки лекарственной устойчивости (данные о конкретных генетических механизмах резистентности могут отсутствовать, резистентность к препаратам часто связана с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип);
• – возможность ложноположительного результата в результате загрязнения исследуемого материала и ложноотрицательного результата в результате ингибирования реакции компонентами биологических образцов [9].

Таким образом, на клиническом приеме врач-стоматолог при лечении заболеваний пародонта в целях определения вида возбудителя, назначения эффективного лечения и его оценки может использовать различные методы микробиологической диагностики. Выбор определяется преимуществами и недостатками каждого метода.

Цитологический метод позволяет определить только наличие микрофлоры без возможности определить вид возбудителя и чувствительность к противомикробным средствам. Метод жидкостной цитологии является более информативным, однако также не дает возможности определения чувствительности к противомикробным средствам и является более дорогим.

Бактериологический метод позволяет установить видовой состав микрофлоры, определить чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам, но является еще более дорогим и имеет чувствительность к забору и транспортировке материала.

Метод ПЦР позволяет с высокой точностью определить видовой состав микрофлоры, не требователен к забору и транспортировке материала, дает возможность определения чувствительности к антибактериальным препаратам, однако имеет высокую стоимость и возможны ложные результаты.

Библиографическая ссылка

Медведева Л.С., Суворова М.Г. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРО- И ПЕРИОДОНТА // Международный студенческий научный вестник. – 2018. – № 6. ;
URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=19262 (дата обращения: 14.04.2022).

Микроскопия микробиологических препаратов

Микроскопическое исследование клинических образцов (мокроты, гноя, отделяемого из ран, ликвора и пр.

) является важным этапом микробиологического анализа, позволяющим получить предварительные данные о качественном и количественном составе микрофлоры в патологическом матери­але, а также оценить соответствие материала очагу воспаления. Иногда микроскопия помогает выявить микробы, не растущие на обычных питательных средах.

Микроскопия мазков из чистых культур бактерий позволяет определить их морфологию, что наряду с окраской по Граму является важным ориентиром в выборе направления последующей их идентификации.

При изучении микробиологических объектов чаще используют световую микроскопию окрашенных препаратов под иммерсией (объектив х 90).

При микроскопии в темном поле эффект создается при помощи специального конденсора-параболоида или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью, а объект кажется светящимся на фоне темного поля зрения. Препарат готовят по типу раздавленной или висячей капли; применяется для индикации спирохет, боррелий, лептоспир.

Фазово-контрастная микроскопия может использоваться для изучения без предварительной обработки бесцветных, прозрачных объектов (живых клеток, срезов тканей и т.п.), детали строения которых оптически мало различаются между собой.

Суть метода заключается в том, что с помощью специального устройства конденсора и объектива разность фазовых колебаний, проходящих через биологический объект и окружающую среду световых волн, недоступных человеческому глазу, преобразует­ся в разность интенсивностей (амплитуд) света, благодаря чему детали строения объекта становятся видимыми. Метод аноптральной микроскопии является дальнейшим развитием метода фазового контраста (в его основе сохраняется тот же принцип) и отличается большей разрешающей способностью объективов и возможностью выявления минимальных оптических разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Люминесцентная микроскопия позволяет получить цветное изображение самосветящихся объектов на черном фоне свысокой степенью их контрастности с помощью люминесцентного микроскопа.

Она основана на явлении флюоресценции (или люминесценции), когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Поэтому вещества, имеющие определен­ный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиоле­товыми лучами приобретают совершенно иную окраску.

Объект, не видимый в ультрафиолетовом свете, может пробрести яркий блеск после обработки его флюоресцирующим веществом (флюорохромом). В таком препарате сила свечения объектов бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в затемненном помещении.

В зависимости от используемого флюорохрома применяют строго определенный набор светофильтров. Важно ис­пользовать специальное нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

• Для обнаружения и идентификации бактериальных антигенов ис­пользуют меченые флюорохромом иммунные сыворотки в реакциях прямой и непрямой иммунофлюоресценции.
• Приготовление препаратов для микроскопии
• От качества приготовления препарата во многом зависит ре­зультат микроскопии.
• Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Это достигается разными способами, из которых наиболее доступны нижеследующие:
• • стекла кипятят 15 мин в 1% растворе соды (или в мыльной воде), споласкивают водой, помещают в слабую соляную кислоту и, наконец, хорошо промывают водой;

   •    стекла обрабатывают жидкостью следующего состава: калия бихромат 20 г, серная кислота (техническая) 20 г, вода 200 мл; после 20 минут кипячения в этой смеси промывают стекло водой, а затем спиртом. Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси рав­ных количеств спирта и эфира, или в 96° спирте, или промытыми и вытертыми досуха.

