Культивирование вирусов. Биотехнологии в вирусологии.

Массовое выращивание клеток в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и, в первую очередь, производства вирусных препаратов. Эта стадия определяет массу и качество клеток и, тем самым, в целом технологию получения вирусного сырья.

Выбор способа культивирования вируса в значительной мере определяется способностью клеток размножаться на поверхности плотного субстрата или в суспензионной культуре. Трудно определить верхние и нижние границы крупномасштабного или промышленного выращивания вирусов в клеточных культурах.

Все зависит от масштабов производства вирусных препаратов. В одних случаях речь идет о получении сотен литров, в других — десятков и даже сотен тысяч литров культурального вируса в год. Это зависит от вида вакцин и масштабов их применения.

Изготовление живых вакцин при прочих равных условиях всегда требует меньших объемов вирусного сырья, нежели приготовление инактивированных, в особенности концентрированных вакцин.

Отсутствие эффективных вакцин для профилактики некоторых заболеваний объясняется, прежде всего, отсутствием экономичного способа получения иммуногенного материала в достаточном количестве.

В отличие от инактивированных вакцин против ящура и полиомиелита, выпускаемых в больших количествах, при многих заболеваниях человека и животных применяют живые вакцины, для изготовления которых не требуется большого количества вирусного сырья. Это, прежде всего, относится к тем вакцинам, которые перед применением разводят.

Ежегодно производство таких вакцин, связанное с получением сотен литров культурального вируса, удовлетворяется использованием статических или вращающихся культуральных сосудов. Однако такие методы культивирования вирусов не могут удовлетворить крупномасштабное производство ряда вирусных вакцин.

Например, при изготовлении противоящурной вакцины перевиваемые клетки выращивают в суспензии в реакторах с рабочим объемом более 1000 л. Крупные научно-производственные центры Южной Америки ежегодно вырабатывали до 600 млн. доз моновалентной инактивированной противоящурной вакцины.

Для этой цели необходимо еженедельно получать около 20 000 л суспензионной культуры клеток ВНК-21.

До недавнего времени производство большинства вирусных препаратов основывалось на использовании первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. Кроме того, в качестве клеточных субстратов для производства вакцин, применяемых в медицине, использовали немногие линии диплоидных клеток с ограниченной жизненной потенцией.

Широкое применение таких препаратов в медицине и ветеринарной практике дало возможность достичь больших успехов в борьбе со многими опасными вирусными болезнями человека и животных. Однако первичные культуры клеток во многих отношениях не являются перспективными клеточными субстратами.

Их приготовление связано с периодическим убоем животных и необходимостью выделения клеток из тканей.

Первичные культуры отличаются нестандартностью, таят в себе опасность в отношении эндогенной контаминации различными вирусами и микроорганизмами. Наконец, их сложно выращивать в условиях крупносерийного производства.

Отмеченные трудности значительно возрастают в связи с тенденцией постоянного увеличения масштабов изготовления противовирусных препаратов. Кроме того, в последнее время все более широкое развитие получает разработка концентрированных и субъединичных вакцин, при изготовлении которых требуется большое количество вирусного материала.

Естественно, что стоящая задача может быть решена лишь путем использования постоянных (перевиваемых) линий клеток, отличающихся способностью к бесконечной пересеваемости вне организма, высокой стандартностью, низкой стоимостью, относительной простотой трансфекции рекомбинантной ДНК и последующего клонирования высокоэффективных продуцентов, высокой вероятностью правильного посттрансляционного процессинга вновь синтезируемых белков, кодируемых трансфецирующей ДНК.

Ветеринарная наука в течение последней четверти века накопила большой опыт в изготовлении вирусных вакцин с использованием в качестве субстрата для размножения вирусов культур постоянных линий клеток животных. Особый успех достигнут в изготовлении инактивированной противоящурной вакцины.

Производство вакцин против ящура имеет наиболее цитируемую технологию. Она основана на использовании линии трансформированных клеток новорожденного хомяка, выращиваемых в суспензии. Эта технология достаточно экономична, ее выполняют в биореакторах большой емкости.

Накоплены определенные доказательства безопасности некоторых постоянных клеточных линий, используемых в качестве субстрата в производстве ряда биологических препаратов. Например, инактивированную противоящурную вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре постоянной линии клеток почки новорожденного хомяка (линия ВНК-21).

