Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.

Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам. Метод культивирования клеток и тканей находит применение в биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, фармацевтике и др. смежных областях. Клетки, ткани или органы выделяются из животных или растений и помещаются в искусственную питательную среду для поддержания роста и/или пролиферации. Основными условиями, необходимыми для оптимального роста клеток являются: контролируемый температурный режим, субстрат для прикрепления клеток (для адгезивных культур клеток), подходящая культуральная среда, СО2-инкубатор для контроля уровня рН, поддержание осмотического давления. Наиболее важным моментом для обеспечения оптимального роста/пролиферации клеток является выбор подходящей культуральной среды. Культуральная среда представляет собой жидкость или гель, разработанная для поддержания роста/пролиферации клеток различного происхождения. Среда для культивирования клеток состоит из определенного соотношения аминокислот, витаминов, солей, глюкозы, гормонов, факторов прикрепления, факторов роста; поддерживает буферную систему и осмотическое давление.

Основные компоненты культуральной среды.

Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.
  • Компоненты, обеспечивающие буферную систему культуральной среды.

Культивируемые клетки сильно реагируют на изменение рН среды. Оптимальное значение рН для большинства клеток лежит в пределах 7,2-7,4. Бикарбонат натрия поддерживает «естественную» буферную систему культуральной среды (CO32- /HCO3-); требуя содержания 5-10 % СО2 в атмосфере, что легко выполнимо при культивировании клеток в СО2-инкубаторе. ХЕПЕС представляет собой фосфатную соль с буферной емкостью в пределах 7,2-7,4 рН. Не требует контролируемой газовой среды, но в больших концентрациях может быть токсичен для некоторых типов клеток. Феноловый красный используется как индикатор рН: красный при рН 7,4 и меняет свой цвет до оранжевого или желтого при уменьшении значения рН. Для культивирования клеток, чувствительных к эстрогену рекомендуется использовать среду без фенола красного.

Неорганические соли поддерживают осмотическое давление в среде и помогают в регуляции мембранного потенциала, обеспечивая среду ионами натрия, калия и кальция. Осмоляльность среды так же важна, как уровень рН при культивировании клеток. Оптимальное значение осмоляльности лежит в пределах 260-340 мосмоль/кг в зависимости от типа культивируемых клеток. Аминокислоты являются строительным материалом для белков; незаменимые аминокислоты всегда входят в состав культуральной среды. Особенно важен L-глутамин; обеспечивает азотом НАД, НАДФН и нуклеотиды, являясь вторичным источником энергии для метаболизма клетки. Заменимые аминокислоты также иногда добавляются в культуральную среду. Большинство сред включают в себя глюкозу и галактозу как источник энергии для клеток.
Наиболее часто используемыми белками и пептидами является альбумин, трансферрин и фибронектин; они особенно важны при бессывороточном культивировании. Альбумин связывает воду, соли, гормоны и витамины и транспортирует их между клетками и тканями. Фибронектин играет ключевую роль в адгезии клеток. Трансферрин – белок-переносчик железа, обеспечивающий железом клеточную мембрану. Особенно важны при бессывороточном культивировании, так как сыворотка обычно содержит их. Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.
Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам. Многие витамины необходимы для клеточного роста и пролиферации. В культуральную среду обычно добавляют рибофлавин, тиамин и биотин. Наиболее важным компонентом культуральной среды является сыворотка; она добавляется перед применением, примерно 5-10 %. Сыворотка представляет собой смесь альбуминов, факторов роста и ингибиторов роста; является источником витаминов, аминокислот, белков, углеводородов, жиров, микроэлементов, факторов роста. Наиболее часто используют бычью и телячью эмбриональную сыворотку. Факторы роста, цитокины, гормоны добавляются в культуральную среду для пролиферации и активации клеток. Антибиотики добавляются для предотвращения контаминации культуральной среды бактериями и грибами; однако антибиотики не предотвращают заражение культуральной среды микоплазмой.

Выбор культуральной среды.