Микроорганизмы можно исследовать в живом состоянии ив окрашенных препаратах.

а) Исследование микроорганизмов в живом состоянии про­водят для изучения формы и подвижности бактерий либо ввисячей, либо в раздавленной капле.

Для висячей капли необходимо иметь специальное предметное стекло с луночкой.

Маленькую капельку бульонной культуры наносят на покровное стекло; если исследуют агаровую культуру, то на покровное стекло предварительно наносят небольшую каплю воды или физиологического раствора, куда затем вносят петлей незначительное количество бактерий и размешивают их.

 Можно заранее приготовить взвесь культуры в физиологическом растворе и взять капельку из нее. И в том, и в другом случае на покровное стекло накладывают предметное стекло так, чтобы капля оказалась в луночке, края которой предварительно смазы­вают вазелином.

Стерла слегка прижимают друг кдругу, в резуль­тате чего они склеиваются, образуя герметически закрытую камеру, в которой капля долго не высыхает. Препарат микроскопируют покровным стеклом кверху.

Для раздавленной капли пользуются простым предметным стеклом, куда наносят материал (физиологический раствор и культуру), накрывая его покровным стеклом.

Капельки нужно брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между стеклами и не выступали за края покровного (избыток материала удаляют фильтровальной бумагой). Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной.

Для микроскопии лучше использовать фазово-контрастную или ант-ропольную установку.

б) Исследование окрашенных препаратов позволяет не толь­ко изучить морфологию бактерий, но и судить о некоторых деталях их химического строения, что достигается применением специальных красок.

Для приготовления препаратов из жидких культур каплю мате­риала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде берут петлей ничтожное количество и раз­мешивают в заранее нанесенной на стекло капле воды или физиологического раствора, размазывая по стеклу до диаметра мазка 1,5-2 см.

Мазок высушивают на воздухе, затем его фиксируют (в этом случае мазок будет хорошо держаться на стекле, а убитые бактерии лучше воспринимают окраску). Самый простой и распространенный способ — фиксация жаром.

 Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки (время фиксации не должно превышать 5-6 сек, а время прямого воздействия пламени — 2 сек). Во избежание перегрева препарата контролем может служить прикосновение стекла к тыльной поверхности ладони (должно быть ощущение легко переносимого жжения).

Для фиксации можно использовать химические вещества: этиловый 95° спирт (время фиксации 10-15 мин), метиловый спирт (2-3 мин), ацетон (5 мин), смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову (10-15 мин) и др.)

Методы исследований в микробиологии

ВведениеМикроскопический метод исследованияМикробиологический методБиологический методСерологический методАллергологический методЗаключениеИсточники

Введение

В настоящее время проведение микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме (или другом исследуемом объекте) возбудителей инфекционных заболеваний. Классические микробиологические методы исследования решают задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией по биохимическим, антигенным и другим признакам [1]. Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы [3]. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать правильный метод лечения этого заболевания.

• Цель: Описать основные микробиологические методы исследований, применяемых в биологии и медицине.
• Задачи: — охарактеризовать основные методы исследований в микробиологии по литературным источникам;
• — ознакомить учащихся с основными микробиологическими методами исследований в кратком изложении.

Микроскопический метод

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.

Микроскопические методы исследований включают в себя приготовление мазков и препаратов для микроскопирования.

В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены явных морфологических (т.е. структурных) внешних и внутренних особенностей.

Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (например, наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить сам факт наличия или отсутствия микроорганизмов в исследуемых образцах.

Существуют световая, фазово-контрастная, темнопольная (ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия [2].

Микробиологический метод

Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале.

Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, культуральных, биохимических, антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает также определение чувствительности к антимикробным препаратам (например, к антибиотикам) у выделенного возбудителя.

Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров и т.д.

Биологический метод

Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение самого возбудителя (особенно при его незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают в себя заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы.

Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённой массы тела и возраста.

Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутривенно, внутримышечно, подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга).