Более чем за 20-летний период этой вакциной привито свыше 100 млн. голов крупного рогатого скота и не обнаружено каких-либо нарушений у привитых животных, по крайней мере, в течение 2—4 лет после введения вакцины.

Имеется много других примеров безопасности применения инактивированных и даже живых вакцин против ряда болезней животных, приготовленных из вирусов, размноженных в культурах различных постоянных линий клеток. Применение биологических препаратов, полученных на основе перевиваемых клеточных линий, в медицине началось намного позже, чем в ветеринарной практике.

Несмотря на очевидные преимущества постоянных линий клеток, медицинская практика до недавнего времени воздерживалась от их применения в производстве вирусных вакцин.

Причина заключалась в том, что, согласно существовавшему мнению, для изготовления медицинских вирусных вакцин можно было использовать клетки из тканей только клинически здоровых животных. Производство таких вакцин ограничивалось использованием первичных и диплоидных культур клеток.

В диплоидных линиях клеток человека никогда не были обнаружены латентные вирусы или спонтанная трансформация клеток.

Основное возражение против использования постоянных клеточных линий для репликации вирусов и векторных рекомбинатов в производстве вирусных вакцин медицинского назначения заключалось в их возможной онкогенности из-за контаминации вакцин клеточной ДНК или генными продуктами (регуляторными белками).

Интеграция гетерогенной ДНК может привести к предзлокачественным изменениям в результате активации протоонкогенов, запуску онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии. В процессе репродукции вакцинных штаммов для живых вакцин с использованием клеточных линий, латентно контаминированных другими вирусами, могут появляться вирусные гибриды с неожиданными свойствами.

Этот вопрос рассматривался неоднократно на различных научных форумах в Европе и Северной Америке.

Ценность постоянных клеточных линий в качестве субстратов стала особенно очевидной благодаря успехам, достигнутым в последнее время в области фундаментальных биологических исследований, а также в связи с перспективой их использования в рекомбинантной ДНК-технологии и получении генно-инженерных биопрепаратов.

Общая тенденция к применению постоянных клеточных линий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов наметилась на рубеже 70—80-х годов. Так, в 1978 г. в Лейк-Плесиде (США) было предложено использовать лимфобластоидные клетки человека для крупномасштабного производства альфа-интерферона. В 1981 г.

Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов одобрил применение неопухолевых и неконтаминированных вирусами постоянных клеточных линий для производства инактивированной полиомиелитной вакцины, а затем также для инактивированной вакцины против бешенства. Такое решение дало возможность в короткий срок разработать методы крупномасштабного выращивания вирусов с использованием микроносителей и создать высокоэффективные вирусные вакцины.

В истории создания биологических препаратов ключевая роль всегда принадлежала выбору приемлемо безопасных вариантов.

Решение о применении людям биопрепаратов, полученных с использованием постоянных клеточных линий, основывалось на оценке различными комитетами выгод и риска, связанных с созданием новых препаратов, по сравнению с существующими.

Важнейшие потенциальные факторы риска, связанные с биологическими препаратами, производимыми на постоянных клеточных линиях, можно разделить на три категории: примесь гетерогенной ДНК, вирусы и трансформирующие белки.

Одним из основных вопросов, требующих самого пристального внимания, является потенциальная долгосрочная опасность, связанная с присутствием в препаратах примесей гетерогенных ДНК, особенно в тех случаях, когда последние могли содержать потенциально онкогенные кодирующие или регуляторные последовательности.

— Также рекомендуем «Опасность культивирования вирусов. Осложнения вирусной биотехнологии.»

Оглавление темы «Биотехнологии в вирусологии.»: 1. Дефектные интерферирующие вирусные частицы. ДИ-частицы вирусов. 2. Типы взаимодействия вирусов с клетками. Особенности воздействия вирусов на клетки. 3. Культивирование вирусов. Биотехнологии в вирусологии. 4. Опасность культивирования вирусов. Осложнения вирусной биотехнологии. 5. Среды для выращивания вирусов. Клеточные субстраты в вирусологии. 6. Постоянная клеточная линия для выращивания вирусов. Непрерывное культивирование вирусов. 7. Виды культур клеток в биотехнологии вирусов. Культуры лимфобластоидных и миеломных клеток. 8. Контаминация клеточных культур в вирусологи. Загрязнение культуры с вирусами. 9. Вирусная контаминация в вирусологи. Борьба с вирусной контаминацией. 10. Проверка клеточной культуры на контаминацию вирусами. Вирусы контаминирующие клеточные культуры.

Культивирование вирусов в питательных средах

Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.

Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.

Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов.

Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования.

К примеру, таким условием являются температурные скачки.

Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины.

Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих.

Реже в организме половозрелых особей.

Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.

На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.

Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.

Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.  

Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.

Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства.

Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.

На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.

Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.

Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду.

Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем.

Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.

Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.

Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу.

Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью.

Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.

Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.

Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей.

В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым.

Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.

Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.

При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.

Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.

Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.

Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала.

Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах.

Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.

Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации.

Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома.

Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.

Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.

Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.

После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой:

3.4. Культивирование вирусов

Культивирование
вирусов человека и живот­ных
проводят с целью лабораторной диагнос­тики
вирусных инфекций, для изучения
пато­генеза
и иммунитета при вирусных инфекци­ях,
а также для получения диагностических
и вакцинных
препаратов. Вирусы культивируют на
трех биологических моделях: в организ­ме
лабораторных животных, в развивающихся
эмбрионах
птиц (чаще на куриных эмбрионах) и
культурах клеток (тканей).

Выращенные
вирусы определяют с помощью методов
индикации и идентификации. Индикация
вирусов,
т.е.

обнаружение факта их репродук­ции,
основана на выявлении различных
био­логических
свойств вирусов и особенностей их
взаимодействия
с чувствительными клетками.

Идентификация
(определение
вида, типа) вирусов осуществляется,
в основном, с помощью иммуно­логических
реакций, основанных на взаимодейс­твии
антигенов вирусов и соответствующих
им антител (см. «Реакции иммунитета»).

Лабораторных
животных
(взрослых или новорожденных белых мышей,
хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают
иссле­дуемым вируссодержащим материалом
раз­личными способами (подкожно,
внутримы­шечно, интраназально,
интрацеребрально и т. д.

) в зависимости
от тропизма вирусов.

Использование
животных для культивирова­ния вирусов
в диагностических целях весьма ограничено
из-за видовой невосприимчи­вости
животных ко многим вирусам челове­ка,
контаминации животных посторонними
микробами, а также по экономическим и
этическим соображениям.

О репродукции
вирусов в организме жи­вотных
судят по развитию у них видимых клинических
проявлений заболевания, па-томорфологическим
изменениям органов и тканей, а также на
основании реакции
гемаг-глютинации
(РГА)
с суспензией из органов, содержащих
вирусы. РГА основана на способ­ности
многих вирусов вызывать склеивание
(агглютинацию) эритроцитов человека,
птиц и
млекопитающих в результате взаимодейс­твия
вирусных белков (гемагглютининов) с
рецепторами эритроцитов.

Куриные эмбрионы
(5—12-дневные) зара­жают путем введения
исследуемого матери-

ала в различные
полости и ткани зародыша. Таким образом
можно культивировать виру­сы гриппа,
герпеса, натуральной оспы и др.

Достоинствами модели являются:
возмож­ность накопления вирусов в
больших коли­чествах; отсутствие
скрытых вирусных ин­фекций;
доступность для любой лаборатории.

О
репродукции вирусов в куриных эмбрионах
свидетельствуют:
специфические поражения оболочек
и тела эмбриона (оспины, крово­излияния);
гибель эмбриона; положительная РГА
с вируссодержащей жидкостью, получен­ной
из полостей зараженного зародыша.

Методику
культивирования вирусов в раз­вивающихся
эмбрионах птиц используют при промышленном
выращивании вирусов. Однако
многие вирусы не размножаются в эм­брионах
птиц; почти неограниченные возмож­ности
для культивирования вирусов появились
после
открытия метода культур клеток.

Культуру
клеток (тканей)
наиболее часто применяют
для культивирования вирусов. Метод
культур клеток разработан в 50-х годах
XX
века Дж. Эндерсом и соавт., получивши­ми
за это открытие Нобелевскую премию.

Клетки, полученные из различных органов
и тканей
человека, животных, птиц и дру­гих
биологических объектов, размножают вне
организма
на искусственных питательных средах в
специальной лабораторной посуде.

Большое
распространение получили культу­ры
клеток
из эмбриональных и опухолевых
(злокачественно
перерожденных) тканей, обладающих, по
сравнению с нормальными клетками
взрослого организма, более актив­ной
способностью к росту и размножению.

• При выращивании
  культур клеток необхо­димо выполнение
  ряда условий:
• 1)
  соблюдение правил асептики: 2) исполь­зование
  лабораторной посуды из нейтрально­го
  стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или
  специальных
  реакторов для получения био­технологической
  продукции; 3) использование сложных
  по составу питательных сред (среда 199,
  Игла), содержащих минеральные соли,
  аминокислоты,
  витамины, глюкозу, сыворотку крови
  животных или человека, буферные рас­творы
  для поддержания стабильного рН; 4)
  до­бавление
  антибиотиков к питательной среде для
  подавления роста посторонних микробов;
• 5)
  соблюдение оптимальной температуры
  (36— 38,5 °С)
  роста клеток.
• В зависимости от
  техники приготовления различают
  однослойные, суспензионные и органные
  культуры клеток:

Однослойные
культуры клеток — клетки
спо­собны
прикрепляться и размножаться на
повер­хности химически нейтрального
стекла лабора­торной
посуды в виде монослоя. Они получили
наибольшее применение в вирусологии.

• Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во враща­ющемся барабане. Их используют для получе­ния большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин.
• Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются огра­ниченно).

Культуры
клеток в процессе их культиви­рования
способны проходить десятки гене­раций.
По числу жизнеспособных генераций
культуры клеток подразделяют на: 1)
пер­вичные, или первично-трипсинизированные;
2)
перевиваемые, или стабильные; 3)
полупе­ревиваемые.

Первичные
культуры способны
размножать­ся
только в первых генерациях, т. е.
выдержи­вают
не более 5— 10 пассажей после выделения
из тканей.

В основе получения первичных культур
лежит обработка кусочков тканей
(эм­бриональных,
опухолевых или нормальных) протеолитическими
ферментами, например трипсином, который
разрушает межклеточ­ные
связи в тканях и органах с образованием
изолированных
клеток.

Перевиваемые,
или
стабильные,
культуры
клеток
способны размножаться в лаборатор­ных
условиях неопределенно длительный срок
(десятки лет), т. е. выдерживают
мно­гочисленные
пассажи.

Их получают преиму­щественно
из опухолевых или эмбриональ­ных
тканей, обладающих большой потенцией
роста. Перевиваемые культуры клеток
имеют преимущества
перед первичными культура­ми.

К ним
относятся: продолжительность их
культивирования, высокая скорость
размно-

жения опухолевых
и эмбриональных клеток, меньшая
трудоемкость, способность культур
сохранять
свои свойства в замороженном со­стоянии
в течение многих лет, возможность
использования
международных линий культур во
многих лабораториях мира.

Однако
злока­чественный характер клеток и
соматические мутации,
претерпеваемые нормальными клет­ками
в гпоцессе многочисленных генераций,
ограничивают
использование этого вида куль­тур, в
частности невозможно их применение в
производстве
вирусных вакцин.

Полуперевиваемые
культуры клеток имеют
ограниченную
продолжительность жизни и выдерживают
40—50 пассажей. Их обычно по­лучают
из диплоидных клеток эмбриона че­ловека.

В процессе пассажей эти культуры
сохраняют диплоидный набор хромосом,
ха­рактерный
для соматических клеток исходной ткани,
и не претерпевают злокачественной
трансформации.

Поэтому полуперевиваемые культуры
клеток могут быть использованы как в
диагностике, так и в производстве вакцин.

Внедрение
в вирусологию метода культур клеток
позволило выделить и идентифициро­вать
многочисленные ранее неизвестные
ви­русы,
так как почти к каждому вирусу можно
подобрать
соответствующие чувствительные клетки,
в которых он способен репродуциро­ваться.
Метод дал возможность изучать
взаи­модействие
вирусов с клеткой на молекуляр­ном
уровне, получать высококачественные
вакцинные и диагностические препараты,
проводить
вирусологические исследования в
стандартных
условиях.

О
репродукции вирусов в культуре клеток,
зараженных
вируссодержащим материалом, можно
судить на основании следующих фе­номенов:
цитопатогенного
действия (ЦПД)
вирусов,
или цитопатического
эффекта, об­разования
внутриклеточных включений;
об­разования
«бляшек»;
реакций
гемадсорбции
и
гемагглютинации;
«цветной» реакции.

ЦПД —
патологические изменения морфо­логии
клеток, вплоть до их гибели, возника­ющие
в результате репродукции вирусов, и
наблюдаемые
под микроскопом (рис. 3.11). В зависимости
от особенностей репродуци­рующихся
вирусов ЦПД может отличаться. В
одних случаях быстро вакуолизируется
ци-

топлазма, разрушаются
митохондрии, округ­ляются и гибнут
клетки, а в других — фор­мируются
гигантские многоядерные клетки (так
называемые симпласты) или наблюдает­ся
явление клеточной пролиферации, которое
в итоге заканчивается деструкцией
клеток. Таким образом, характер ЦПД
позволяет ис­пользовать
этот феномен не только для инди­кации
вирусов, но и для их ориентировочной
идентификации
в культуре клеток.

Некоторые вирусы
можно обнаружить и идентифицировать
по внутриклеточным вклю-

чениям,
которые
образуются в ядре или цитоп­лазме
зараженных клеток (рис. 3.12). Часто
включения представляют собой скопления
вирусных
частиц или отдельных компонентов
вирусов,
иногда могут содержать клеточный
материал.

Выявляют включения с помощью светового
или люминесцентного микроско­па после
окрашивания зараженных клеток
соответственно анилиновыми красителями
или
флюорохромами. Включения могут отли­чаться
по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые
или неправильные) и численности (одиночные
и множественные).

Характерные
цитоплазматические
включения формируют­ся
в клетках, инфицированных вирусом
нату­ральной
оспы (тельца Гварниери), бешенства
(тельца Бабеша—Негри), а внутриядерные
включения
— при заражении аденовирусами или
вирусами герпеса.

«Бляшки»,
или
«негативные
колонии», — пред­ставляют
собой ограниченные участки разру­шенных
вирусами клеток в сплошном монослое
культур
клеток. Они видны невооруженным гла­зом
в виде светлых пятен на фоне окрашенного
монослоя
живых клеток (рис. 3.13).

Добаатение агара
в питательную среду ограничивает
рас­пространение вирусов по всему
монослою посте выхода
их из разрушенной клетки и обеспечи­вает
взаимодействие вирусов только с
соседни­ми клетками. Каждая «бляшка»
образуется по­томством
одного вириона.

Подсчитав катичес-тво
«бляшек», можно определить концентрацию
вирусов
в исследуемом материале. Кроме того.
«бляшки» разных групп вирусов отличаются
по размеру, форме, срокам появления.

Поэтому ме­тод
«бляшек» используют для дифференциации
вирусов,
а также для селекции штаммов и полу­чения
чистых линий вирусов.

В
основе реакции
гемадсорбции лежит спо­собность
культур клеток, инфицированных вирусами,
адсорбировать на своей поверхности
эритроциты.
Целый ряд вирусов (гриппа, па­рагриппа
и др.

) обладают гемадсорбирующими
свойствами,
что позволяет использовать реак­цию
гемадсорбции для индикации этих виру­сов
даже при отсутствии выраженного ЦПД в
культуре
клеток. Механизмы реакции гемад­сорбции
и гемагглютинации сходны.

Поэтому для
обнаружения репродукции некоторых
ви­русов
в культуре клеток можно использовать

реакцию гемагглютинации
с культуральной жидкостью,
т. е. с питательной средой, содер­жащей
размножившиеся вирусы.

О
репродукции вирусов в культуре клеток
можно
также судить по так называемой «цвет­ной»
реакции. Она
регистрируется по измене­нию
цвета индикатора, находящегося в
пита­тельной
среде для культур клеток.

Если вирусы
не
размножаются в культуре клеток, то живые
клетки
в процессе своего метаболизма выде­ляют
кислые продукты, изменяющие рН сре­ды
и, соответственно, цвета индикатора.

При репродукции
вирусов нормальный метаболизм клеток
нарушается (клетки гибнут), и среда
сохраняет первоначальный цвет индикатора.

Культивирование вирусов в лабораторных условиях

• Культивирование вирусов осуществляют для лабора­торной диагностики вирусных заболеваний человека и живот­ных, изготовления живых и инактивированных противовирусных вакцин и сывороток, изучения вопросов патогенеза и иммуни­тета.
• Культивирование вирусов в организме естественно воспри­имчивых животных проводят в том случае, если исследователь заинтересован сохранить у вируса исходную патогенность и анти­генные свойства.
• Культивирование вирусов в организме лабораторных живот­ных ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим
• вирусам человека.

Одним из наиболее доступных и удобных методов для выде­ления и культивирования вирусов является использование кури­ных эмбрионов.

В куриных эмбрионах способны размножаться вирусы с различным тропизмом, поскольку они содержат четыре субстрата для вируса — амнион, алантоис, хорионаллантоисную мембрану и желточный мешок.

Индикацию вирусов в куриных эмбрионах осуществляют по характеру поражения тела и оболочек эмбриона, а у гемагглюти-нирующих вирусов — в реакции гемагглютинации (склеивания эритроцитов).

Вирусы — это абсолютные внутриклеточные паразиты, ко­торые не способны размножаться ни в одной из бесклеточных питательных сред. В 1949 году Д. Эндерс, Т. Уэллер и Ф. Роббинс сообщили о том, что вирус полиомиелита может размно­жаться и вызывать характерные изменения в культурах не из нервной ткани.

Благодаря этому открытию стало возможным выращивание вирусов в клеточных культурах, а также удалось выделить и описать множество ранее неизвестных вирусов.

От­крытие аденовирусов, эхо- и риновирусов, разработка вакцин против полиомиелита, кори и краснухи непосредственно связа­ны с использованием культур клеток.

Для культивирования различных вирусов используют первич­ные, диплоидные и перевиваемые клеточные линии.

Первичные культуры клеток получают из измельченных жи­вотных тканей, обрабатывая их протеолитическими ферментами. После отмывки и подсчета клеток суспензию разбавляют средой и дают возможность клеткам прикрепиться к плоской поверхнос­ти стеклянной или пластмассовой посуды.

Клетки быстро при­крепляются к поверхности и при оптимальных условиях делятся примерно один раз в день. Первичные или первичнотрипсинизи-рованные культуры клеток осуществляют не более пяти—десяти делений.

Для лабораторных исследований и производства вакцин их получают из эмбриональных тканей человека (почек, амниона), обезьян, мышей, куриных эмбрионов.

Диплоидные клеточные культуры представляют собой клетки фибробластов, полученные из эмбрионов человека. Они могут осу­ществлять до 100 делений, сохраняя при этом свой исходный дип-лоидный набор хромосом.

Перевиваемые клеточные линии — это клетки одного типа, способные размножаться in vitrо неопределенно долго, их полу­чают из трансформированных клеток.

Часто они теряют сходст­во с теми клетками, от которых произошли, претерпевая в тече­ние длительного культивирования последовательные мутации. Перевиваемые клеточные линии Нер-1, Нер-2, Не1а и КВ ведут н ачало от карцином человека.

Эти линии, а также линии, проис­ходящие от клеток тканей мышей (L929), хомячков (ВНК-21) широко используются в экспериментальной вирусологии.

О размножении вирусов в культуре клеток можно судить по датопатическому эффекту — ЦПЭ (см. вкл. IV); образованию в клет-:ах вирусных включений; бляшкам в клеточном монослое; явле­нию гемадсорбции; изменению цвета индикатора питательной среды для клеток.

Культивирование зоопатогенных вирусов | справочник Пестициды.ru

Культивирование зоовирусов производится в процессе изучения клинической картины и патогенеза вирусных заболеваний, при необходимости диагностики вирусных инфекций, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов[3].

Впервые культивирование вируса бешенства осуществил В. Гальтье в 1879 году. Для этого кролик был заражен мозгом больной собаки. А. Левенштейн в 1919 году впервые опубликовал данные об успешной передаче вирусов герпеса к кролику от человека[2].

В. Грютер в 1920 году доказал, что вирус герпеса возможно культивировать на кроликах. Ф. Паркер и В.Н. Най в 1925 году доказали способность вируса коровьей оспы репродуцироваться в тканевой культуре. А.М. Вудрафф и Э. Гудпасчер продемонстрировали возможность культивирования зоовирусов, в частности, вируса оспы птиц, на хорионаллантоисной оболочке эмбрионов кур[2].

В 1954 году американские вирусологи Дж. Эндерс и Т. Уэллер получили Нобелевскую премию за разработку техники культивирования полиомиелита в тканевых культурах[3].

Известно, что вирусы способны репродуцироваться только в живых клетках. Установлено существование трех биологических систем в которых возможно культивирование вирусов вообще и зоовирусов в частности:

• организм лабораторных животных;
• развивающиеся куриные эмбрионы;
• культуры клеток[4][3].

В целях заражения биологической системы конкретным видом вируса из исследуемого материала готовят суспензию. Для освобождения от посторонней микрофлоры (грибов и бактерий) в нее добавляют антибиотики. Готовый материал вводят в биологическую систему[3].

В качестве лабораторных животных в вирусологических исследованиях используют белых крыс, белых мышей, морских свинок, золотистых хомячков, кроликов и другие виды[3].

Заражение животных вируссодержащим материалом проводится различными способами: внутримышечно, подкожно, внутривенно, интраназально и прочее. Способ заражения выбирается в зависимости от ткани, поражаемой данным видом вируса (тропизм вируса)[3].

Репродукцию вируса в организме животного оценивают: по развитию видимых клинических симптомов или по патоморфологическим изменениям тканей и органов.

Интенсивность репродукции вирусов показывают реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы.

Данная реакция основана на способности вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих при взаимодействии вирусных белков с рецепторами эритроцитов[3].

Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) пригодные для вирусологических исследований имеют возраст 5–12 дней. Их использование дает возможность изготовить большое количество вируссодержащего материала и используется при производстве вакцин[3].

Заражения РКЭ производят различными способами:

• на хорионаллантоиносную оболочку (ХАО);
• на аллантоисную полость;
• в амниотическую полость;
• в желточный мешок;
• в тело эмбриона[3].

Репродукцию вирусов устанавливают по гибели эмбриона, патологическим изменениям в оболочках и тканях, положительной реакции гемагглютинации (РГА). Гибель эмбриона определяют при прекращении его движения, выявляемое при овоскопировании (просвечивании)[3].

Погибшие эмбрионы вскрывают. Извлекают их содержимое и проводят патологоанатомическое исследование. Эмбриональную жидкость смешивают с эритроцитами для определения гемагглютинации[3].

Культура клеток является широко используемой биологической системой для культивирования вирусов. Ее получают из органов и тканей животных, птиц, человека. Клетки, полученные из разнообразных тканей и органов теплокровных животных, размножают вне организма в специальной лабораторной посуде на искусственных питательных средах[3].

Питательные среды, используемые для данной цели делят на:

• ростовые – применяются для выращивания клеточных культур и обогащены сыворотками крови;
• поддерживающие – применяются для сохранения монослоя клеток после заражения вирусами[3].

При выращивании клеточных культур соблюдаются требования строгой антисептики.

Кроме того, используется посуда только из стекла нейтрального состава и сложные по составу питательные среды, содержащие минеральные соли, витамины, аминокислоты, глюкозу, сыворотку крови, буферные растворы.

Для успешного выращивания клеточных структур в питательную среду добавляют антибиотики для подавления нежелательной микрофлоры. Оптимум температуры культивирования – + 36ºC–38,5ºC[3].

При заражении культур из сосудов с выросшим монослоем клеток удаляют остатки питательной среды. Затем монослой отмывают раствором Хенкса и вносят в него материал содержащий вирус. Спустя час – полтора остатки вируссодержащего материала удаляют, вносят поддерживающую питательную среду и инкубируют культуру в термостате[3].

Репродукцию культивируемых вирусов оценивают по следующим феноменам:

1. Цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическомц эффекту (ЦПЭ) – патологические изменения морфологии клеток вплоть до их гибели[3].
2. Образование внутриклеточных включений. Они могут быть локализованы в ядре и цитоплазме и представлять собой скопление вирусных частиц или отдельных компонентов вируса. Выявляются с помощью микроскопирования[3].
3. Образование бляшек или негативных колоний под агаровым покрытием. Бляшки являются участками разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое. Они видны невооруженным глазом в форме светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Каждая из них формируется потомством одного вириона. Бляшки, формируемые разными видами вирусов, различают по внешнему виду и срокам появления[3].
4. Реакции гемадсорбции – способности культур клеток, инфицированных вирусом адсорбировать на своей поверхности эритроциты[3].
5. Цветная реакция – изменение цвета индикатора, находящегося в питательной среде. Основана на том, что при отсутствии размножения вирусов, живые клетки в результате метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие цвет индикатора. При репродукции вируса метаболизм клеток нарушается. Они гибнут, и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора[3].

Составитель: Григоровская П.И.

Страница внесена: 01.12.20 17:15