Среда MEM (Minimum Essential Medium), или среда Игла была разработана Гари Иглом и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой DMEM. Среда МЕМ содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. Есть модификации среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла. Среда DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) является модификацией среды BME (Basal Medium Eagle) и содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Изначально среда DMEM была с содержанием глюкозы 1г/л и применялась для культивирования эмбриональных клеток мыши. Затем появились модификации среды DMEM (с высоким и пониженным содержанием глюкозы, пирувата натрия, различных добавок) для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Среда DMEM является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой MEM. Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.
Среда DMEM/F-12 в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Изначально среда F12 была разработана для бессывороточного культивирования СНО клеток, клеток легких и мышиных L-клеток. В связи с богатым содержанием питательных веществ в среду DMEM/F12 можно добавлять относительно небольшое количество эмбриональной бычьей сыворотки (FBS–fetal bovine serum), либо использовать без сыворотки, но тогда необходимо добавлять такие факторы, как инсулин, трансферин, эпидермиальный фактор роста и др..

  • Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute (откуда и берет свое название) в 1966 Муром и его коллегами для культивирования лейкоцитов. В настоящее время используется для
  • Среда IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) — это модификация среды DMEM, содержащая селенит натрия, добавочные аминокислоты и витамины, пируват натрия, ХЕПЕС и нитрат калия вместо
  • Среда 199 первоначально была разработана для поддержания культуры первичных эксплантов. В настоящее время среда 199 применяется для продукции вакцин, культивирования первичных эксплантов и

широкого спектра клеточных культур. нитрата железа. Среда IMDM используется для поддержания культуры клеток В лимфоцитов, В клеток, стимулированных полисахаридами, Т лимфоцитов и гибридом. тканей хрусталика. Изначально среда 199 готовилась с солями Эрла, но есть модификация среды 199 с солями Хэнкса. Среды F-12 и F-10 изначально были разработаны Хэмом (Ham′s nutrient mixture) для культивирования СНО клеток, HeLa и мышиных L-клеток. Обе среды были разработаны для бессывороточного культивирования. Среда F-12 применяется для культивирования широкого спектра клеток млекопитающих и гибридом. Среда Грейса (Grace’s Insect Media) применяется для поддержания клеточных линий, полученных от бабочек и некоторых двукрылых. Среда Шнейдера (Schneider’s Insect Media) изначально разрабатывалась для дрозофилы, но может применяться и для поддержания клеточной культуры других двукрылых. Соли Хэнкса (Hanks’ Balanced Salt) изначально были разработаны для поддержания культуры клеток в атмосфере без СО2. Для диссоциации клеток применяются соли Хэнкса без ионов кальция и магния. Соли Эрла (Earle’s Balanced Salts) применяются для суспензионных культур, а также при проблеме слипания клеток. Буфер фосфатный Дульбекко применяется для промывки клеток. Кальций и магний способствуют слипанию клеток; фосфатный буфер без кальция и магния используют для суспензионных культур.

Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.

Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам

Культуры диплоидных клеток тестикулярной ткани ягнят используют в производстве живой вакцины против классической чумы свиней, а тканей легкого эмбриона крупного рогатого скота — для размножения вакцинных штаммов, вирусов чумы крупного рогатого скота и оспы овец. Полевой изолят вируса геморрагической болезни кроликов размножался в штамме клеток почки кролика (DJRK), вызывая ЦПЭ после двух пассажей.

Для выделения и репродукции некоторых вирусов используют специальные линии клеток. Например, для вирусов диареи и ринотрахеита крупного рогатого скота высокочувствительными оказались линии клеток слизистой оболочки носа крупного рогатого скота и легких норок, для многих вирусов свиней — гомологичные линии клеток, а для ротавирусов — линия клеток обезьян (МА-104).

Постоянные линии клеток, полученные из одних и тех же тканей одного вида животного, так же как их сублинии (клеточные клоны), могут значительно различаться между собой спектром чувствительности и вирусной репродукцией.

Продукция вируса лейкоза крупного рогатого скота в хронически инфицированных однослойной и суспензионной культурах в зависимости от используемой сублинии клеток FLK (foetal lamb kidney) может различаться в 10 раз.

Клонированные сублинии клеток ВНК-21 значительно различались между собой чувствительностью к некоторым типам и штаммам вируса ящура.

В суспензионной культуре клеток ВНК-21 по мере длительного пассирования (200 пассажей) наблюдается снижение выхода вируса ящура вследствие нарушения морфогенеза на стадии прокапсида.

Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.

Адаптированные к размножению вне организма штаммы вируса размножаются в культурах, как правило, быстрее и с большим выходом, чем неадаптированные «дикие» штаммы.