У животных прижизненно забирают кровь, экссудат (скопившуюся жидкость) из брюшной полости, после гибели — кровь, кусочки различных органов, экссудаты из различных полостей [3].

Серологический метод

Серологические методы исследований для выявления специфических антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудителя не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров антител (т.е.

их концентрации), в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным).

Aнтитела обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для эпидемиологических исследований.

Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов, порождающих антитела. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Аллергологический метод

Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, т.е. способны вызывать аллергические реакции. Это используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований.

Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз.

Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю [4].

Заключение

В данной работе были кратко описаны основные методы исследований в микробиологии (микробиологические методы исследований): 1. Микроскопический метод.2. Микробиологический метод.3. Биологический метод.4. Серологический метод.

5. Аллергологический метод.

С помощью методов, применяемых в микробиологии, люди научились выявлять и определять различного рода возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний. Правильно выбранный метод способствует в дальнейшем правильному лечению заболеваний.

В настоящее время наиболее широко используются микроскопический, микробиологический и биологический методы исследования, потому что именно благодаря этим методам можно выявить причину возникновения и проявления инфекционных болезней у живых организмов и дать верную характеристику возбудителям этих болезней.

Источники:

Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов

• Микробиология. Лабораторный практикум
• Волгоград 2012
• Введение

Микробиология(от греч.

micros — малый, bios — жизнь, logos — учение) — наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов мельчайших форм жизни растительного или животного происхождения, не видимых невооруженным глазом.

Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы). По своей сути микробиология является биологической фундаментальной наукой.

Для изучения микроорганизмов она использует методы других наук, прежде всего физики, биологии, биоорганической химии, молекулярной биологии, генетики, цитологии, иммунологии. Как и всякая наука, микробиология подразделяется на общую и частную.

Общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на всех уровнях: молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой.

Предметом изучения частной микробиологии являются отдельные представители микромира в зависимости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую природу, в том числе человека. К частным разделам микробиологии относятся: медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская, космическая микробиология.

Медицинская микробиология изучает патогенные для человека микроорганизмы: бактерии, вирусы, грибы, простейшие. В зависимости от природы изучаемых патогенных микроорганизмов медицинская микробиология делится на бактериологию, вирусологию, микологию, протозоологию.

Каждая из этих дисциплин рассматривает следующие вопросы:

морфологию и физиологию, т.е. осуществляет микроскопические и другие виды исследований, изучает обмен веществ, питание, дыхание, условия роста и размножения, генетические особенности патогенных микроорганизмов;

1. роль микроорганизмов в этиологии и патогенезе инфекционных болезней;
2. основные клинические проявления и распространенность вызываемых заболеваний;
3. специфическую диагностику, профилактику и лечение инфекционных болезней;
4. экологию патогенных микроорганизмов.
5. К разделам микробиологии относят также санитарную и клиническую микробиологию.

Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды, взаимоотношение микрофлоры с организмом, влияние микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности на состояние здоровья человека, разрабатывает мероприятия, предупреждающие неблагоприятное воздействие микроорганизмов на человека. В центре внимания клинической микробиологии. Роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, диагностика и профилактика этих болезней.

Фармацевтическая микробиология исследует инфекционные болезни лекарственных растений, порчу лекарственных растений и сырья под действием микроорганизмов, обсемененность лекарственных средств в процессе приготовления, а также готовых лекарственных форм, методы асептики и антисептики, дезинфекции при производстве лекарственных препаратов, технологию получения микробиологических и иммунологических диагностических, профилактических и лечебных препаратов.

Ветеринарная микробиология изучает те же вопросы, что и медицинская микробиология, но применительно к микроорганизмам, вызывающим болезни животных.

Микрофлора почвы, растительного мира, влияние ее на плодородие, состав почвы, инфекционные заболевания растений и т.д. находятся в центре внимания сельскохозяйственной микробиологии.

Морская и космическая микробиология изучает соответственно микрофлору морей и водоемов и космического пространства и других планет.

Техническая микробиология, являющаяся частью биотехнологии, разрабатывает технологию получения из микроорганизмов разнообразных продуктов для народного хозяйства и медицины (антибиотики, вакцины, ферменты, белки, витамины). Основа современной биотехнологии — генетическая инженерия.

