Реакция преципитации (РП) – это формирование и осаждение из раствора комплекса растворимого молекулярного антигена (преципитиногена) с антителами (преципитинами) в виде помутнения, называемого преципитатом.Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Для РП используются коллоидные растворы антигена. Преципитиноген – это молекулярный продукт разрушенных клеток микроорганизмов, например, бактериальный белок, полисахарид, вытяжки из инфицированных органов. Степень разведения преципитиногена обычно велика – 1: 1млн и более.
Преципитирующие сыворотки изготавливают централизованно путем гипериммунизации животных (кроликов, коз, ослов) взвесью бактерий, фильтратами бульонных культур, солевыми экстрактами микроорганизмов или сывороточными белками.
Титр преципитирующей сыворотки, в отличие от титра других диагностических сывороток, определяется максимальным разведением антигена, который дает преципитацию с этой сывороткой.
Преципитирующие сыворотки выпускаются с титром не ниже 1:100000.
Существует несколько модификаций постановки реакции преципитации:
1. Реакция кольцепреципитации– наслаивание раствора антигена на преципитирующую сыворотку в специальных преципитационных пробирках.
…
Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации использовать прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации(реакция Асколи при сибирской язве).
Недостатками реакции кольцепреципитации являются нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании, а также невозможность установить количество разных антигенов, участвующих в формировании преципитата.
2. Реакция преципитации в геле основана на взаимодействии гомологичных антител и антигенов в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Антитело и антиген в результате встречной диффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы в виде белых мутных полос.
При наличии в растворе нескольких антигенов они диффундирую независимо друг от друга, при этом количество полос равно количеству антигенов. Серологически родственные антигены образуют полосы преципитации, сливающиеся друг с другом, полосы разнородных антигенов перекрещиваются.
Антиген, используемый в реакции, должен быть концентрированным, а сыворотки – с высоким титром антител. В качестве геля используют прокипяченный и остуженный 0,8-1% раствор специального агара.
Вопрос 3. Реакция гемолиза.
Реакция гемолиза – это растворение эритроцитов при взаимодействии с антителами-гемолизинами в присутствии комплемента.
Гемолизины получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана, полученная таким образом сыворотка называется гемолитической. Комплемент – это белковые фракции сыворотки крови морской свинки.
Реакция гемолиза проявляется растворением (гемолизом) эритроцитов барана, при этом взвесь эритроцитов в физиологическом растворе превращается в прозрачную ярко-красную жидкость (лаковая кровь).
АГэ+АТгс+К= гемолиз
Рмп (реакция микропреципитации) — что это за анализ, расшифровка, отрицательный и положительный результаты
Реакция микропреципитации (РМП) – экспресс-метод диагностики сифилиса. Это исследование позволяет определить в крови пациента наличие или отсутствие возбудителей сифилиса. Сейчас оно проводится вместо реакции Вассермана (RW).
Суть анализа заключается в выявлении антител к кардиолипину — компоненту внутренней мембраны бактерий и митохондрий.
Такие антитела формируются на стадии первичного сифилиса, в течение 7–10 дней после образования твердого шанкра. РМП может быть положительным и при других заболеваниях, при которых возможно разрушение тканей.
Это связано с присутствием кардиолипина в качестве фосфолипида в различных клеточных мембранах.
Особенности анализа
Сифилис у человека вызывает бледная трепонема. Это одноклеточная бактерия, относящаяся к спирохетам. На ранних стадиях развития возбудитель заболевания активно размножается, но, в результате иммунных реакций, а также действия факторов неспецифического иммунитета, часть трепонем погибает.
Гибель клеток бактерии вызывает появление большого количества липоидных молекул из разрушенных клеточных мембран возбудителя сифилиса. Иммунная система формирует по отношению к ним защитные антитела.
Ткани, которые были повреждены действием бледной трепонемы, разрушаются. Клеточные митохондрии, которые при этом повреждаются, высвобождают фосфолипиды, в числе которых – кардиолипин. Последний представляет собой собственный антиген организма липидного происхождения. Он появляется в организме при разрушении клеток. Антиген схож с липидными антигенами бледной трепонемы.