Лучше всего размножаются штаммы, адаптированные к данной культуре, хотя их размножению часто способствует первоначальная адаптация к другим клеточным культурам.

Многие вирусы, элективной системой для которых являются культуры клеток гемопоэ-тической системы естественного хозяина, хорошо размножаются в них без адаптации.

При адаптации вирусов, размножающихся медленно и не вызывающих или вызывающих слабый ЦПЭ, целесообразно однослойные инфицированные культуры инкубировать длительно (2—4 недели) и использовать пересев инфицированных клеток. В качестве примера может служить вирус иммунодефицита кошек (штамм Петалюма), который вызывал ЦПЭ в культуре клеток кошачьей Т4-тимус-лимфомы 3101 через 22 дня после заражения.

Адаптация некоторых вирусов и вирусных штаммов к размножению в культуре клеток — трудный процесс, который требует нетрадиционных подходов.

Для адаптации вируса гриппа к новой хозяинной системе предложено использовать метод форсированных пассажей, при котором проводят серию одноцикловых репликаций вируса. Для серийных пассажей применяют «ранний» урожай вируса без разведения.

Положительные результаты получали при сокультивировании инфицированных клеток и тех, к которым желательно адаптировать вирус.

Способный к размножению в организме кроликов штамм L вируса чумы крупного рогатого скота адаптировали в культуре клеток его путем культивирования смеси лимфоцитов селезенки зараженного кролика и клеток Vero в присутствии ПЭГ. Внеклеточный вирус не обнаруживали в течение трех пассажей.

К 11 пассажу вирус накапливался в титре 5,5 lg ТЦД50/мл и кроме клеток Vero приобрел способность размножаться в клеточных линиях ВНК-21, С-1, К-13 непермис-сивных для исходного штамма вируса.

Линия клеток (FLK — BLV), хронически инфицированная вирусом энзоотического лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получена при сокультивировании клеток почки плода овцы и лимфоцитов крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС.

Вирус иммунодефицитоподобного заболевания крупного рогатого скота выделяли от естественно и экспериментально инфицированных телят сокультивированием клеток крови с клетками селезенки плода коров. Индуцированное вирусом образование синцития реже наблюдали в культурах клеток почки и легкого плода коров.

Вирус иммунодефицита кошек (FIV) удается выделить путем инокуляции периферической крови или спинномозговой жидкости больных животных в первичную культуру клеток глии, лимфоцитов или мононуклеарных клеток крови кошек.

Цитопатический эффект наблюдали через 8—14 дней после сокультивации (клеточные агрегаты синцитий, цитоплазматические вакуоли).

При культивировании вне организма одни вирусы обладают широким хозяинным спектром (герпес-, рабдовирусы), другие — узким (napBos коронавирусы).

В последнем случае адаптация вируса к некоторым культурам обычно принятыми методами не удается.

Попытки адаптировать вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней к постоянной линии клеток почек поросят (линия LL C-PKI) оказались безуспешными в отличие от культуры клеток щитовидной железы свиньи.

При культивировании in vitro важное значение могут иметь изменения вирусов, обусловленные клетками хозяина. Вирус ньюкаслской болезни, пассируемый в первичной культуре клеток КЭ, по морфологии, плавучей плотности и устойчивости при градиентном центрифугировании значительно отличался от вируса, размноженного в КЭ.

— Также рекомендуем «Смена вирусной культуральной среды. Изменения вирусов при смене среды.»

Оглавление темы «Методология выращивания вирусов.»: 1. Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов. 2. Факторы влияющие на размножение вирусов. Размножение вирусов в культуре. 3. Особенности культирования вирусов гепатита. Культивирование вируса гриппа. 4. Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам. 5. Смена вирусной культуральной среды. Изменения вирусов при смене среды. 6. Температурный режим культивирования вирусов. Накопление вируса в среде. 7. Протеолитическая активация вирусов. Многофакторность размножения вирусов. 8. Однослойная культура клеток для вирусов. Размножение вирусов в однослойной культуре. 9. Применение однослойных клеточных культур. Выращивание вируса в однослойной культуре. 10. Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.

9. Культуры клеток, классификация, характеристика. Культивирование вирусов на культурах клеток. Подготовка материала, заражение культуры. Методы индикации и идентификации вирусов

Для
культивирования вирусов в лабораторных
условиях используются следующие живые
объекты: 1) культуры клеток (тканей,
органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные
животные.