Многочисленные открытия в области микробиологии, изучение взаимоотношений между макро- и микроорганизмами во второй половине XIX в. способствовали началу бурного развития иммунологии.

Вначале иммунология рассматривалась как наука о невосприимчивости организма к инфекционным болезням. В настоящее время она стала общемедицинской и общебиологической наукой.

Доказано, что иммунная система служит для защиты организма не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных организму веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды организма, т.е. гомеостаза.

Иммунологияявляется основой для разработки лабораторных методов диагностики, профилактики и лечения инфекционных и многих неинфекционных болезней, а также разработки иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов, иммуномодуляторов, аллергенов, диагностических препаратов). Разработкой и производством иммунобиологических препаратов занимается иммунобиотехнология самостоятельный раздел иммунологии.

Современная медицинская микробиология и иммунология достигли больших успехов и играют огромную роль в диагностике, профилактике и лечении инфекционных и многих неинфекционных болезней, связанных с нарушением иммунной системы (онкологические, аутоиммунные болезни, трансплантация органов и тканей и др.).

Тема №1. «Микробиологическая лаборатория, ее задачи. Техника безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа и техника микрокопирования. Основные формы бактерий, определение их величины»

Цель занятия: Изучить микробиологическую лабораторию. Технику безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа.

Материалы и оборудование:

Ветеринарные лаборатории – это учреждения государственной ветеринарной службы, деятельность которых направлена на обеспечение благополучия в животноводстве, предупреждение и ликвидацию болезней и гибели животных, а также на охрану населения от болезней, общих для человека и животных (зооантропонозов). По значению бывают: районные, межрайонные (зональные), областные (краевые) и республиканские.

Основная задача ветеринарных лабораторий – установление точного диагноза болезней сельскохозяйственных животных, включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел, а также экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов животного и растительного происхождения. Также выполняются научно – исследовательские работы, осуществляют производство некоторых антибиотиков, биостимуляторов.

Лаборатория занимает отдельное здание, расположенное вдали от проезжих дорог. В ней должно быть приемное отделение, патологоанатомический, биохимический и вирусологический отделы, спец помещения для термостатов, мытья посуды, автоклавная.

В лаборатории столы для работы расположены у окна так, чтобы было максимум света и удобств. При небольшом количестве окон в лаборатории для занятий можно использовать столы трапециевидной формы, такие столы ставят перпендикулярно к окну, края столов должны быть скошены под углом 70-80°, это позволяет сидящим дальше от окна беспрепятственно пользоваться светом.

Столы покрываются пластиком, толстым стеклом. Вдоль стола, посередине ставят штативы для пробирок, флаконы, капельницы с красителями в штативах, колодках, спиртовки или горелки.

По этому же ряду монтируют освещение, которое должно быть приближено к естественному. Для занятий по проведению биологических исследований, вскрытию органов желательно иметь дополнительный небольшой стол.

Для полного обеспечения учебного процесса в лаборатории должны быть культуры микроорганизмов, аппаратура и подсобные помещения:

Моечная

Должны иметься столы, раковины, электрические и газовые плиты, сушильные и вытяжные шкафы, которые необходимы для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены должны быть облицованы плиткой.

Стерилизационная

Оборудована 1 или 2 стерилизаторами паровых, столом, при наличии 2-х паровых стерилизаторов занятия в нескольких подгруппах можно проводить без длительного перерыва, а во время повреждения одного из них, пользуются другим.

Здесь должна быть хорошая вентиляция для удаления остатка пара, выходящего после открывания стерилизатора. Пар из стерилизатора выводят через резиновую трубку во внешнюю среду или направляют в ведро с водой. Дверь неостекленная, окна открываются наружу.

Средоварочная

Необходима для приготовления питательных сред. Стены должны быть покрыты плиткой или покрашены масляной краской. Пол выложен плиткой или настелен линолеум. Здесь необходимы электрические или газовые плита, ящик с отсеками для сред в пробирках, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясные среды, холодильник.

• Термостатная
• Могут быть термостаты разных форм и размеров для выращивания плесневых грибов; температура должна быть 20-25°С, для большинства сапрофитов 25-30°С, для возбудителей инфекционных болезней температура 35-37°С.
• Препараторская

Место для работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к лабораторно-практическим занятиям. Здесь располагается всё необходимое для проведения учебного процесса, а также дистиллятор, весы, центрифуга и т.д.