Реакция микропреципитации – микрореакция крови на кардиолипиновый антиген (экстракт бычьей сердечной мышцы), который по своей природе схож с возбудителем сифилиса. Когда в пробу с кровью пациента вводится антиген, проводится проверка на ответную реакцию. Если в организме человека сформировались антитела к вирусу (защитные белки), то они отреагируют на этот реагент.
Качественная оценка реакции определяется по объему выпавшего осадка и величине хлопьев. Образование осадка оценивают в условных единицах, плюсами (+), от одного до четырех.
Результат РМП получают всего через 10-40 минут.
В отличие от RW, анализ РМП более чувствителен. В то же время он уступает первому по специфичности.
Это исследование позволяет не только выявить наличие инфекции в организме, но и проследить динамику течения заболевания.
Реакция микропреципитации – нетрепонемный тест, который позволяет определить заражение сифилисом через 1–2 недели с момента образования первичной сифиломы (твердого шанкра). Сифилома – клиническое проявление защитных процессов, куда входят местные клеточные и гуморальные специфические реакции, направленные на уничтожение бледных трепонем в месте их изначального внедрения в организм.
Показания к проведению
Анализ РМП назначают при обнаружении у пациента симптомов, характерных для сифилиса. Это:
- повышение температуры до 37–38,5 градусов, ее сохранение в течение длительного времени;
- общая слабость, сопровождающаяся кашлем и насморком;
- регулярные суставные и мышечные боли;
- локальное облысение;
- образование на месте внедрения шанкра – язвы с твердым основанием и плотными краями;
- появление багровых пятен на слизистой оболочке горла;
- появление многочисленных пустул с белыми кончиками;
- появление бледно-розовых пятен на коже, которые не причиняют боль и дискомфорт;
- кондиломы багрового или фиолетового цвета.
На поздних стадиях сифилиса на коже образуются инфекционные бугры и гуммы, которые периодически изъязвляются и оставляют рубцы. Это сочетается с поражением головного мозга, сердечно-сосудистой системы, печени, костей, глаз.
РМП обязательно назначают лицам, которые проходят обследование для получения санитарной книжки. Также анализ показан при:
- срочной госпитализации;
- подготовке пациента к операции;
- наличии ВИЧ;
- беременности;
- проверке состояния здоровья потенциального донора органов.
Также этот тест назначают пациенту, завершившему курс лечения сифилиса, для оценки его эффективности.
Расшифровка анализа
Качественный анализ на реакцию микропреципитации позволяет получить всего 2 результата: положительный и отрицательный.
Отрицательный анализ означает, что антитела отсутствуют. Это возможно, если пациент не заражен бледной трепонемой.
Также отрицательный результат может означать, что с момента заражения сифилисом прошло слишком мало времени, и антитела не успели выработаться.
Еще один вариант толкования отрицательного РМП – хроническая инфекция на поздней стадии. Такой результат обозначают знаком «-» либо словом «отрицательно».
Положительный результат указывает на то, что антитела выявлены, то есть пациент заражен сифилисом. В таком случае на бланке указывают знак «+», оставляют надпись «положительно» либо делают печатью оттиск «антитела к сифилису выявлены».
Результат РМП может быть ложноположительным. Это бывает у пожилых людей, а также при наличии ряда заболеваний. Это:
- СПИД;
- туберкулез;
- красная волчанка;
- ревматоидный артрит;
- хламидиоз;
- сахарный диабет;
- подагра;
- лептоспироз;
- тиреоидит;
- мононуклеоз;
- вирусный гепатит;
- склеродермия.
При инфаркте миокарда анализ на определение антител к бледной трепонеме также может быть ложноположительным.
Для пациентов со всеми перечисленными заболеваниями и отклонениями РМП не может быть использован в качестве единственного метода определения сифилиса. Дополнительно антитела нужно определять методами ИФА (иммуноферментного анализа) или пассивной гемагглютинации.
Подготовка к анализу
Чтобы получить достоверный результат, к сдаче крови нужно подготовиться. Основные рекомендации:
- сдавать натощак, после сна;
- утром перед сдачей не завтракать, не пить кофе и чай, а также другие напитки (можно пить воду);
- не курить перед анализом в течение двух часов;
- в течение двух дней перед забором крови соблюдать щадящий режим питания, исключив жареное, жирное, острое, а также отказаться от спиртного;
- за день до анализа ограничить повышенные физические и психоэмоциональные нагрузки.
Анализ РМП не сдают после физиотерапевтических процедур и инструментальных исследований (УЗИ, рентгенография и т.д.).
Микрореакция преципитации (МР) на сифилисRapid Plasma Reagin (RPR)
Микрореакция преципитации является нетрепонемным тестом,основанным на иммунологической реакции антиген-антитело.Реакция определяет в крови так называемые реагиновые антитела,которые организм вырабатывает против липидов поврежденных бледной трепонемой клеток организма и ,возможно, липопротеинов мембраны спирохет.Антилипидные антитела могут вырабатываться при многих заболеваниях и состояниях организма,сопровождающихся
разрушением тканей,поэтому микрореакция преципитации является не подтверждающим сифилис тестом,а отборочным.
Микрореакцией тест назван в связи с тем,что для исследования необходимо незначительное количество исследуемого материала и реагентов,а преципитацией (от лат. Precepitacio — падение) в связи с тем,что обрузующийся в результате реакции антиген-антител комплекс выпадает в осадок (преципитация) с образованием хлопьев (флоккуляция).
Разновидности микрореакций1. Микроскопический тест — оценка результатов реакции с использованием световой
микроскопии для подсчета преципитантов — VDRL ( (по названию лаборатории-разработчика – Venereal Diseases Research Laboratory) — реакция с инактивированной сывороткой крови.
При подозрении на нейросифилис при помощи VDRL исследуют спинномозговую жидкость.
- Количественная микрореакция преципитации
2.
Макроскопический тест — оценка результатов реакции невооруженным глазом -тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins, RPR),применяется в России под названиями реакция преципитации (РПР) с кардиолипиновым антигеном,отборочная реакция
на сифилис (ОРС),микрореакция преципитации (МР),экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).
Для подсчета применяют так называемые визуализирующие агенты,вовлекающиеся в комплекс антиген-антитело (чаще частицы угля и частицы толуидинового красного).Проводится методом серийного разведения исследуемой сыворотки крови.Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови,где обнаружен преципитат.
Когда применяется микрореакция преципитации
Скрининг на сифилисМассовое обследование определенных групп населения.Для скрининга применяются дешевые,простые и быстрые по исполнению тест системы,основанные на микрореакции преципитации.Скринингу на сифилис подвергаются:
- Беременные женщины
- Доноры
крови и органов для трансплантации - Некоторые профессиональные контингенты (работники питания,образования,здравоохранения)
- Военнослужащие
- Лица,отбывающие наказание в местах лишения свободы
- Больные,готовящиеся к оперативному хирургическому вмешательству
- Лица,поступившие на стационарное лечение (обязательная вассерманизация — в России,странах СНГ и некоторых других странах)
Диагностика сифилисаДля диагностики сифилиса применяются
комбинация количественной модификации микрореакции преципитации и трепонемных тестов на сифилис.Серологическое обследование на сифилис назначается в следущих случаях:
- Лицам,имеющих клинические признаки сифилиса
- Лицам с любыми генитальными язвами
- Лицам — половым партнерам больных сифилисом,а также в случае близкого бытового контакта с больным вторичным сифилисом
- Детям,родившимся от больных сифилисом матерей
- Лицам с подтвержденным диагнозом других половых инфекций
- Для подтверждения результатов скрининга (отборочных реакций)
Контроль за лечением сифилисаТак как к моменту снятия с учета леченного больного сифилисом микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном обычно негативируется, а позитивные специфические реакции (РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.) могут наблюдаться долго после окончания лечения (поэтому эти тесты не могут служить критерием излеченности) микрореакция преципитации является
основным тестом для установления критерия излеченности сифилиса.
 |
Снижение титров нетрепонемных тестов в 4 и более раза в течении года после лечения подверждает эффективность проведенной терапии сифилиса и является критерием его излеченности( Приказ Минздрава РФ № 87 от 26.03.01 г,МЗ РФ Приказ от 25 июля 2003 г. N 327,Рекомендации CDC (USA) 2006) |
Применяется количественная модификация микрореакции преципитации.Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения — на эффективность терапии. Стабильность титров должна настораживать в отношении эффективности терапии, увеличение их требует пересмотра лечения.
Как проводится микрореакция преципитации
Материал для исследования: кровь из пальца,венозная кровь,спинномозговая жидкость.Взятие крови желательно производить натощак.
- Схема микрореакции преципитации
- Результаты микрореакции на сифилис
- При низких титрах антител — сомнительная реакция
Для проведения реакции используется классический VDRL-антиген (кардиолипин+лецитин+холестерин)
с добавлением частиц угля для визуальной оценки результатов.теста.Исследуемая сыворотка крови перемешивается на стекле с антигеном.Если в сыворотке содержатся реагиновые антитела то образуются чёрные хлопья (флоккулянты), являющиеся признаком положительной реакции. При отсутствии реагиновых антител в сыворотке образования хлопьев (флоккуляции) не происходит.При обнаружении антилипидных антител — положительная реакция (при проведении
количественной модификации титры от 1: 2 до 1: 320 и вышеПри отсутствии антилипидных антител — отрицательная реакция
Как оценивается микрореакция преципитации
Микрореакция становиться положительной в среднем через 4-5 недель после инфицирования.По
мере развития сифилитической инфекции титры ее нарастают,при скрытом и позднем сифилисе количество антител уменьшается и микрореакция может быть оценена как слабоположительная или сомнительня,а иногда при третичном сифилисе и отрицательная.
| Положительная реакция | |
| Отрицательная реакция |
|
Наиболее часто в мировой венерологии,а последнее время и в России результаты микрореакции оценивает совместно с трепонемными тестами РИФ и РПГА
| RPR,VDRL | РИФ (FTA) | РПГА (TPHA) | Интерпретация |
| — | — | — | нет сифилиса или инкубационный период или очень ранняя стадия |
| + | + | + | нелеченный или недавно леченный сифилис |
| + | + | — | первичный сифилис или ложноположительные РПР и РИФ |
| + | — | + | ложноположительные РП и РПГА или ложноотрицательная РИФ |
| — | + | + | леченный сифилис или нелеченный поздний сифилис |
| + | — | — | биологическая ложноположительная реакция |
| — | + | — | ранний первичный сифилис или недавно леченный сифилис или ложноположительная РИФ |
| — | — | + | пролеченный сифилис или ложноположительная РПГА |
Какие ошибки могут быть при постановке микрореакции
Микрореакция преципитации не применяется для подтверждающей диагностики сифилиса,так как кроме антител к липидным антигенам бледной трепонемы, в этих реакциях определяются антитела к липидам и липопротеинам, образовавшимся в результате повреждения клеток организма.
Поэтому положительные
результаты нетрепонемных серологических реакций в ряде случаев могут быть не связаны с сифилисом,а быть результатом неспецифических повреждений тканей.
Кроме того как к ложноположительным, так и ложноотрицательным результатам могут приводить нарушения при проведении теста.
Неправильная техника проведения исследования
- неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);
- исключение из постановки реакции контрольных
сывороток крови, в частности, слабоположительных; - неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;
- бактериальное загрязнение эмульсии;
- нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;
- замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;
- использование при постановке реакций загрязненных
пробирок, пипеток, пластинок, растворов.
Причины ложноположительные результатов микрореакции на сифилис
- Антифосфолипидный синдром
- Невенерические трепонематозы
- Беременность
- Сахарный диабет
- Туберкулез
- Онкологические заболевания
- Аутоиммунные (системные) заболевания (системная красная волчанка,дерматомиозит и.т.д.)
- Подагра
- Хронический алкоголизме и наркомании;
- Инфекционный мононуклеоз
(инфекция Эпштейн-Барра) - Вирусные гепатитаы
- Пневмонии
Причины ложноотрицательных результатов микрореакции на сифилис
Встречаются редко и связаны с так называемым эффектом «прозоны» при очень высоком содержании антител в крови.
Ложноотрицательные результаты надо отличать от отрицательных результатов микрореакции при первичном периоде сифилиса,когда при наличии сифилитической инфекции организм еще не успел выработать антитела и при позднем
третичном сифилисе,когда уровень антилипидных антител существенно снижен.
|
При положительных результатах микрореакции преципитации) МР) ,если она не проводилась с целью контроля за излеченностью сифилиса,в обязательном порядке необходим осмотр дерматовенеролога и исследование крови с помощью трепонемных тестов |
Где можно получить еще информацию
посещений 181007 обновлено 11.06.10
Реакция преципитации и ее варианты
Реакция преципитации и ее варианты
Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.
Появление преципитата при реакции антиген – антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.
Рис. 73
. Схема определения токсигенности Corynebacterium diphtheriae
Объяснение см. в разделе «Микробиология дифтерии»
Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела – испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген – экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электролитов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция кольцепреципитации) и преципитация в геле.
Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.
Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации.
Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор антигена.
В случае гомологичности антител и антигена на границе между этими растворами быстро, через 3 – 10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.
Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж.
Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой – антиген – наслаивается на первый в виде раствора.
Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё.
Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций (рис. 73).
Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1 %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5 – 6 мм – одна в центре чашки, 4 – 5 – по окружности на расстоянии 1 – 2 см от центральной.
В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические – раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре.
Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости.
Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).
Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля.
Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов.
Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.
Реакция преципитации [1969 Германов Н.И. — Микробиология]
НОВОСТИ БИБЛИОТЕКА КАРТА САЙТА ССЫЛКИ О САЙТЕ
В отличие от реакции агглютинации антиген должен быть в растворенном состоянии, для этого готовят экстракт из микробных тел и других антигенных веществ.
Антигены переносят нагревание до 100 и более градусов, не теряя антигенных свойств.
При добавлении прозрачного жидкого антигена (который хотят определить) к иммунной преципитирующей сыворотке в положительном случае выпадает тонкий осадок. Если же антиген не соответствует антителу, то осадка не будет.
Механизм этой реакции состоит в том, что антитела уменьшают степень дисперсности коллоидов антигена, и это приводит к их выпадению.
Преципитированные белки антигена обладают меньшей токсичностью и легче разрушаются ферментами организма.
Реакция преципитации — одна из самых чувствительных и специфических реакций, поэтому она применяется в очень многих областях медицины, биологии, ветеринарии, химии, промышленности. Ее ставят с диагностической целью, когда антигеном служат не бактерийные клетки, а продукты их распада, например материал из загнивших трупов.
Реакции преципитации применяют в судебной медицине для распознавания видовой принадлежности крови, определения фальсификации мясных и других продуктов. В биологии определяют филогенетическое родство различных видов животных.
Так, реакция преципитации показала, что кровь сибирского мамонта, жившего тысячи лет назад, очень близка к крови современных слонов.
В химии обнаруживают минимальные количества белков, так, биуретовая реакция отмечает наличие белка в концентрации 1:100, а реакция преципитации — в миллионных концентрациях.
Каждая из реакций иммунитета протекает в двух фазах. Первая фаза — специфическое соединение антигена с антителом — невидима для нашего глаза. Антитело в этой фазе делает антиген более податливым, сенсибилизированным (чувствительным) к действию того или иного защитного фактора организма.
Вторая фаза — видимая, доступная для наблюдения, проявляется по-разному в зависимости от условий среды, в которой происходит реакция, а также от исходного физико-химического состояния антигена. Так, в реакциях агглютинации и преципитации наблюдается легкая осаждаемость измененного антигена в присутствии электролита (NaCl).
В реакции лизиса сенсибилизированный антителом антиген адсорбирует комплемент, и если антиген является клеткой, то комплемент вызывает ее растворение. При встрече с фагоцитарной клеткой микроб более легко подвергается фагоцитозу. Все это указывает на то, что в организме имеется одно антитело, специфическое к данному антигену.
Антиген под воздействием этого антитела приобретает новые физико-химические свойства, которые в разных условиях среды проявляются по-разному.
61 — микробиология экзамен
61.
Реакции
преципитации. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция
иммунодиффузии. Иммуноэлектрофорез. Иммунная электронная микроскопия.
Реакция
преципитации — РП (от
лат. praeci- pito — осаждать,) — это
формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с
антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется
при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного
из них снижает уровень образования иммунного комплекса. В отличие от реакции
агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения,
величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть
белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты,
различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела,
участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся
мелкодисперсный комплекс антиген — антитело выявляется при определенных методах
постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при
диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную
преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В
качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи,
шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и
используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца —
преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации,
позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей.
Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар).
Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу
соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных
антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и
образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному
комплексу антиген — антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной
температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при
исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в
луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку.
Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего
различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического
тока в зависимости от их электрофоретической подвижности.
После окончания
электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую
иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса
антиген — антитело появляются линии преципитации.
Реакции
преципитации ставят в пробирках (реакция
кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности
реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная
иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез
и др
Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную
сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После
застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных
разведениях.
Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольце- зые
зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации
пропорционален концентрации антигена.
Реакцию используют лля определения содержания
в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и
др.
Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и
иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле
с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят
иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируя в гель, образуют в месте —
встречи» с антигеном линии преципитации.
Иммунная
электронная микроскопия — электронная
микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами.
Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты
(микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител,
контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими
электронно-оптически плотными препаратами.
Выполнила: Казбекова А.М. 205-стоматология Проверила: Объедкова Э.В. Государственный Медицинский Университет г.Семей Кафедра: Кафедра молекулярной биологии. — презентация
1 Выполнила: Казбекова А.М. 205-стоматология Проверила: Объедкова Э.В. Государственный Медицинский Университет г.Семей Кафедра: Кафедра молекулярной биологии и микробиологии Зав.кафедры: Мынжанов Масыгут Рахимович Дисциплина: Микробиология ИММУНОДИАГНОСТИКА
2 I. ВВЕДЕНИЕ. II. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ: 2.1. Виды преципитации; 2.2. Применение реакций преципитаций в практической медицине; III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. IV. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
3 Реакции преципитации (РП) [от лат.
praecipito, осаждать] предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с AT.
Реакция преципитации сходна по механизму с реакцией агглютинации. Они различаются тем, что в реакции агглютинации участвует цельный антиген, а в реакции преципитации – антиген в растворенном состоянии.
4 Виды реакции преципитации: В зависимости от задач и условий известно несколько методов постановки реакции преципитации: Кольцепреципитация (по Асколи) Микропреципитация Флоккуляция Преципитация в геле (агаре) Иммунодиффузии Иммуноэлектрофорез
5 (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен). Реакцией кольцепреципитации также выявляют AT к бруцеллам в молоке (кольцевая проба Банга). кольцо преципитата. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген.
При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией- термопреципитации
6 Для постановки реакции необходимы * Исследуемый антиген (фильтрат бульонной культуры, экстракт микробных тел, экстракты пораженных органов, СМЖ, гной, мокрота, моча и др.
) * Преципитирующая сыворотка, полученная от животных, иммунизированных специальным преципитиногеном * Физиологический раствор (Участвующие в реакции ингредиенты должны быть совершенно прозрачны.
Для этого их центрифугируют или фильтруют) * Преципитационные пробирки высотой 4-6 см и диаметром 0,4-0,5 см – реакция в них наступает значительно быстрее и проявляется более четко * Микропипетки или пастеровские пипетки (для каждого ингредиента отдельная) * Штативы, резиновые груши, химические пробирки * Термостат, центрифуга
7 ++- —
8 Для выявления низких титров AT (например, при сенсибилизации к ЛС) применяют нефелометрическую реакцию микропреципитации (или реакция помутнения), предложенная Уанье (1955).
При её постановке в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрации; при отсутствии AT разведение сыворотки крови Аг уменьшает её оптическую плотность.
Однако в присутствии минимальных количеств AT образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды.
9
10 [от лат. floccus, хлопья шерсти] РП в системах токсин-антитоксин и анатоксин-антитоксин, проявляющиеся появлением хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке Аг.
Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм реакции флоккуляции обусловлен растворимостью и авидностью AT.
Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксинов.
11
12 Широкое распространение получили модификация реакции преципитации ( РП ) в геле; методически они отличаются от РП тем, что преципитирующая сыворотка уплотняется добавлением геля (агар, агароза, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Существует несколько видов: простая одномерная иммунодиффузия (по Удену) двойная (встречная) одномерная иммунодиффузия радиальная иммунодиффузия (по Манчини) двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони)
13 Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесённого в лунки, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной диффузии AT и Аг вносят в отдельные лунки.
Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах.
Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии.
- 14
- 15 * Исследуемый антиген * Музейная культура токсигенных дифтерийных бактерий * Фильтровальная бумага, пропитанная специфической антитоксической противодифтерийной сывороткой * Стерильные чашки Петри с агаром ОТДМ (определение токсигенности дифтерийных микроорганизмов) * Бактериологические петли, спиртовка * Термостат
- 16 * На застывшую среду кладут стерильную полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором антитоксической сыворотки (1,5 х 6 см) * На расстоянии 0,8 см от края фильтровальной бумаги и друг от друга, наносят бляшки культуры музейного и исследуемого штамма диаметром 0,5 см * Помещают чашку с посевом в термостат на 24 часа
17 * Учет результатов При положительном результате у токсигенных культур между бляшками посевов и фильтровальной бумагой появляются тонкие штрихи образовавшегося преципитата. Стрелки преципитата двух рядом расположенных токсигенных штаммов сходятся между собой. Стрелки нетоксигенных штаммов не сходятся, а перекрещиваются.
18 Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях.
Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.
Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
19 * В этом варианте реакции раствор, содержащий антитела, смешивается с гелем до его застывания и помещения на стекло. Антиген помещается в лунку и при его диффузии в гель, содержащий антитела, образуется зона помутнения, диаметр которой пропорционален количеству антигена. Эта модификация метода позволяет количественно определять антигены.
20 Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу.
В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.
У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ — пересекаются.
21 Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку.
В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации.
Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амида черным).
- 22
- 23
- 24
25 Применение реакции преципитации в практической медицине Реакцию преципитации используют в диагностике : * Сибирской язвы, туляремии, оспы и т.д. * При типизации и изучении антигенной структуры некоторых микроорганизмов * В судебной медицине для определения принадлежности крови, спермы * В санитарной экспертизе продуктов
26 Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных антисывороток.
27 * 1. О.К. Поздеев, учебное пособие под редакцией акад. РАМН В.И. Покровского «Медицинская микробиология», Москва, Изд.группа «ГЭОТАР-Медиа», 2010 г., стр * 2. Л.Б.Борисов, издание 4-е, дополненное и переработанное, «Медицинская микробиология, вирусология, иммунология», Медицинское информационное агентство, Москва, 2005 г., стр
28 1. Назовите метод преципитации, при котором в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрации? 2. Кем была открыта реакция преципитации? 3. В каком из методов преципитации различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом? 4. В реакции преципитации антиген участвует в растворенном состоянии, а в реакции агглютинации? 5.
В каком микробиологическом лабораторном оборудовании проводят реакцию преципитации? 6. В реакции преципитации происходит выпадение видимого высадка, как он называется? 7. В каком из методов преципитации происходит появление хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке антигена? 8. Один из основных компонентов реакции преципитации? 9.
При добавлении какого компонента преципитирующая сыворотка уплотняется? 10. В каком методе преципитации между двумя средами образуется непрозрачное кольцо преципитата? 11. Один из основных компонентов реакции преципитации? 12.
Этот вид реакции отличается от реакции преципитации тем, что в нем участвует цельный ген, а в реакции преципитации – антиген в растворенном состоянии. Какой это вид реакции?
29 ПРЕЦИПИТАЦИЯ 12
30 А 7Г 3ФГ ИЛЛ МОЮ 1МКТ МУ5К10И ИНПУК11Н КОРЛ8ОАА Р2ЭОЯАЛНЦ ОКЛ4Б6ЦН9ЬТИ ПРЕЦИПИТАЦИЯ РАКЕРРЯИГЕТ12 ЕУРЛКЕГАПЕ ЦСОЬАЦЕРРЛ ИФНИНЕО ПОЫПЦ ИРЙИИ ТЕТП АЗАИ ЦТТ ИА ЯЦ И Я
Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном
Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном на сифилис в норме отрицательная.
Микрореакция преципитации позволяет выявить антитела к кардиолипиновому антигену бледной спирохеты.
Микрореакция преципитации при изолированном применении служит не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании её позитивности диагноз сифилиса не устанавливают, а пациенту проводят диагностические тесты (РСК, ИФА).
С помощью микрореакции преципитации обследуют лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на венерические заболевания, больных соматическими заболеваниями и др.
Существует несколько вариантов микрореакций — VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test), RST (Reagin Screen Test), RPR (repid plasma reagin) и др.
RPR-тест (МР плазмы с кардиолипиновым антигеном) бывает положительной в 78% случаев при первичном, в 97% — при вторичном сифилисе.
VDRL-тест (МР инактивированной сыворотки с кардиолипиновым антигеном) положителен при первичном сифилисе в 59-87% случаев, при вторичном — в 100%, при позднем латентном — в 79-91%, при третичном — в 37-94%. Микрореакция преципитации обычно отрицательны в первые 7-10 дней после появления твёрдого шанкра.
В случае положительных результатов VDRL, RPR-тестов можно определить титр реагиновых антител. Высокий титр (более 1:16) обычно указывает на активный процесс, низкий титр (менее 1:8) — на ложноположительный результат исследования (в 90% случаев), а также возможен при позднем или позднем латентном сифилисе.
Исследование титра антител в динамике используют для оценки эффективности лечения. Снижение титра указывает на положительный ответ на проводимое лечение. Адекватное лечение первичного или вторичного сифилиса должно сопровождаться 4-кратным снижением титра антител к 4-му месяцу и 8-кратным — к 8-му месяцу.
Лечение раннего латентного сифилиса обычно приводит к концу года к отрицательной или слабоположительной реакции. Подъём титра в 4 раза указывает на рецидив, реинфекцию или неэффективность терапии и приводит к необходимости повторного курса лечения.
При вторичном, позднем или латентном сифилисе низкие титры могут сохраняться у 50% пациентов дольше 2 лет, несмотря на снижение титра. Это не указывает на неэффективное лечение или реинфицирование, так как эти пациенты остаются серологически положительными, даже если повторить курс лечения.
Следует учитывать, что изменения титров при позднем или латентном сифилисе часто непредсказуемы, оценка эффективности лечения по ним затруднительна.
Чтобы отдифференцировать врождённый сифилис от пассивного носительства материнской инфекции, новорождённым необходимо провести серию исследований с определением титра антител: подъём титра в течение 6 мес после рождения свидетельствует о врождённом сифилисе, в то время как при пассивном носительстве антитела исчезают к 3-му месяцу.
При оценке результатов VDRL и RPR-тестов у детей грудного возраста с врождённым сифилисом необходимо помнить о феномене прозоны.
Сущность этого феномена состоит в том, что для агглютинации антигены и антитела в этих реакциях необходимо, чтобы антигены и антитела находились в крови в соответствующем количестве. Когда количество антител значительно превышает количество антигенов, агглютинации не происходит.
У некоторых детей грудного возраста с врождённым сифилисом содержание антител в сыворотке настолько велико, что в неразбавленной сыворотке не происходит агглютинации антител и нетрепонемных антигенов, используемых для диагностики сифилиса (тесты VDRL и RPR нереактивны).
Поэтому у детей, обследуемых с целью диагностики врождённого сифилиса, возможен феномен прозоны. Во избежание ложноотрицательных результатов в таких случаях необходимо проводить исследования с разведением сыворотки и без него.
Микрореакция VDRL может быть негативной при раннем, позднем латентном и позднем сифилисе приблизительно в 25% случаев, а также у 1% больных вторичным сифилисом. В таких случаях необходимо использовать метод ИФА.
Ложноположительная реакция микропреципитации возможна при ревматических заболеваниях (например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, склеродермия), инфекциях (мононуклеоз, малярия, микоплазменная пневмония, активный туберкулёз, скарлатина, бруцеллёз, лептоспироз, корь, эпидемический паротит, венерическая лимфогранулёма, ветряная оспа, трипаносомоз, проказа, хламидиоз), беременности (редко), в старческом возрасте (около 10% людей в возрасте старше 70 лет могут иметь ложноположительную микрореакцию преципитации), при хроническом лимфоцитарном тиреоидите, гемобластозах, приёме некоторых гипотензивных средств, наследственной или индивидуальной особенности.
[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]
Загрузка...