I. Культуры клеток

Наибольшее
распространение имеют однослойные
культуры клеток, которые можно разделить
на первичные (первично трипсинизированные),
полуперевиваемые (диплоидные),
перевиваемые, трансфецированные.

По
происхождению

они подразделяются на эмбриональные,
опухолевые и из взрослых организмов;
по морфогенезу
— на фибробластные, эпителиальные и
др.

Первичные
культуры
клеток — это клетки какой-либо ткани
человека или животного, способные
культивироваться в виде монослоя на
пластмассовой или стеклянной поверхности
в специальной питательной среде, но не
способные к длительному размножению.
Срок жизни таких культур ограничен.

В
каждом конкретном случае их получают
из ткани после механического измельчения,
обработки протеолитическими ферментами
и стандартизации количества клеток.

Первичные культуры, полученные из почек
обезьян, почек эмбриона человека, амниона
человека, куриных эмбрионов, широко
используются для выделения и накопления
вирусов, а также для производства
вирусных вакцин.

Полуперевиваемые
(диплоидные)
культуры клеток — клетки одного генотипа,
способные in
vitro
выдерживать до 50100
пассажей, сохраняя при этом свой исходный
диплоидный набор хромосом. Диплоидные
линии фибробластов эмбриона человека
используются как для диагностики
вирусных инфекций, так и при производстве
вирусных вакцин.

Перевиваемые
клеточные линии характеризуются
бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут
быть первичные клеточные культуры
(например, СОЦ — из сердца обезьяны
циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона
свиньи, ВНК-21 — из почек однодневных
сирийских хомяков; ПМС — из почки морской
свинки и др.

), отдельные клетки которых
обнаруживают тенденцию к бесконечному
размножению in vitro. Совокупность изменений,
приводящих к появлению в клетках таких
свойств, называют трансформацией,
а клетки перевиваемых тканевых культур
трансформированными.

Другой
источник перевиваемых клеточных линий
злокачественные
новообразования
.
В этом случае трансформация клеток
происходит in vivo.

Получены и наиболее
широко в вирусологической практике
применяются следующие линии перевиваемых
клеток: HeLa — получена из карциномы шейки
матки; Hep-2 — из карциномы гортани;
Детройт-6 — из метастаза рака легкого
в костный мозг; RH — из опухоли почки
человека.

Трансфецированные
культуры клеток. Разработаны
экспериментальные линии культур клеток
методом трансфекции (переноса) генов
вирусов, контролирующих биосинтез
поверхностных антигенов.

Такие культуры
клеток экспрессируют поверхностный
белок определенного вируса (HBs-антиген,
gp120
и др.) на мембране клеток культуры.

Такие
культуры клеток используются с целью
изучения иммунологических механизмов
патогенеза вирусных инфекций, разработки
химиотерапевтических и иммунобиологических
препаратов.

Для
обеспечения жизнедеятельности
культивируемых клеток необходимы
питательные
среды
. По
назначению они делятся на ростовые и
поддерживающие.

В ростовых
питательных средах должно содержаться
больше питательных веществ, обеспечивающих
активное размножение клеток и формирование
монослоя.

Поддерживающие
среды обеспечивают переживание клеток
в уже сформированном монослое в период
размножения в них вирусов.

Широкое
применение находят стандартные
синтетические среды, например,
синтетическая среда 199 и среда Игла.
Независимо от назначения все питательные
среды для культур клеток конструируются
на основе сбалансированного солевого
раствора. Чаще всего им является раствор
Хенкса.

Неотъемлемый компонент большинства
ростовых сред — сыворотка крови животных
(телячья, бычья, лошадиная), без наличия
510%
которой размножение клеток и формирование
монослоя не происходит. В состав
поддерживающих сред сыворотка не входит.

С целью предотвращения возможного роста
микроорганизмов в питательные среды
вносят антибиотики.

Выделение
вирусов в культурах клеток и методы их
индикации

При
выделении вирусов из различных
инфекционных материалов от больного
(кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые,
смывы из органов) применяют культуры
клеток, обладающие наибольшей
чувствительностью к предполагаемому
вирусу. Для заражения используют культуры
в пробирках с хорошо развитым монослоем
клеток.