Бокс-комната

Предназначена для посева и пересева культур микроорганизмов и проведения научно-исследовательской работы, которая требует стерильных условий. Комната должна иметь предбоксник (тамбур) с раздвижной дверью, остекленной; стекла должны быть хорошо промазаны, чтобы не проникал воздух из окружающей среды и микроорганизмы.

Стены обложены плиткой или выкрашены масляной краской, на полу линолеум.

Моют бокс влажным способом с применением дезинфицирующих средств: 2-3% раствором соды (Na2HCO3), гидрокарбонатом натрия (NaHCO3) или 3-5% раствор фенола.

Воздух стерилизуется бактерицидной лампой (БУВ-15), которая излучает ультрафиолетовые лучи. Стерилизация проводится от 30 мин до нескольких часов.

Нахождение в комнате с включенной бактерицидной лампой нежелательно, т.к. УФ лучи вызывают острое воспаление роговицы глаза.

Виварий

Это помещение, где содержат белых мышей, крыс, морских свинок и т.д. Их используют в научно-исследовательских работах, реже на занятиях, поэтому, где нет условий, вивария нет. Реактивы и некоторые биопрепараты хранят в подвальных помещениях или темном стенном шкафу, где сухо, невысокая температура и нет резких колебаний в течение года.

Материалом для лабораторных исследований служат: кровь, моча, кал, мокрота, молоко, фекалии, содержимое абсцессов (гной), полученные при жизни животного, кусочки паренхиматозных органов или других тканей после их гибели, пробы объектов окружающей среды. Материал исследуют бактериологическими, серологическими, гистологическими, биохимическими, микологическими и токсикологическими методами, для чего должны быть созданы необходимые условия (оборудование, специально отведенные помещения)

В лаборатории выделено специальное место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы специальных красителей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой, банкой с дезинфицирующим раствором.

Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами.

В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей предназначена следующая аппаратура:

Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов составляет 37°С. Термостаты бывают воздушными и водяными.

Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

Холодильники. Используют в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, сывороток, вакцин и прочих биологических препаратов при температуре около 4°С. Для хранения препаратов ниже 0°С предназначены низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура —20 °С и ниже.

Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги с различными режимами работы.

Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Предназначен для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

Для уничтожения микроорганизмов в воздухе и на поверхностях существуют различные способы дезинфекции.

Воздух в лаборатории частично очищают проветриванием. Вентиляция резко снижает численность микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице температур снаружи и внутри помещения. Продолжительность проветривания не менее 30…60 мин.

Более эффективный способ обеззараживания воздуха — воздействие ультрафиолетовым излучением (УФИ), обладающим высоким антимикробным действием и вызывающим гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. Стерилизация 30 мин до нескольких часов в зависимости от степени загрязненности воздуха.

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего используют 0,5…3%-й водный раствор хлорамина.

Особенно тщательно следует дезинфицировать поверхность стола, на котором проводится работа с микроорганизмами. Ее необходимо протирать дезинфицирующим раствором как перед началом работы, так и после окончания.

1. Правила и техника безопасности при работе в лаборатории.
2. · Заходить и работать в микробиологической лаборатории только в халате, чепчике, бахилах.
3. · Не вносить в лабораторию посторонних вещей
4. · Работать на одном и том же месте и пользоваться закрепленным оборудованием
5. · Соблюдать чистоту и опрятность
6. · Во избежание заражения во время перерыва в работе не курить и не есть
7. · Работая с каким-либо материалом работать как с особо опасным предметом
8. · По окончании занятий рабочее место и оборудование приводить в порядок
9. · Во избежание взрыва не зажигают одну спиртовку от другой
10. · Не прикасаются металлическими предметами к проводам и контактными частями электросети
11. · Без разрешения преподавателя или обслуживающего персонала не включать оборудование
12. · Соблюдать правила обращения с химическими и другими реактивами
13. · Уходя, вымыть руки материал, используемый на учебных занятиях, принимают за особо опасный;
14. · При распаковке материала, присланного для исследования, необходимо соблюдать осторожность: банки снаружи обтирают дезинфицирующим раствором и ставят только на подносы или кюветы;
15. · При исследовании поступившего материала и при работе с бактериальными культурами соблюдают общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность инфицирования работника;

Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.

Цель занятия: научиться пользоваться микроскопом, изучить морфологию микроорганизмов.