Различные методы молекулярно-генетической диагностики в онкологии предоставляют врачу (химиотерапевту, клиническому онкологу) сведения о наличии, расположении и типе мутаций в генах конкретного пациента.
Информация о мутациях (и их сочетаниях) помогает выбрать наиболее эффективный вариант лечения уже диагностированного онкозаболевания, либо указать на чрезвычайно высокую вероятность рака, передающегося по наследству (так называемые наследственные или семейные раки).
Секвенатор Illuminaдля выполнения секвенирования генома нового поколения (NGS), установленный в молекулярно-генетической лаборатории МИБС
Основные практические задачи, которые решает молекулярно-генетическое тестирование в онкологии
- поиск “поломок” в генах клеток опухоли с целью выявления наиболее эффективной тактики лечения — например, для определения мутаций, при которых эффективной будет иммунотерапия или таргетная терапия;
- раннее профилактическое выявление генных мутаций, ответственных за развитие наследственных раков у здоровых пациентов, в чьей семейной истории есть случаи онкологических заболеваний из списка наиболее часто передающихся по наследству — наследственный ДНК-онкотест (на базе NGS).
Список генов, подлежащих рассмотрению, задается задачами исследования. Это позволяет оптимизировать стоимость и срок выполнения молекулярно-генетической диагностики, выбрав оптимальный метод либо комбинацию методов исследования генов ДНК конкретного человека. В онкологии изучению подлежат гены, мутации в которых участвуют в развитии рака.
Наиболее часто с развитием опухолей связаны мутации в таких генах как: BRAF, BRCA, EGFR, HRAS, KRAS, MET и др.
Научно доказано, что клиническую важность имеют не только мутации в отдельных генах, но и сочетание различных мутаций в разных участках генов. По этой причине наиболее эффективно применение методов, которые позволяют выявить мутации в любом из генов, ассоциированных с развитием онкологического заболевания, без предварительного указания зоны поиска (изучается так называемая “панель генов”).
Преимущество в точности интерпретаций получают лаборатории, проводящие поиск сочетаний выявленных мутаций в специализированных постоянно пополняемых базах данных международного уровня.
Секвенирование нового поколения (NGS)
Наиболее информативным методом молекулярно-генетической диагностики в клинической онкологии является секвенирование нового поколения (NGS). Эта методика предусматривает секвенирование (разделение) молекулы ДНК конкретного человека на отдельные гены с последующим рассмотрением и фиксацией найденных отклонений от нормального строения каждого гена из интересующего списка (панели генов).
Панель генов, поиск мутаций в которых методом NGS можно заказать в молекулярно-генетической лаборатории МИБС: ATM, ATR, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CDK12, CHEK1, CHEK2, EPCAM, FANCL, MLH1, MSH2, NBN, NF1, PALB2, PMS2, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, STK11, TP53, POLE
Основным отличием секвенирования нового поколения, основанного на применении высокотехнологичного оборудования (секвенаторов) и мощных вычислительных систем (биоинформатика), является широкий спектр одномоментно изучаемых генов и высокая точность в сочетании с умеренной стоимостью.
Какой лучше: достоинства и недостатки разных методов молекулярной диагностики
Среди современных видов молекулярной генетической диагностики в онкологии наибольшее применение имеют ПЦР (полимеразно-цепная реакция) и секвенирование нового поколения (NGS, next generation sequencing), которые практически вытеснили из клинической практики ранее имевшее широкое применение секвенирование по Сэнгеру.
Остальные методы либо уступают по информативности и точности получаемых данных, либо используются исключительно в научной деятельности из-за высокой стоимости тестирования.
Отдельно следует упомянуть цитогенетический метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ).
Так называемый FISH-тест выполняется для подтверждения предположений клинического онколога о наличии специфических мутаций в определенных генах и служит для избрания оптимальной тактики лечения.
Однако более корректно отнести FISH к разделу морфологических исследований, так как основой метода является микроскопическая визуализация процесса взаимодействия компонентов во время исследования.
В таком случае любые заключения являются субъективными и зависят от квалификации специалистов, выполняющих диагностику. Кроме того, некорректно сравнивать FISH-тест с другими видами генетической диагностики — часто FISH имеет специфическое применение в качестве единственного возможного метода диагностики, например, при таких заболеваниях, как миелолейкоз, лейкоз, хронический лимфолейкоз и др.
NGS (секвенирование нового поколения)
Позволяет рассмотреть все мутации в заданном списке генов в рамках одного исследования (исследование панели генов), давая полную картину имеющихся мутаций, что позволяет избежать дополнительного тестирования. Важное значение данного метода генетической диагностики для медицины нашло отражение в самом его названии — “новое поколение” характеризует превосходство в объеме и точности предоставляемой информации.
Обработка огромного количества информации о ДНК конкретного человека, получаемого при NGS, позволяет:
- определить и описать (указать расположения в конкретном гене) отклонения от нормального для популяции строения ДНК;
- сравнить имеющиеся сочетания различных мутаций с базами данных для определения фактора онкогенности (способности вызывать онкологическое заболевание) выявленных “наборов” мутаций;
- если выполняется наследственный ДНК-онкотест на базе NGS — не только выявить мутации, ассоциированные с наследственными (семейными) раками, но и указать в заключении на необходимость дополнительной консультации с онкологом для принятия мер по предупреждению и раннему выявления начала заболевания.
Значительный объем данных, получаемых при выполнении секвенирования генома, обуславливает продолжительность выполнения NGS-секвенирования генома. Например, изучение панели наиболее распространенных генов, мутации в которых имеют клиническую значимость в онкологии (примерно 30 генов), методом NGS выполняется в срок 20-30 рабочих дней.
Технологические возможности секвенаторов, работающих в лаборатории МИБС, позволяют говорить о резерве снижения срока выполнения тестирования по мере роста спроса на профессиональную генетическую диагностику со стороны российских онкологов из других регионов.
С конца 2021 года МИБС предлагает удобную схему логистики образцов тканей опухолей и образцов крови для выполнения NGS-исследований, что открывает доступ к высокотехнологичной диагностике онкологу из любого региона, тем самым повышая качество лечения онкологических заболеваний на уровне государства.
Для выбора наиболее оптимальной схемы лечения с включением в ее состав иммунотерапии либо таргетной терапии, клинические онкологи лечебных центров, входящих в структуру МИБС (Онкологическая клиника МИБС, Центр протонной терапии МИБС) используют данные NGS, полученные в собственной молекулярно-генетической лаборатории
ПЦР (полимеразная цепная реакция)
Полимеразная цепная реакция — это хорошо знакомый, точный и востребованный метод определения мутаций в указанных генах. Именно ПЦР, точнее, информация о мутациях в наиболее распространенных генах (чаще всего BRAF-мутации, а также BRCA1/BRCA2, EGFR, HRAS, KRAS, MET) стал основой развития технологий таргетной терапии и иммунотерапии.
С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов.
В таком случае невысокая стоимость и небольшой срок выполнения исследования, являющиеся преимуществом ПЦР при решении точечных диагностических задач при необходимости всестороннего изучения генов у онкологических пациентов не перекрывают определенных ограничений, которые присущи ПЦР.
В первую очередь, это недостаточная информативность — один ПЦР-анализ позволяет проверить мутацию в одном конкретном гене, которую может предположить врач-онколог.
В случае подозрения о наличии мутаций в различных генах необходимо многократное повторение ПЦР-тестирования на каждом из интересующих участков ДНК.
Это резко повышает общую стоимость исследования и длительность самого процесса диагностики, требует проведения дополнительной биопсии для получения дополнительного объема опухолевых тканей, что также увеличивает общий срок и стоимость исследований.
Сравнение полноты исследования генетических мутаций между ПЦР и секвенированием нового поколения (NGS)
Рассмотрим «разрешающую способность» этих двух методов на примере тестирования образца опухоли у пациентки с необходимостью выявления возможных мутаций BRCA1/BRCA2. На двух иллюстрациях ниже розовым отмечены зоны генов, которые возможно исследовать этими двумя методами:
ПЦР исследование — позволяет диагностировать только 4-10 частых мутаций из более чем 3000 описанных патогенных в базах данных, рассматривается только 2 гена из более чем 100 генов (к.м.н. Гордиев М.Г., из личного архива)
Cеквенирование нового поколения (NGS) — диагностируются все мутации в генах BRCA1/BRCA2, а также все мутации в других генах (к.м.н. Гордиев М.Г., из личного архива)
При этом даже многократное ПЦР-тестирование опухоли, в отличие от метода секвенирования нового поколения (NGS), не дает исчерпывающей информации о мутациях в генах, не вошедших в список для изучения.
Это может приводить к ложно-отрицательным результатам в случае редких генетических мутаций, либо при недостаточно полной формулировке диагностической задачи со стороны направляющего врача-онколога.
Секвенирование по Сэнгеру
С развитием других методов генетической диагностики данный метод постепенно выходит из клинической практики. Основной недостаток метода Сэнгера — низкая чувствительность.
Это означает, что для выявления генной мутации обязательным условием является наличие в предоставленных образцах опухолевых тканей не менее 15-20% клеток с мутациями.
Из-за неравномерности распределения клеток в объеме солидных опухолей применение секвенирования по Сэнгеру приводит к значительному количеству ложно-отрицательных результатов (как следствие — пациенту проводится лечение, которое не будет эффективным).
Учитывая развитие и доступность в России (в том числе по ОМС в МИБС) более современных методов генетической диагностики можно сказать, что на начало 2022 года применение секвенирования по Сэнгеру обусловлено реактивностью мышления и недостаточной информированностью некоторых врачей, которые игнорируют более современные технологии.
При каких видах рака нужна молекулярно-генетическая диагностика?
Список основных видов рака, при лечении которых информация о генных мутациях имеет практическую клиническую ценность:
- немелкоклеточный рак легкого — гены EGFR, BRAF, KRAS, MET, NRAS, ERBB2, JAK2, JAK3
- рак толстой кишки (колорректальный рак) — гены KRAS, NRAS, BRAF
- меланома — гены BRAF, NRAS, KIT
- гастроинтестинальная стромальная опухоль — гены PDGFRA, KIT
- глиальные опухоли, острый миелоидный лейкоз — гены IDH1, IDH2
- рак молочной железы — гены PIK3CA, BRCA1, BRCA2
- рак яичников — гены BRCA1, BRCA2, TP53
Секвенирование нового поколения в МИБС: в чем преимущество?
Наша лаборатория использует NGS-секвенирование на оборудовании Illumina, являющееся на начало 2022 года “золотым стандартом” в отрасли секвенирования генома.
Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки (секвенирования) ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций.
В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома.
Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли.
Именно поэтому услуги молекулярно-генетической лаборатории МИБС востребованы онкологами по всей РФ — с конца 2021 года образцы для выполнения исследования можно передать в любом из региональных центров МИБС либо отправить курьерской службой (для получения подробной информации о логистике образцов, обратитесь любым из доступных на сайте способов).
К тому же большинство исследований, связанных с определением эффективности лечения, могут быть выполнены в нашей лаборатории за счет ОМС, независимо от региона проживания гражданина РФ.
Чтобы заказать генетический анализ опухоли методом NGS в МИБС по ОМС, звоните +7 (812) 244-06-31, пишите ngs@ldc.ru или заполните форму обратной связи и наши специалисты свяжутся с Вами в кратчайший срок для уточнения информации
ДНК-тест рисков наследственного рака (на основе NGS)
С появлением метода секвенирования генома нового поколения, позволяющего одномоментно проанализировать широкую панель генов и сравнить с имеющейся всемирной базой выявленные мутации, на новый виток развития выходят программы предупреждения и ранней диагностики широкого ряда онкологических заболеваний — программы скрининга, которые включают исследование наследственных рисков развития онкозаболеваний.
На сегодня научно доказано, что на долю наследственного фактора приходится до 20% всех случаев некоторых видов онкологических заболеваний (например, наследственный рак молочной железы или рак яичников).
У пациентов, несущих гены семейных раков, вероятность развития онкологического заболевания составляет до 90% вместо среднего для популяции значения в 10%.
В целом 1,5-2% всех людей в популяции имеют генные мутации, которые говорят о повышенном риске рака.
Наиболее частые наследственные (семейные) раки:
- рак молочной железы (как у женщин, так и у мужчин);
- рак яичников;
- рак предстательной железы;
- колоректальный рак;
- рак поджелудочной железы;
- рак желудка;
- меланома.
Наиболее оптимальным вариантом является ДНК тест наследственного рака у тех, кто входит в группу риска — семейная история одного вида рака в нескольких поколениях, наличие особенностей течения заболевания (например, двусторонний рак молочной железы, рак груди у мужчин, рак яичников или молочной железы в возрасте до 50 лет и др.). В такой группе вероятность развития опухолей значительно выше, чем у просто носителей мутаций.
Чтобы заказать ДНК-тест рисков наследственного рака в МИБС, звоните +7 (812) 244-06-31, пишите ngs@ldc.ru или заполните форму обратной связи и наши специалисты свяжутся с Вами в кратчайший срок для уточнения информации
Фактически, предоставив в лабораторию МИБС образец крови, можно предсказать рак. И, если ДНК-тестирование покажет наличие определенного набора генных мутаций, у пациента в сотрудничестве с врачом-генетиком и врачом-онкологом появляется шанс предпринять необходимые радикальные либо терапевтические действия, чтобы снизить или полностью исключить риск развития данного вида рака.
Самым известным примером такого подхода является актриса Анджелина Джоли, в семейной истории которой было несколько случаев рака молочной железы. Этот фактор в сочетании с выявленными мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 показал максимальную вероятность раннего развития рака. Поэтому актриса выбрала наиболее радикальный путь (двухсторонняя мастэктомия и тотальная овариэктомия).
В других случаях возможны и более мягкие решения в пределах персонализированного скрининга: более пристального наблюдения с более частой диспансеризацией, расширение состава скрининга (например, регулярная дерматоскопия у пациентов с семейной меланомой, МРТ молочных желез для молодых пациенток с семейным раком груди, контроль динамики уровня ПСА у пациентов с наследственным раком простаты).
Генная терапия в лечении заболеваний сетчатки
В последние десятилетия произошел огромный прогресс в лечении заболеваний сетчатки и стекловидного тела.
Так, например, появились новые методы лечения отека в центральной зоне сетчатки при влажной форме возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии и тромбозе вен сетчатки.
По современным стандартам при этих заболеваниях показано введение различных лекарственных препаратов в стекловидное тело (интравитреально).
Были интересные многообещающие исследования по лечению дегенеративных заболеваний сетчатки и наследственных ретинопатий с помощью стволовых клеток. Но, к сожалению, до сих пор не получено значимых клинических результатов.
По мнению Charles C.
Wykoff, доцента кафедры офтальмологии, заместителя директора по клиническим исследованиям медицинского колледжа Weill Cornell, Техас, США, самым перспективным направлением исследований является генная терапия, с помощью которой можно управлять наследственными заболеваниями.
Скоро будет возможно остановить прогрессирование таких тяжелых заболеваний, как пигментный ретинит, пигментная абиотрофия, болезнь Штаргагта, амавроз Лебера. Эти заболевания либо приводят к существенному сужению поля зрения, либо к выпадению центрального зрения, либо к слепоте.
Под термином «генная терапия» подразумевают внедрение в пораженную клетку новой ДНК, или включение в работу собственных генов, которые до этого не функционировали, или установку новых, так называемых, терапевтических генов. По мнению исследователей, сетчатка является идеальной мишенью для такой терапии.
- Во-первых, доступ к стекловидному телу и сетчатке легко осуществить через плоскую часть цилиарного тела.
- Во-вторых, между кровью и глазом существует гемато-офтальмический барьер, благодаря которому внутриглазная среда изолирована от агентов иммунной системы. Таким образом, введение чужеродных веществ внутрь глаза не приводит к развитию системных реакций.
- В-третьих, результаты генной терапии можно легко контролировать, основываясь на объективных клинических данных.
При генной терапии используют специальные векторы – системы для доставки генов. В настоящее время существуют 3 векторные системы — это аденовирусные векторы, лентивирусные векторы и рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор (РААВ).
Для генной терапии глазных заболеваний наиболее часто применяют РААВ векторы. Они содержат только специальные терапевтические последовательности ДНК и не содержат вирусных генов.
Также РААВ может избирательно воздействовать на определенные клетки или слои сетчатки, что делает терапию высокоспецифичной.
Доктор Левкина Оксана, врач-офтальмолог Офтальмологической клиники ЕМС, кандидат медицинских наук, рассказала об уже применяемых методиках генной терапии:
«В настоящее время мы применяем хирургические инъекционные методы лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации, которые заключаются во введении лекарственного вещества внутрь глаза, в стекловидное тело. Это так называемая анти-VEGF-терапия, которая также относится к векторной терапии.
Специальные фармакологические препараты блокируют фактор роста эндотелия сосудов, и новообразованные сосуды запустевают и прекращают функционировать. В настоящее время убедительно продемонстрирована эффективность препарата Люцентис (Novartis Farma AG).
Инъекция препарата осуществляется в условиях операционной под местной капельной анестезией и занимает несколько минут».
Генетические причины бесплодия — генные мутации, полиморфизм генов. Часть 3 | Университетская клиника
Несколько сотен генов влияют на нормальное половое развитие человека, но лишь некоторые из них имеют рутинное клиническое значение. В эту группу входят, среди прочего, ген CFTR и INSL3-LGR8.
Генные мутации при бесплодии
В литературе описано более тысячи мутаций и полиморфизмов в гене CFTR. Возникающие мутации делятся на пять классов в зависимости от степени и типа изменений, вызванных синтезируемым транспортным белком. Таким образом, мутация гена CFTR является одной из основных причин генетических заболеваний. В их числе:
- врожденное отсутствие семявыносящих протоков (CAVD);
- двусторонняя врожденная аплазия сосудов (CBAVD);
- азооспермия, которая может быть вызвана отсутствием семявыносящего протока;
- криптозооспермия;
- задержка созревания сперматозоидов;
- патология придатка яичка и семенных пузырьков из-за аномального развития протока Вольфа.
Эти отклонения могут указывать на кистозный фиброз или проявляться независимо.
У женщин вторичная аменорея может возникать как симптом мутации CFTR, но такое бесплодие встречается редко, а беременность обычно хорошо переносится. Наиболее распространенной мутацией в гене CFTR является делеция трех нуклеотидов в экзоне 10, что приводит к недостатку фенилаланина в положении 508 белковой цепи (ΔF508), что составляет примерно 70% CF (мутация класса II).
CBAVD – самая легкая форма кистозного фиброза, однако в случае симптоматического муковисцидоза причиной бесплодия почти всегда (более 95%) будет CBAVD. В литературе сообщается, что примерно в 60-70% случаев двусторонняя врожденная аплазия сосудов является результатом мутации в гене CFTR, однако при отсутствии других симптомов муковисцидоза.
Поскольку функция ядерных желез не нарушается, хирургический сбор спермы в сочетании с ИКСИ дает хорошие результаты, в то время как оба партнера должны быть генетически протестированы на передачу мутации CFTR их потомству.
Еще одна мутация, вызывающая бесплодие, – это мутации в гене рецептора андрогенов. Ген андрогенного рецептора RA содержит полиморфную область CAG в экзоне 1.
Изменяющееся количество тринуклеотидных повторов CAG коррелирует с активностью рецептора RA, вызывая ее увеличение или нарушение функции, что приводит к заболеванию и патологии.
Подсчитано, что мутации в гене AR могут быть обнаружены у 2-3% мужчин с диагнозом азооспермия или тяжелая форма олигозооспермии.
Аналогичным образом, приводит к бесплодию мутация в гене INSL3-LGR8. Инсулиноподобный фактор типа 3 (INSL3) необходим для опускания яичек, в дополнение к другим факторам, таким как ЛГ, ФСГ и дигидротестостерон (ДГТ). INSL3 влияет на опускание яичек по семенной трубке внутриутробно.
Мутации в гене, кодирующем INSL3 или его рецепторных генах (LGR8 и GREAT), нарушают функцию яичек и вызывают крипторхизм.
Патологию можно лечить ХГЧ – метод эффективен примерно у 20-24% пациентов, из которых примерно у 20% рецидивирующий крипторхизм, или выполнять орхидопексию – эффективность 95%.
Полиморфизм генов при бесплодии
Последняя группа генетических основ бесплодия включает полиморфизм генов. Изменения, известные как полиморфизм, могут привести к проблемам фертильности и репродуктивной функции как у мужчин, так и у женщин.
Например, полиморфизм C677T гена MTHFR проявляется снижением активности метилентетрагидрофолатредуктазы – фермента, важного для метаболизма гомоцистеина и фолиевой кислоты.
Это приводит к повышению уровня гомоцистеина в крови и, как следствие, к осложнениям, сопровождающим беременность (рецидивирующие выкидыши), а также к дефектам нервной трубки.
Точно так же наличие полиморфизма гена DAZL (ген семейства DAZ, обнаруженный на аутосомных хромосомах – ответственный за ранние стадии образования яйцеклеток и сперматозоидов) связан с предрасположенностью к бесплодию. Более того, благодаря исследованиям стволовых клеток, выяснилось, что два гена, тесно связанных с DAZL – DAZ и BOULE – необходимы на более поздних стадиях развития гамет.
Исследования локализации продуктов гена DAZ в зрелых мужских половых железах показывают их присутствие в основном в сперматогониях и сперматоцитах первого порядка.
Однако использование антител против домена белка DAZ2 позволило обеспечить присутствие белков DAZ в сперматидах и зрелых сперматозоидах.
Присутствие белка DAZ в половых клетках и сперматозоидах может указывать на то, что он играет роль в образовании и дифференцировке репродуктивных клеток, а также на их транскрипционно неактивных стадиях.
Другой гомолог гена DAZ, связанный с фертильностью, – аутосомный ген BOULE. Его экспрессия происходит в половых клетках, а мутации, ограничивающие его функции, приводят к угнетению сперматогенеза и, как следствие, к азооспермии.
Азооспермия
Идентификация генов, ответственных за производство спермы, должна в будущем прояснить механизмы, связанные с течением и контролем сперматогенеза, и предоставить данные о причинах бесплодия.
В литературе также описано влияние полиморфизма генов POLG и FSHR – рецептора фолликулостимулирующего гормона.
У женщин он стимулирует созревание фолликулов яичников и секрецию эстрогенов в зернистых клетках фолликулов яичников, а у мужчин вызывает увеличение семенных трубок и стимулирует рецепторы сперматогенеза и эстрогенез.
Например, полиморфизм гена FSHR подтвержден у женщин с синдромом гиперстимуляции яичников, что делает их более чувствительными к действию гонадотропинов. Также было доказано, что аномалии рецепторов ФСГ являются причиной гипогонадизма.
Более того, были идентифицированы отдельные гены, связанные с такими типами бесплодия, как гипогонадотропный гипогонадизм (генетический дефект, который, как считается, связан с дисфункцией гипоталамо-гипофизарной оси) и синдром Каллмана, инактивирующий мутацию гена KAL-1, кодирующий белок с адгезивными свойствами, участвующий в синаптогенезе.
Несмотря на значительный прогресс в понимании роли некоторых генов, участвующих в патогенезе гипогонадотропного гипогонадизма, причина многих его случаев до сих пор неизвестна. Следует подчеркнуть, что наличие определенных форм полиморфизма гена FSHR вызывает различные реакции на гормональную терапию бесплодия у мужчин.
Выводы
В случае бесплодия генетические проблемы являются одной из наиболее важных, менее выявляемых и более трудных для лечения причин.
Точно оценить общую величину воздействия генетики на бесплодие сложно, так как большинство, если не все, факторы могут иметь генетический компонент, например, восприимчивость к инфекции.
Тем не менее значительное количество фенотипов бесплодия связано со специфическими генетическими аномалиями.
Генетические причины бесплодия разнообразны и включают хромосомные аномалии, а также генные мутации и полиморфизм, и затрагивают как женщин, так и мужчин. Некоторые генетические факторы особенно влияют на мужчин, другие влияют как на мужчин, так и на женщин. В статье дается обзор современных генетических исследований бесплодия и их последствий.
Продолжение статьи
28.Генная диагностика и генная терапия. Схема генной коррекции
Принципы
генной терапии: в зависимости от
способа введения экзогенных
ДНК в геном пациента генная
терапия может проводиться либо
в культуре клеток (ex vivo), либо
непосредственно в организме (in
vivo).
Клеточная генная терапия или терапия
ex vivo предполагает выделение и
культивирование специфических типов
клеток пациента, введение в них чужеродных
генов, отбор трансфецированных клеток
и реинфузию их тому же пациенту.
В
настоящее время в большинстве допущенных
к клиническим испытаниям программ
генной терапии используется именно
этот подход.
Генная
терапия in vivo основана на прямом введении
клонированных и определенным
образом упакованных последовательностей
ДНК в специфические ткани
больного.
Особенно перспективным для
лечения генных болезней in vivo
представляется введение генов с помощью
аэрозольных или инъецируемых вакцин.
Аэрозольная генотерапия разрабатывается,
как правило, для лечения пульмонологических
заболеваний (муковисцидоз, рак легких).
Разработке
программы генной терапии предшествуют
тщательный анализ тканеспецифической
экспрессии соответствующего гена,
идентификация первичного биохимического
дефекта, исследование структуры, функции
и внутриклеточного распределения его
белкового продукта, а также биохимический
анализ патологического процесса. Все
эти данные учитываются при составлении
соответствующего медицинского протокола.
Апробацию процедуры генокоррекции
наследственного заболевания проводят
на первичных культурах клеток больного,
в которых в норме функционально активен
данный ген. На этих клеточных моделях
оценивают эффективность выбранной
системы переноса экзогенной ДНК,
определяют экспрессию вводимой
генетической конструкции, анализируют
ее взаимодействие с геномом клетки,
отрабатывают способы коррекции на
биохимическом уровне.
Используя
культуры клеток, можно разработать
систему адресной доставки рекомбинантных
ДНК, однако проверка надежности работы
этой системы может быть осуществлена
только на уровне целого организма.
Поэтому такое внимание в программах
по генной терапии уделяется экспериментам
in vivo на естественных или искусственно
полученных моделях соответствующих
наследственных болезней у животных.
Успешная коррекция генетических дефектов
у таких животных и отсутствие нежелательных
побочных эффектов генной терапии
являются важнейшей предпосылкой для
разрешения клинических испытаний.
Таким
образом, стандартная схема генокоррекции
наследственного дефекта включает
серию последовательных этапов. Она
начинается созданием полноценно
работающей (экспрессирующейся)
генетической конструкции, содержащей
смысловую (кодирующую белок) и регуляторную
части гена.
На следующем этапе решается
проблема вектора, обеспечивающего
эффективную, а по возможности и адресную
доставку гена в клетки-мишени.
Затем
проводится трансфекция (перенос
полученной конструкции) в клетки-мишени,
оценивается эффективность трансфекции,
степень коррегируемости первичного
биохимического дефекта в условиях
клеточных культур (in vitro) и, что особенно
важно, in vivo на животных — биологических
моделях. Только после этого можно
приступать к программе клинических
испытаний.
Медико-этические аспекты генотерапии
Ворфоломеев С., Юпатов В., Ялиева Л., Фахрудинова Э.Р.
Министерство здравоохранения Российской Федерации
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России
Кафедра философии, гуманитарных наук и психологии
Медико-этические аспекты генотерапии
Конец XX — начало XXI века ознаменованы прорывом в исследовании генетического аппарата живых организмов. Генетика стала самостоятельной наукой, в составе которой появляется большое количество разделов и дисциплин. Категориальный аппарат этой науки, ее идеи и методы нашли свое применение во многих сферах человеческой жизни.
Стремительное развитие молекулярной генетики, расшифровка структуры ДНК, появление методов генной инженерии и генной терапии вполне ожидаемо столкнули человечество с рядом морально-этических и этико-правовых вопросов, связанных с прямым вмешательством человека в механизмы существования живых организмов.
Большее количество этих вопросов еще далеко от разрешения. Некоторые из них нашли свои ответы в международных и отечественных этико-правовых документах. Свое мнение относительно этих проблем выразили и представители ряда религиозных конфессий. Многие вопросы являются предметом длительных дискуссий и на сегодняшний день:
Может ли человек стать творцом направленной биоэволюции?
Может ли «цепочка из нескольких нуклеотидов» стать показателем личностных качеств индивидуума?
Применима ли генетическая модификация путем избирательной селекции определенных генов к человеку и человеческому роду в целом? И возможно ли таким образом подготовить основу для создания «сверхчеловека»?
Имеет ли место государственное и общественное регулирование процесса научных исследований?
Также встает вопрос и о доступности методов генной инженерии для отдельных слоев населения.[4]
Генная терапия представляет собой новый метод лечения генетически обусловленных заболеваний, основанный на замене «больного» гена (ответственного за заболевание) геном «здоровым». Целью генной терапии является внесение изменений в генетический аппарат клеток человека в целях лечения конкретных заболеваний.
В частности, открыты новейшие технологии, позволяющие участвовать в направленном мутагенезе, а в 2013 г. разработаны высокоизбирательные методы активирования и ингибирования генов с помощью системы CRISPR/Cas9, которые дают возможность исправлять неправильные последовательности генов и таким образом лечить наследственные заболевания человека.
CRISPR/Cas9 — это уникальная технология изменения геномов, в основе которой лежит собственная иммунная защита бактерий. Эта система основывается на особых участках бактериальной ДНК.
Вирус, проникая в клетку бактерии, тут же обнаруживается с помощью специальных Cas-белков, связанных с CRISPR РНК.
Если фрагмент вируса «записан» в бактериальной CRISPR РНК, Cas-белки разрезают вирусную ДНК и уничтожают ее, защищая клетку от инфекции.[9]
Для исправления «дефектного» гена, необходим очень точный «молекулярный скальпель», который отыщет мутантную последовательность нуклеотидов и вырежет ее из ДНК. Этим «скальпелем» и является Cas9. Используя гид РНК, последовательность нуклеотидов которого комплиментарна искомому месту, производят разрез в нужном месте генома.
Узнавание «мишени» осуществляется на участке ДНК длиной в 20–30 нуклеотидов. Участки ДНК этой длины встречаются в геноме человека не более одного раза, поэтому использование этой технологии позволяет с наибольшей точностью произвести замену дефекта. Клетка не погибнет от внесения разрыва в молекулу ДНК, т.к.
в работу включатся системы репарации, достроив вторую цепь ДНК, на основе первой.
Открытие этого метода дало основание ученым утверждать, что в ближайшем будущем для любого генетика не составит труда вырезать, удалять и встраивать новые гены в матрицу ДНК, исцеляя генетические заболевания, изменяя человеческие качества и их потенции (лидерство, способность к познанию, творческий потенциал и т.д.)
По мнению И.В. Силуяновой, решение проблем, связанных с вмешательством в генетический аппарат живых существ, способствовало формированию внутри биоэтики двух подходов, которые условно можно назвать «либеральным» и «консервативным».[1]
Главным аргументом «либералов» в этой полемике является рассмотрение данного метода как потенциально универсального подхода к лечению широкого спектра заболеваний.
В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию; вирусные (в том числе ВИЧ-инфекции и герпесвирусных инфекций); аллергии и иммунологические заболевания (в том числе аутоиммунные), онкологические, сердечно-сосудистые заболевания и даже ревматизм, а также наследственных расстройств — таких, как синдром Дауна, серповидно-клеточная анемия и β-талассемия.
Консерваторы, в свою очередь, озабочены тем, что генетик может взять на себя роль своеобразного «бога» и попытается вмешаться в действия законов природы.
Во-вторых, учитывая концепцию евгеники (гены имеют решающее значение в процессе формирования человека), существуют опасения по поводу существования одобренных правительствами программ «улучшения расы» и использования медицинских технологий в немедицинских целях.[3] Другими словами, основными критериями генотерапии являются уважение личности человека, его автономии и соблюдение принципа невмешательства в его частную жизнь.
В-третьих, технология нуждается в совершенствовании, она недостаточно точная. В 2015 году китайские ученые предприняли попытку исправить геном человеческого эмбриона.
В результате эксперимента в 5–10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение β-талассемии у взрослых людей, действительно была исправлена, однако во всех клетках пролеченных эмбрионов возникло большое количество непредвиденных мутаций.[10]
Именно поэтому по-прежнему сохраняется значительная напряженность в отношении эффективности генной терапии, возможности развития негативных последствий. Различные «этические комитеты» безустанно поднимают эту проблему, пытаясь найти «идеальные» условия, при которых это возможно реализовать. В основном на первое место выдвигаются такие параметры, как:
1) Доказательство того, что ген, принесенный в клетку-мишень будет достаточное время функционировать, не теряю свою эффективность.
2) Нужна абсолютная гарантия того, что этот ген не повлечёт за собой неблагоприятные последствия.
Несмотря на кажущуюся простоту, указанные условия не могут быть достаточно конкретизированы, чтобы стать универсальным правилом.
Для каждого случая применения этой технологии придется определять, какие сроки сохранения эффективности гена будут считаться достаточными, каков может быть потенциальный риск для пациента, и как он будет соотноситься с предполагаемым положительным лечебным эффектом.[6]
Д. Нейсбит также отмечает, что использование генетической информации страховыми компаниями приводит к отказу от оказания медицинской помощи в ряде случаев. Основанием здесь служит генетическая предрасположенность к некоторым заболеваниям, которая присутствует у человека с рождения.[2]
Безусловно, радует актуальность данного вопроса на сегодняшний день. На наш взгляд, максимальное этическое напряжение преимущественно связано с возможностью применения этих технологий для «улучшения» человека, целенаправленного выведения особей с заданными характеристиками.
[5] Эта мысль находит место в идеи эволюции человека, наиболее полно сформулированной Фридрихом Ницше в его концепции «сверхчеловека», а в XX в. — в философии трансгуманизма.
Для представителей трансгуманистического мировоззрения «улучшение» человека через модификацию генома является не только этически допустимым, но и, бесспорно, желаемым.[7]
Поэтому на сегодняшний день существует множество морально-этических норм и требований к генетическим технологиям и методам, которые закреплены в ряде международных этико-правовых документов, а также в законодательстве РФ.
Главным документом в этой области является «Конвенция о биомедицине и правах человека» 2005 года, в которой отражены основные принципы регулирования генетических исследований, генной инженерии и терапии.
Так, статья 13 «Конвенции» гласит: «Вмешательство в геном человека, направленное на его модификацию, может быть осуществлено только в профилактических, терапевтических или диагностических целях и только при условии, что подобное вмешательство не направлено на изменение генома наследников данного человека».
Существует большое количество иных международных документов, относящихся к этой сфере: «Всеобщая декларация о геноме человека и правах человека» (ЮНЕСКО, 1997), «Всеобщая декларация о биоэтике и правах человека» (ЮНЕСКО, 2005), «Декларация о клонировании человека» (ООН, 2005) и другие.
В нашей стране основные аспекты этико-правового регулирования генной инженерии и генной терапии отражены в Федеральном законе «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 05.07.1996 N 86-ФЗ (действующая редакция, 2016).
В нем говорится, что одним из основных направлений в области государственного регулирования генно-инженерной деятельности является улучшение условий жизни человека и охрана его здоровья, а также определяется ответственность за нанесенный человеку и окружающей среде вред.
Резюмируя все вышесказанное, можно сделать вывод, что технология CRISPR/Cas9 может быть весьма перспективной в лечении многих заболеваний.
Но нельзя забывать, что сами методы диагностики этих заболеваний еще не совершенны.
Так многие заболевания кодируются не одним геном, а сотнями и тысячами генов, и идентификация этих генов также требует высокой точности, чего сегодня еще не смогли добиться.
Диагностика многих генетических заболеваний затруднена вследствие того, что гены, отвечающие за возникновение этих заболеваний, являются рецессивными и фенотипически не проявляются. Поэтому, на данный момент, на первое место нам необходимо поставить разработку методов диагностики, а уже потом внедрять методы генотерапии.[8]
Не стоит забывать и о правовом регулировании данной сферы деятельности. Вмешательство в геном человека, прежде всего, должно быть безопасным как для него, так и для окружающей среды.
Важную роль в вопросах правового регулирования должны играть как государство, так и международные научные сообщества.
Направленность генетических исследований, методы генной инженерии и терапии должны сопоставляться с морально-этическими принципами и нормами современных биотехнологий.
Генная терапия
В результате исследований учеными было выявлено, что одной из причин возникновения раковых клеток являются генетические изменения в организме. Ошибки в ДНК вызывают изменения в генах, в тех, которые контролируют деление клетки.
Появление повреждений в геноме приводит к перерождению нормальных клеток в раковые. Один из генов может повредиться настолько, что станет причиной неконтролируемого деления клеток, способствующего злокачественному перерожднению.
На более поздних стадиях клетки, отделяясь от опухоли, по кровеносному и лимфатическому руслу распространяются по всему организму, метастазируют. В настоящее время созданы специальные базы, объединенные в Атлас Ракового Генома, в которых занесены сведения о более чем 1,2 млн. генных мутаций.
Как работает генная терапия
На базе научно-исследовательских институтов г.Москвы стремительно растет интерес к этому виду терапии, как наиболее эффективному и безопасному. Методика позволяет оперировать с онкоклетками как внутри организма (in vivo), так и вне его (ex vivo).
Генная терапия in vivo предполагает введение генов в пораженные клетки. Терапия ex vivo предполагает выделение клеток из костного мозга пациента с последующим введением в них здорового гена, в результате полученный материал вводится в опухолевую ткань или в клетки иммунной системы. Этот процесс осуществляют специальные векторы, которые были созданы при помощи генной инженерии.
Как взаимодействуют гены и вирусы
Перенос генетического материала из одной клетки в другую проводится с помощью вирусов. В большинстве случаев применяют распространенные типы носителей – вирусы кори, оспы, так как они имеют свойство доставлять внутрь ткани генетический материал.
Эти вирусы модифицируют, для того чтобы они не заразили пациента. Все негативные последствия направлены на больные клетки, без воздействия на здоровые.
Важным фактором применения данной методики является ее безопасность и отсутствие рисков бесконтрольного распространения пораженной вирусом ДНК.
Электропорация
Популярная методика невирусной доставки предполагает воздействие на поверхность клеток тканей посредством электрических импульсов, в результате чего наблюдается образование мелких пор, сквозь которые внутрь клеток легко проникают плазмидные ДНК. Данная методика идеально подходит для лечения как первичных, так и метастатичных опухолей.
Выбор методики лечения
Учитывая тип и размеры опухоли, стадию развития заболевания, а также индивидуальные особенности организма пациента, врач выбирает методику и разрабатывает индивидуальную схему лечения. В настоящее время к применению возможны следующие техники:
• Пролекарственная ГТ, которая заключается во введении специальных генов, именуемых «суицидными», в опухолевые ткани. В результате активной деятельности последних онкоклетки неизбежно погибают. Недостатком данной методики является постепенная адаптация раковых клеток к повреждающему их пролекарству.
• Онколитическая вирусная ГТ, базирующаяся на использовании вирусов, которые в результате генетических изменений становятся онколитическими, то есть способными воздействовать на пораженные клетки, но безвредными для здоровых тканей.
Данная методика обладает важным преимуществом перед остальными из-за возможности быстрого распространения онколитических вирусов по всему организму посредством кровеносных сосудов.
Это обеспечивает проникновение вирусов как в очаг опухолевого поражения, так и в отдаленные метастазы.
Заключение
Эволюционные подходы к разработкам методик лечения рака позволяют утверждать, что уже сегодня на смену традиционным методам лечения приходит персонализированная медицина. В результате для каждого пациента подбирается индивидуальная программа терапии, отличающиеся безопасностью и высокой эффективностью. Одной из таких программ является генная терапия.
Загрузка...