Перед заражением клеток
питательную среду удаляют и в каждую
пробирку вносят по 0,10,2
мл взвеси испытуемого материала,
предварительно обработанного антибиотиками
для уничтожения бактерий и грибов. После
3060
мин.

контакта вируса с монослоем клеток
удаляют избыток материала, в культуру
клеток вносят поддерживающую среду и
пробы оставляют в термостате до выявления
признаков размножения вируса.

Индикатором
наличия вируса в зараженных таким
образом культурах клеток может служить:

  1. развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

  2. обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

  3. положительная реакция гамагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс);

  4. феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

  5. при отсутствии ЦПД, ГА или ГАдс. можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Культуры клеток диплоидных человека для заместительной терапии — официальная инструкция по применению, аналоги, цена, наличие в аптеках

Синонимы, аналоги Статьи

ИНСТРУКЦИЯ по медицинскому применению лекарственного препарата

Культуры клеток диплоидных человека для заместительной терапии

Торговое наименование препарата

Культуры клеток диплоидных человека для заместительной терапии

Международное непатентованное наименование

Культура клеток [для терапевтических целей]

Лекарственная форма

монослой культуры клеток для приготовления суспензии для наружного и местного применения

Состав

Препарат представляет собой морфологически однородную популяцию клеток штамм ЛЭЧ-4/81 с ограниченным сроком жизни, определённого тканевого происхождения, сохра­няющую стабильный кариотип (2п не менее 75 % клеток), свободную от посторонних аген­тов и не проявляющую раздражающего, общетоксического, иммунотоксического действия, аллергизирующих, мутагенных и канцерогенных свойств, культивируемую на искусствен­ных питательных средах до 25 пассажа. Штамм ЛЭЧ-4/81 аттестован в соответствии с требо­ваниями ВОЗ и хранится в виде посевного банка клеток на уровне 4-6 пассажа, коллекцион­ный шифр 020510/135Б.

Описание

Препарат представляет собой сплошной слой клеток, покрытый прозрачной или слабо опалесцирующей питательной средой от оранжево-красного до розоватого цвета с pH 7,0-7,4.

Фармакотерапевтическая группа

Клетки человека

Код АТХ

V07A

Повышенная чувствительность к компонентам препарата повышенная бактериальная обсеменённость раны осложнённое течение болезни — декомпенсированное септическое со­стояние (полиорганная недостаточность более чем по 5 системам).

Работу с препаратом необходимо проводить в асептических условиях. До вскрытия флаконов (бутылок) обратить внимание на их целостность прозрачность и цветность пита­тельной среды.

  • В случае имеющихся трещин флакона (бутылки) помутнении препарата или не соответствия цветности питательной среды культуру клеток в работе не используют.
  • Рекомендуемая суточная доза — 05 млн клеток на 10 см2 раневой поверхности.
  • По усмотрению лечащего врача препарат можно применить повторно.
  • Возможно применение совместно с обезболивающими средствами и другими лекарственны­ми препаратами.

Для получения взвеси клеток флакон (бутылку) с препаратом обжигают спиртовым факелом вскрывают и сливают питательную среду в стерильную ёмкость/Затем во флакон (бутылку) наливают смесь равных количеств 002 %-ного раствора версена и 025 %-ного раствора трипсина до покрытия монослоя на 2-3 мин после чего жидкость сливают в ём­кость для отходов. Во флакон (бутылку) с клетками ёмкостью 10 50 100 250 мл наливают соответственно 1 5 10 25 мл питательной среды и тщательно встряхивают до образования — гомогенной взвеси. Полученную взвесь клеток немедленно стерильным шприцем (или дру­гим способом) наносят капельно на чистую раневую поверхность. В случае необходимости накладывают стерильную повязку с применением сетчатой прокладки типа Воскопран.

Побочные эффекты:

Не установлено.

  1. По 05 млн клеток во флаконах из стекла вместимостью 10 мл.
  2. По 25 млн клеток 50 млн клеток 110 млн клеток в бутылках стеклянных для крови транс- фузионных и инфузионных препаратов вместимостью 50100 и 250 мл соответственно.
  3. По 1 флакону (бутылке) в пачке из картона с Инструкцией по применению.

Условия хранения:

Препарат хранят и транспортируют при температуре от 5 до 25 °С в условиях исклю­чающих замораживание.

Срок годности:

7 суток с момента изготовления.

Культура клеток с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Условия отпуска

По рецепту

Производитель

Федеральное государственное учреждение науки «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» Роспотребнадзора, 620030, Свердловская обл., г. Екатеринбург, ул. Летняя, 23, Россия

Владелец регистрационного удостоверения/организация, принимающая претензии потребителей:

Федеральное государственное учреждение науки «Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций» Роспотребнадзора

Типы культуральных систем

  • ЛЕКЦИЯ
  • КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
  • Различают 3 основных типа культур животных клеток:
  • первичные культуры, получаемые практически из любого органа и существующие лишь до первого пересева;

-диплоидные культуры, чаще получаемые из эмбриональных тканей и сохраняющие до 50 пересевов диплоидный набор хромосом, которые затем трансформируются в..

  1. -постоянные (перевиваемые) гетероплоидные культуры, существующие вне организма десятки лет.
  2. Кроме того, культуры тканей могут подразделяться:
  3. — по виду животного, от которого они происходят;
  4. — по типу ткани-источника;
  5. — по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые),

— по способу выращивания (монослойные, суспензионные, на микроносителях и т. п.).

  • Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках.
  • Как правило, культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих взрослых тканей, но несмотря на ряд практических преимуществ, необходимо помнить, что эти клетки по некоторым параметрам отличаются от взрослых клеток.
  • Нормальные ткани, как правило, дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры клеток, полученных из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время.
  • Первичные культуры

Клетки полученные от животного и поддерживаемые в культуре, называют первичными до тех пор, пока они не будут пассированы (субкультивированы), т. е. до первого пересева.

Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются малым пролиферативным пулом, но в них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены и четко обнаруживается экспрессия ряда свойств, присущих данной ткани.

Однако первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro.

Поучение. Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной (0,01-0,05 – 0,25% трипсин, 200-2000 ед/мл коллагеназа) дезагрегации.

В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы.

Ферментативная дезагрегация дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию.

На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается.

Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Какое-то время эти клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10 месяцев клетки деградируют и погибают.

Это наблюдается примерно после 20-50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников первичных клеток – из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). На ранних стадиях клетки остаются эуплоидными, т. е. обладают правильным диплоидным набором хромосом, а позднее они становятся анеуплоидными.

В некоторых случаях отдельные из этих клеток выживают и продолжают размножаться, что приводит к установлению клеточного штамма. Частоту таких трансформаций можно увеличить, обработав клетки мутагенами или некоторыми вирусами.

При успешном установлении культуры первичные клетки начинают размножаться и их необходимо периодически пересевать (субкультивировать).

Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (получение линии клеток), возможность клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций.

Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.

Постоянные культуры

После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет (ограниченная линия клеток), либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией.

Различия в свойствах этих клеток и большой период времени, предшествующий их появлению (иногда несколько месяцев), позволяет предположить мутационную природу появления клеток постоянной культуры (стволовые клетки).

Нельзя исключить и возможность предсуществования «бессмертных» клеток, особенно в культурах, полученных из опухолей.

Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения), по увеличению скорости роста (время удвоения клеток снижается в 1,5-3 раза), по снижению зависимости от сыворотки и возможности поддержания в более простых средах, по снижению зависимости от субстрата и, следовательно, их способности к росту в суспензии; по увеличению гетероплоидности и анеуплоидности, а также по увеличению опухолеродности. Однако, нормальные клетки, спонтанно трансформируясь в постоянную линию, не становятся при этом злокачественными (несмотря на некоторые черты сходства).

Таким образом, постоянные клеточные линии имеют определенные преимущества: высокая скорость роста, возможность достижения более высокой плотности и, следовательно, более высокого выхода биомассы; возможность использования более дешевых сред; способность к суспензионному росту. Но также они имеют и недостатки – повышенная хромосомная нестабильность, отклонение от фенотипа донора, утрата специфических маркеров.

Необходимо отметить, что в литературе не имеется твердой точки зрения на употребление терминов «линия клеток» и «штамм клеток», в связи с чем многие авторы рассматривают их как взаимозаменяемые.

Другие исследователи определяют штамм клеток как популяцию клеток, полученную из первичной культуры путем пересева, а под линией клеток понимают клеточную популяцию, полученную из первичной культуры и выращиваемую неопределенно долгое время in vitro.

Типы культуральных систем

Непроточные культуры. Обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии.

По мере роста клеток в среде культивирования происходит исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов – следовательно, среда должна постоянно меняться, что, в свою очередь, приводит к изменению клеточного метаболизма (физиологической дифференцировке).

Системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий.

  1. Способы увеличения продолжительности жизни культур:
  2. а) прерывистый – часть культуры заменяется равным объемом свежей среды;
  3. б) постоянный – объем культуры постоянно увеличивается с низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются;
  4. в) перфузионный – постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной бесклеточной среды.

Проточные культуры. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток.

Это единственная система, в которой все клетки гомогенны и сохраняют гомогенность в течение длительно периода, что имеет очень важное значение в физиологических исследованиях.

Однако использование таких культур для получения клеточных продуктов невыгодно с экономической точки зрения. Системы, пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Монослойные культуры

Требования к поверхности субстрата.

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату – к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу – качественная нержавеющая сталь или титан.

Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика, обладающие высокой поверхностной энергией, несут отрицательные заряды.

Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами (наиболее изученным из которых является фибронектин, присутствующий в сыворотке и других физиологических жидкостях), а также присутствие двухвалентных катионов кальция и магния.

Суммарный отрицательный заряд поверхности субстрата (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп) может достигаться предварительным воздействием химическими (окисляющие агенты) и физическими факторами (высоковольтный разряд, облучение УФ), что облегчает электростатическое прикрепление клеток.

Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. К природным субстратам, на которых растут клетки, относятся коллаген и желатин. Для этих целей использую коммерческие препараты коллагена для культуры тканей (например, «Витроген 100»), что позволяет избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы, поверхностью до 200 кв. см) или пробирках для культуры тканей, обеспечивающих поверхность роста 5-200 кв. см.

Рост клеток в монослое. В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации

Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны.

Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях.

если их не пересеять, они погибают.

Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности.. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.

Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.

  • Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:
  • 1. выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;
  • 2. возможность быстрой и легкой замены питательной среды; возможность сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;
  • 3. обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;
  • 4. достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;

5. возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

  1. Однако при использовании монослойных культур выявляются и недостатки:
  2. 1. сложность масштабирования;
  3. 2. отсутствие информативности визуального анализа;
  4. 3. трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2 и обеспечением гомогенности культуры клеток;

4. необходимость значительных пространств.

Суспензионные культуры

Для наращивания клеточной массы удобнее использовать не монослойные, а суспензионные культуры. Как правило, клетки, отделившиеся от субстрата, на котором они росли, неспособны к росту в суспензии и быстро деградируют.

Но если некоторые клетки культивировать во вращающемся флаконе (2 об/мин), не дающем возможности прикрепления клеток к поверхности, в среде, содержащей метилцеллюлозу, предотвращающую агрегацию клеток, можно получить жизнеспособные суспензионные клеточные штаммы.

Иногда этого бывает достаточно для получения суспензионной культуры, но обычно требуются специальные сосуды для культивирования суспензий и использование среды с дефицитом ионов кальция и магния.

Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02% раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1% трипсином и 0,01% ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионные культуры лучше растут внутри ограниченного диапазона концентраций клеток и в том случае, когда сосуд наполнен средой наполовину. Для обеспечения этих условий необходимо каждый день, или – в случае медленно растущих культур – через день, удалять половину суспензии через боковое горлышко и добавлять равный объем свежей среды.

  • Некоторые клетки (трансформированные клетки, кроветворные клетки и асцитные опухоли) способны расти как на субстрате, так и в суспензии в зависимости от солевого состава среды культивирования.
  • Культуры лимфоцитов не обнаруживают тенденции к адгезии к поверхности стекла или пластика и выживают на дне культивационного сосуда под тонким слоем среды.
  • Суспензионное культивирование первичных и перевиваемых клеточных линий проводят в роллерных установках, где создаются благоприятные для клеток условия постоянного перемешивания жидкой и газовой фаз, общий объем среды при этом снижается вдвое сравнительно со стационарными условиями.
  • Суспензионное культивирование клеток также можно проводить в ферментерах, предназначенных для суспензионного культивирования микроорганизмов, в которых постоянное перемешивание клеток в среде осуществляется магнитными или механическими мешалками в колбах с высокой скоростью вращения, препятствующей прикрепление клеток к стенкам сосудов.

Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2-3-х кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector