1
Бугеро Н.В. 1
1 ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»
В статье представлены результаты анализа ПДФР ПЦР-продукта длиной 10.000 пар нуклеотидов, полученного при выделении ДНК простейших с применением эндонуклеаз рестрикции.
Экспериментальные данные показали, что использование рестриктаз BamH I, EcoR I, Pst I не позволяет выделять бластоцисты с различной степенью выраженности вирулентных свойств. Однако использование рестриктазы Hae III позволяет проводить дифференциацию авирулентных и вирулентных бластоцист на основе отсутствия или наличия фрагментов ДНК размером от 1500 до 10000 п.н.
При помощи рестриктазы Pst I произведено типирование бластоцист с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 1000 п.н. Применение рестриктазы Hind III позволило выделить Blastocystis spp. со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК размером 700 п.н.
, а также высоковирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК размероv 380 и 600 п.н.
рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)ПДРФ (полиморфизм длин фрагментов рестрикции)
1. Лобзин Ю.В., Макарова В.Г., Корвякова Е.Р. Дисбактериоз кишечника – СПб.: Фолиант, 2009. – 245 c. 2.
Изучение этиопатогенетической роли Blastocystis hominis в патологии желудочно-кишечного тракта / Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, Н.М. Чебан, Н.А. Ильина // С.-Петербург. Гастро-2000: материалы 2-й объединенной Всероссийской и Всеармейской научной конференции. СПб., 2000. – № 1-2. – С. 194. 3. Торопова Н.Т., Сафронова Н.А., Гордеева Л.М.
Паразитарная фауна кишечника у детей, страдающих атопическим дерматитом. Аспекты диагностики патогенеза // Российский журнал кожных и венерических болезней. – 1998. – № 2. – С. 27–32. 4. Babb R.R. Blastocystis hominis a potential intestinal pathogen / R.R. Babb., S. Wagener // Western Journal of Medicine. – 1989. – Vol. 151. – P. 518–519. 5. Bentley R.W., Leigh J.A.
, Collins M.D. // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1991. – Vol. 41. – P. 487–494. 6. Garnier F., Gerbaud G., Courvalin P., Galimand M. // J. Clin. Microbiol. – 1997. – V. 35. – P. 2337–2341. 7. Guignard S., Arienti H., Freyre L., Lujan H., Rubinstein H., Frasi M. Prevalence of enteroparasites in a residence for children in the Córdoba province, Argentina / S. Guignard, H. Arienti, L.
Freyre, H. Lujan // European Journal of Epidemiology. – 2000. – Vol. 16. – P. 287–293. 8. Poyard C., Quesne G., Coulon S., Berche P., Trieu-Cuot P. // J. Clin. Microbiol. –1998. – Vol. 36. – P. 41–47. 9. Taamasri P., Mungthin M., Rangsin R. Transmission of intestinal blastocystosis related to the quality of drinking water / P. Taamasri, M. Mungthin, R.
Rangsin // Southeast Asian Journal Tropical Medicine and Public Health. – 2000. – Vol. 31. – P. 112–117.
Молекулярно-генетичекие методы в микробиологии применяются сравнительно недавно, однако в настоящее время они занимают ведущие позиции при индикации и идентификации бактерий и вирусов [4–6].
Среди генетических методов очень важным является рестрикционный анализ бактериальной ДНК, который широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК [6, 7].
Как правило, продукты расщепления ДНК анализируются с помощью гель-электрофореза в агарозном или акриламидном геле, а полученная таким образом картина разделения фрагментов ДНК в виде определенного, отличающегося для разных ферментов, набора полос и является результатом рестрикционного анализа той или иной ДНК [1].
Большое разнообразие существующих эндонуклеаз рестрикции (ЭР) позволяет проводить расщепление ДНК по более чем 150 сайтам узнавания [7, 6, 9].
Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз), расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать специфические маркеры на основе фрагментарного анализа ДНК.
Отличительной особенностью этого метода является возможность построения молекулярно-генетических карт микроорганизмов, что при высокой степени воспроизводимости может быть использовано при видовой идентификации.
В последние годы в России официально регистрируется более 1,2 миллиона больных различными паразитоценозами, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами [1, 2, 5].
Ситуация усугубляется тем, что помимо классических паразитарных болезней появляются новые паразитозы, в частности бластоцистоз, обусловленный паразитированием в толстом кишечнике простейших Blastocystis spp.
Для определения этиологической значимости бластоцист в развитии инфекции проводят изучение вирулентности простейших [2, 4, 8].
До настоящего времени изучение вирулентности Blastocystis spp. проводили биологическими методами исследования, которые позволяют оценить только потенциальную роль простейших в развитии инфекции [3, 10].
Было бы интересным произвести определение степени вирулентности простейших Blastocystis spp. с применением метода, основанного на анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ДНК простейших.
В связи с этим целью нашей работы являлось изучение возможности использования данного метода для типирования вирулентных и авирулентных форм бластоцист.
Материалы и методы исследования
Для проведения рестрикционного анализа необходимо было получить максимальное количество бактериальной ДНК, что определяет сама специфика метода, поэтому при проведении экспериментов нами были использованы различные методы выделения ДНК: термический метод клеточной денатурации, сорбентный метод с использованием в качестве носителя силикагеля, фенольно-хлороформная экстракция. В итоге было определено, что наибольший выход ДНК наблюдался при использовании фенольно-хлороформной методики выделения [5].
Выделение ДНК проводили согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения ДНК, утвержденной приказом Росздравнадзора от 30 июня 2008 г. № 5008-Пр/08, регистрационное удостоверение МЗ СР РФ № ФСР 2008/02938.
Фенольно-хлороформная экстракция для выделения ДНК бластоцист осуществлялась с применением наборов «ВекторДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцево Новосибирской области).
В эксперименте использовали чистые культуры бластоцист, выращенные на среде Surech. Для установления оптимального срока обработки исследуемого материала было проведено выделение ДНК через сутки после хранения при t = –20 °С.
В работе были использованы рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы): EcoR I, BamH I, Hae III, Hind III, Pst I, производство НПО «СибЭнзим», г. Новосибирск (info@sibenzyme.ru), в соответствующем буфере. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп раствора, содержащего 0,1 М ЭДТА, 0,05 % бромфенолового синего и 40 % сахарозы.
Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции амплифицированной ДНК проводили в 2 % агарозе (Sigma) в трис-ацетатном буфере с этидий бромидом (0,5 мг/л) при 120 V в течение 4 ч. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярного веса ДНК (100bp + 1,5 Kb ДНК маркеры, НПО «СибЭнзим»).
Определение длин полученных рестриктов осуществляли с помощью компьютерной программы Gel Pro Analyzer, версия 4.0.00.001. Процент идентичности длин фрагментов рассчитывали для каждой пары микроорганизмов, сравнивая картины рестрикции отдельно по каждой рестриктазе.
При сравнении длин рестриктов идентичными считали фрагменты ДНК, длина которых различалась не более чем на 5 %.
Статистическую обработку данных проводили при помощи программы «Statistica for Windows».
Результаты исследования и их обсуждения
В результате проведенных экспериментов с использованием различных рестриктаз на экстрагированной ДНК авирулентных, слабовирулентных, умеренно-вирулентных и высоко-вирулентных штаммах бластоцист, выделенных из клинического материала больных, установили, что при использовании рестриктазы BamH I – G▼ˉ GATCC/CCTAG ▲ˉG на дорожках 1 % агарозного геля наблюдались полосы, окрашенные бромистым этидием, ДНК размером около 10 000 п.н. (рис. 1). Коротких фрагментов хромосомной ДНК бластоцист размером 100–10 000 п.н. в ходе эксперимента мы не наблюдали.
Сайт узнавания рестриктазы Hae III – GG▼ˉCC/CC▲GG представлен на рис. 2.
При проведении реакции с экстрагированной тотальной ДНК бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности нами были получены следующие результаты: на дорожках агарозного геля после электрофореза у авирулентных бластоцист ясно выражены фрагменты ДНК размером около 850 и 10 000 п.н.; в остальных дорожках ДНК бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности кроме этих фрагментов наблюдались полосы с размерами от 1500 до 10 000 п.н.
Рис. 1. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы BamH I. Штаммы бластоцист: 1, 2 – авирулентные, 3, 4 – слабо-вирулентные, 5, 6 – умеренно-вирулентные, 7, 8 – высоко-вирулентные. М2-маркер молекулярного веса – 300–10000 п.н.
Рис. 2. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Hae III. Штаммы бластоцист: 1, 2 – авирулентные; 3, 4 – слабо-вирулентные; 5, 6 – умеренно-вирулентные; 7, 8 – высоко-вирулентные. М1-маркер молекулярного веса – 100–1000 п.н., М2-маркер молекулярного веса – 300–10000 п.н.
Рис. 3. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Hind III. Штаммы бластоцист: 1, 2 – авирулентные; 3, 4 – слабо-вирулентные; 5, 6 – умеренно-вирулентные; 7, 8 – высоко-вирулентные. М1-маркер молекулярного веса – 100–1000 п.н., М2-маркер молекулярного веса – 300–10000 п.н.
Рис. 4. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы Pst I. Штаммы бластоцист: 1, 2 – авирулентные; 3, 4 – слабо-вирулентные; 5, 6 – умеренно-вирулентные; 7, 8 – высоко-вирулентные. М2-маркер молекулярного веса – 300–10000 п.н.
Рис. 5. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ДНК штаммов бластоцист с использованием рестриктазы EcoR I. Штаммы бластоцист: 1–4 – авирулентные; 5–8 – слабо-вирулентные; 9–12 – умеренно-вирулентные; 13–16 – высоко-вирулентные. М1-маркер молекулярного веса – 100–1000 п.н., М2-маркер молекулярного веса – 300–10000 п.н.
Следовательно, данная рестриктаза позволяет дифференцировать авирулентные и вирулентные штаммы бластоцист без выявления выраженности вирулентных свойств.
При использовании рестриктазы Hind III – A▼ˉAGCTT/TTCGA▲A на дорожках 1 % агарозного геля наблюдались полосы размером от 10 000 и более п.н., окрашенные бромистым этидием (рис. 3).
Кроме этого, на дорожках ДНК слабовирулентных штаммов бластоцист наблюдалась полоса размером 700 п.н.; на дорожках агарозы ДНК высовирулентных штаммов бластоцист выявлялись две полосы 380 и 600 п.н.
Следовательно, рестриктаза Hind III позволяет выявить слабо- и высоковирулентные простейшие.
При проведении экспериментов рестрицирования (расщепления с помощью эндонуклеаз) выделенной ДНК штаммов бластоцист рестриктазы Pst I – CTGCA▼ˉG/G▲ˉACGTC нами были получены следующие результаты: на дорожках агарозного геля штаммов бластоцист с различной степенью выраженности вирулентности наблюдались яркие размытые полосы (шмеры) размером от 2000 до 10 000 (на отдельных дорожках и более) п.н. (рис. 4). Однако на дорожках хромосомной ДНК умеренно-вирулентных бластоцист наблюдали фрагменты размером около 900 п.н. У других штаммов бластоцист таких полос не обнаруживалось. Таким образом, рестриктаза Pst I позволила выявить только умеренно-вирулентные штаммы Blastocystis spp.
При использовании рестриктазы EcoR I с сайтом узнавания G▼ˉAATTC/CTTAA▲ˉG на дорожках 1 % агарозного геля штаммов бластоцист с различной степнью выраженности вирулентности наблюдали полосы шмер по всей длине дорожек, свидетельстующие о множественных фрагментах ДНК различной длины, перекрывающих друг друга (рис. 5). Таким образом, можно сделать заключение о наличии в структуре ДНК всех штаммов бластоцист множественных сайтов GAATTC/CTTAAG, что свидетельствует о невозможности выявления степени вирулентность бластоцист при помощи рестриктазы EcoR I.
Величина фрагментов ДНК бластоцист с различной степенью проявления вирулентности (п.н.)
| Штаммы бластоцист | Величина фрагментов ДНК при действии рестриктаз | ||||
| BamH I | Hae III | Hind III | Pst I | EcoR I | |
| Авирулентные | 10 000 | 850, 10 000 | 10 000 и более | от 2000 до 10 000 | Сплошной шмер |
| Слабовирулентные | 10 000 | от 550 до 10 000 | 700, 10 000 и более | от 2000 до 10 000 | Сплошной шмер |
| Умеренновирулентные | 10 000 | от 550 до 10 000 | 10 000 и более | от 2000 до 10 000, 900 | Сплошной шмер |
| Высоковирулентные | 10 000 | от 550 до 10 000 | 380, 600, 10 000 и более | от 2000 до 10 000 | Сплошной шмер |
В таблице представлены результаты определения вирулентности штаммов бластоцист, полученных методом рестрикционного анализа ДНК простейших с использованием рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз): EcoR I, BamH I, Hae III, Hind III, Pst I.
В работе предложен метод определения вирулентности Blastocystis spp., основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ПЦР-продукта длиной 10 000 пар нуклеотидов, полученного при выделении ДНК простейших с применением пяти эндонуклеаз рестрикции EcoR I, BamH I, Hae III, Hind III, Pst I.
Заключение
Таким образом, рестрикционный анализ показал, что использование рестриктаз BamH I, EcoR I, Pst I не позволяет типировать бластоцисты с различной степенью выраженности вирулентности.
Использование рестриктазы Hae III позволяет проводить дифференциацию авирулентных и вирулентных бластоцист на основе отсутствия или наличия фрагментов ДНК размером от 1500 до 10000 п.н.
При помощи рестриктазы Pst I произведено типирование бластоцист с умеренно выраженной вирулентностью на основе наличия фрагментов ДНК размером около 1000 п.н.
В эксперименте с применением рестриктазы Hind III, было произведено типирование бластоцист со слабовыраженной вирулентностью на основе фрагментов ДНК размером 700 п.н., а также высоко-вирулентных штаммов бластоцист на основе наличия фрагментов ДНК размером 380 и 600 п.н.
Полученные результаты показывают, что предложенная комбинация эндонуклеаз рестрикции (Hae III, Pst I и Hind III) для определения вирулентности Blastocystis spp.
может служить достаточно простым и универсальным способом идентификации простейших в зависимости от степени выраженности вирулентных свойств.
Кроме того, метод рестрикционного анализа гораздо более чувствителен и позволяет изучить не только потенциально патогенные штаммы бластоцист, которые выявляются биологическими методами исследования, но и выявить весь спектр генов в геноме бластоцист, обладающих свойствами патогенности.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№ 14.B37.21.2010).
Библиографическая ссылка
Изменение вирулентности
Вирулентность
микробов не является постоянной.
Изменение вирулентности может быть
фенотипическим и генотипическим.
Так,
вирулентность фенотипически может
изменяться в зависимости от возраста
культуры, температуры выращивания, что
связано с индуктивным характером синтеза
некоторых биологически активных веществ
(температурозависимый синтез ряда
антигенов чумных палочек, Vi-антигена
брюшнотифозных бактерий, некоторых
ферментов).
Вирулентность
микроорганизма можно повысить или
понизить искусственными приемами.
Длительное
выращивание культур вне организма на
обычных питательных средах, выращивание
культур при максимальной температуре
(опыты Л. Пастера и Л. С.
Ценковского),
добавление к культурам антисептических
веществ (двухромовокислый калий,
карболовая кислота, щелочь, сулема,
желчь и т. д.) ослабляют вирулентность
микроорганизмов.
Основываясь
на этом принципе, готовят ослабленные
живые вакцины, которые затем применяют
против заразных болезней. Вирулентность
микроба может понижаться и в естественных
условиях под действием солнечных лучей,
высушивания и пр.
Пассирование
(последовательное проведение) возбудителя
какой-либо инфекционной болезни через
определенный вид животного от зараженного
к здоровому, например возбудителя рожи
свиней через организм кролика, ослабляет
вирулентность для свиней, но усиливает
ее для самих кроликов.
Действие
бактериофага (биологический фактор)
может привести к ослаблению вирулентности
микроорганизмов.
В
естественных условиях вирулентность
бактерий повышается путем пассажа через
восприимчивый организм, поэтому больных
заразной болезнью животных необходимо
немедленно изолировать от здоровых.
Усиление
вирулентности под действием протеолитических
ферментов можно наблюдать у Сl.perfringens
при естественной ассоциации с возбудителями
гниения (например, сарцинами) или при
искусственном воздействии ферментом
животного происхождения (например,
трипсином).
Связан
этот эффект со способностью протеаз
активизировать протоксины, т. е.
предшественники эпсилон-токсина типов
В и D
и йота-токсина типа Е Cl.
perfringens.
Таким
образом, вирулентность как мера
патогенности – величина переменная.
Она может быть повышена, понижена и даже
утеряна.
Стабильная
утрата патогенных свойств определяется
понятием «авирулентность».
Снижение (аттенуация) или полная потеря
вирулентности наблюдается при пересевах
культур в лабораторных условиях и при
воздействии различных физико-химических
и биологических факторов. Полная утрата
вирулентности, как и аттенуация, связана
с изменением генотипа штамма.
Генетические
факторы, детерминирующие вирулентность,
изучены пока лишь у некоторых патогенных
микроорганизмов. Хромосомное картирование
таких факторов и знание маркеров,
коррелирующих с вирулентностью позволит
в будущем в короткие сроки получать
штаммы с нужными для микробиологов
характеристиками.
Измерение вирулентности
Патогенность
и вирулентность не являются синонимами.
Микроорганизм считается вирулентным,
если он при внедрении в организм
животного, даже в исключительно малых
дозах, приводит к развитию инфекционного
процесса.
Никто не сомневается в
патогенности сибиреязвенной бациллы,
между тем среди культур этого микроба
изредка, но встречаются авирулентные
штаммы, не способные вызвать заболевания
у овец и даже кроликов.
Бактерии рожи
свиней принадлежат к патогенному виду,
но немало разновидностей этого микроба
было выделено из организма совершенно
здоровых свиней, индеек, рыб.
За
единицу измерения вирулентности
условно приняты летальная и инфицирующая
дозы. Минимальная смертельная доза
— DLM
(Dosis
letalis
minima)
– это наименьшее количество живых
микробов или их токсинов, вызывающее
за определенный срок гибель большинства
взятых в опыт животных определенного
вида.
Но поскольку индивидуальная
чувствительность животных к патогенному
микробу (токсину) различна, то была
введена безусловно смертельная доза —
DCL
(Dosis
certa
letalis),
вызывающая гибель 100 % зараженных
животных. Наиболее точной является
средняя летальная доза – LD50,
т. е.
наименьшая доза микробов (токсинов),
убивающая половину животных в опыте.
Для установления летальной дозы следует
принимать во внимание способ введения
возбудителя, а также массу и возраст
подопытных животных, например, белые
мыши 16-18 г, морские свинки – 350 г,
кролики – 2 кг. Таким же образом определяют
инфицирующую дозу (ID),
т.
е. количество микробов или их токсинов,
которое вызывает соответствующую
инфекционную болезнь.
Высоковирулентные
микроорганизмы способны вызвать
заболевание животных или человека
в самых малых дозах. Так, например,
известно, что 2-3 микобактерии туберкулеза
при введении в трахею вызывают у морской
свинки туберкулез со смертельным
исходом. Вирулентные штаммы сибиреязвенной
бациллы в количестве 1-2 клеток могут
вызвать смерть у морской свинки, белой
мыши и даже крупного животного.
Генетический контроль вирулентности и тoксинooбразования
Как уже отмечалось, вирулентность обусловлена разными факторами, которые проявляются в адгезии, колонизации, пенетрации, инвазии и подавлении неспецифической и иммунной защиты организма хозяина.
Все упомянутые признаки находятся под контролем хромосомных и плазмидных генов. Так, образование пилей общего типа, участвующих в адгезии, контролируется хромосомными генами.
В то же время адгезия, колонизация и некоторые антигены у эшерихии контролируются плазмидами CFA/I, CFA/II, CFA/III.
Образование биологически активных веществ, участвующих в пенетрации, также контролируется плазмидами (например, у шигелл Зонне и других бактерий), а ферментов гиалуронидазы и нейраминидазы, участвующих в инвазии, — хромосомными генами.
Синтез антифагоцитарных и антикомплементарных веществ, например протеина А золотистого стафилококка, М-протеина пиогенного стрептококка, капсульного полисахарида пневмококка, контролируют главным образом хромосомные гены.
В R-плазмидах бактерий содержатся транспозоны, контролирующие не только множественную устойчивость к разным антибиотикам, но и их токсичность. Трансмиссивность плазмид приводит к распространению упомянутых признаков среди бактериальных клеток собственной и соседних популяций.
Генетический контроль токсинообразования осуществляется хромосомными генами или разнообразными плазмидами: F, R, Col и др., содержащими tox-транспозоны, а также конвертирующими бактериофагами.
Хромосомные tox-гены контролируют образование холерогена, эксфолиатина золотистого стафилококка, энтеротоксина Clostridium perfringens и др. В составе хромосомы лизогенных культур, несущих профаг, обнаружены tox-гены, контролирующие образование дифтерийного гистотоксина, скарлатинозного эритрогенного токсина, ботулинического нейротоксина.
В некоторых плазмидах, находящихся в автономном, независимом от хромосомы состоянии, содержатся toe-гены, ответственные за образование термолабильного энтеротоксина кишечной палочки и других токсинов. Многие tox-плазмиды контролируют образование не самих токсинов, а протоксинов, требующих для своей активации дополнительного компонента.
Этим активирующим компонентом являются протеазы, образование которых находится под контролем хромосомных генов. Протеазы участвуют в активации многих протоксинов, например дифтерийного гистотоксина, ботулинического нейротоксина и др.
Таким образом, осуществляется совместный контроль плазмидными и хромосомными генами за образованием функционально активных токсинов.
Вирулентность и токсинообразование — непременные атрибуты патогенности можно рассматривать как проявление селективных преимуществ бактериальных клеток в организме хозяина. Плазмиды, обеспечивающие распространение соответствующих признаков среди клеток бактериальной популяции, способствуют ее выживаемости in vivo.
Это свидетельствует о том, что генетическая информация, содержащаяся в плазмидах и транспозонах, важна для клеток популяции только в данных конкретных условиях ее существования.
Изменение этих условий, например при попадании бактерий из организма больного в окружающую среду или невосприимчивый организм, лишает их данных преимуществ, что может отразиться на выживаемости популяции в целом в новых условиях существования.
Изменчивость вирулентности, так же как любого другого признака, может носить фенотипический и геноти-пический характер.
В первом случае ослабление вирулентности является нестойким явлением, которое может быть связано in vitro с неблагоприятными условиями культивирования бактерий или составом питательных сред. Ослабление вирулентности происходит при обработке бактериальной популяции гомологичной иммунной сывороткой.
Однако в условиях организма механизм действия может быть связан не с изменением вирулентности бактерий, а с селекцией устойчивых маловирулентных клеток, предсуществующих в гетерогенной бактериальной популяции.
При последующем культивировании восстановления вирулентности полученной бактериальной культуры может не произойти если все вирулентные особи были нейтрализованы гомологичной антисывороткой.
Аналогичным образом происходит селекция авирулентных мутантов при воздействии на бактериальную популяцию соответствующих активных факторов. Так, например, авирулентный штамм БЦЖ был селекционирован при многократных пересевах в течение многих лет шрулентной культуры микобактерий туберкулеза на картофельно-глицериновой среде с бычьей желчью.
Методы ослабления вирулентности патогенных микроорганизмов имеют большое практическое значение для получения вакцинных етаммов, т.е. таких авирулентных микробных культур, из которых эолучают живые вакцины для специфической профилактики инфекционных заболеваний.
Повышение вирулентности достигается путем культивирования бактерий in vitro в оптимальных условиях или при многократных пассажах маловирулентной культуры через организм чувствительного лабораторного животного. В данном случае также имеет место селекция вирулентных особей, содержащихся в гетерогенной бактериальной популяции, что в конечном итоге может привести к повышению ее вирулентности.
Генотипические изменения патогенных микроорганизмов имеют место при мутациях, рекомбинациях, а также миграции внехромосом-ных факторов наследственности (Is-элементы, транспозоны, плазмиды), контролирующих вирулентность и токсинообразование
Генетический контроль патогенности и вирулентности
Все вышеназванные факторы и параметры патогенности и вирулентности подвержены фенотипическим и генотипическим изменениям. Причины таких изменений — эффектыразличных физических и химических факторов.
В первую очередь патогенные свойства бактерии находятся под контролем хромосомных и плазмидийных генов.
Способность к образованию экзотоксинов детерминируют внехромосомные tox-гены конвертирующих бактериофагов и плазмид (например, синтез дифтерийного гистотоксина, ботулинического нейротоксина и др.). Образование эндотоксинов кодируют хромосомные гены.
Генотипическое снижение вирулентностивозможнопри мутациях, рекомбинациях, утере внехромосомных наследственных факторов (плазмид, транспозонов, вставочных (IS-) последовательностей).
Фенотипическое снижение вирулентностивозможно при попадании возбудителя в неблагоприятные условия. In vitro оно возникает в результате неблагоприятного режима культивирования и состава питательной среды, воздействия селективных неблагоприятных факторов либо обработки популяции гомологичной антисывороткой.
In vivo снижение вирулентности возникает вследствие селекции маловирулентных штаммов в гетерогенной популяции возбудителя под действием защитных факторов, антимикробных препаратов и др.
Выжившая популяция приобретает устойчивость к этим воздействиям, но «платит» своими патогенными свойствами (например, за счёт утери плазмидных или хромосомных генов патогенности).
…
Со времён Пастёра искусственное снижение вирулентности — аттенуация [от лат. attenuo, ослаблять] — положено в основу производства ряда вакцин. Таким образом, патогенность — качественный, признак болезнетворного микроба, а вирулентность — количественное проявление патогенности.
- Основные факторы патогенности
- К основным факторам патогенности (вирулентности) относят способность микроорганизмов к колонизации, их устойчивость к разным микробицидным факторам организма, свойства инвазивности и токсигенности, а также способность к длительному персистированию.
- Способность к колонизации
- Адгезия
Размножению бактерий в первичном очаге инфицирования предшествует адгезия [от лат. adhaesio, прикрепляться к чему-либо], то есть закрепление бактерий на поверхности клеток, что, собственно, и служит началом инфекционного процесса.
Прикрепление к поверхности клеток (например, к эпителию слизистых оболочек) обеспечивают адгезины, или факторы колонизации— различные микробные продукты — молекулы адгезии (белки, ЛПС, липо-тейхоевые кислоты).
Молекулы адгезии могут располагаться непосредственно на поверхности бактериальной клетки либо входить в состав микроворсинок или капсул. Взаимодействие инфекционного агента с эпителиальными клетками происходит в результате нескольких типов связей, различных по природе и специфичности.
Выделяют связи, основанные на взаимодействии электростатических сил, обусловленные гидрофобными свойствами поверхности, лиганд-рецепторные взаимодействия.
Заряд. Бактериальные и эукариотических клетки заряжены отрицательно, но поверхностные микроворсинки грамотрицательных бактерий снижают заряд бактерий и уменьшают электростатические силы отталкивания.
Гидрофобность. Бескапсульные бактерии обладают высокой гидрофобностью, усиливающей адгезивность; гидрофобные участки обладают сродством к лигандам на поверхности эукариотических клеток, что и приводит к прочности связи.
Специфические взаимодействия.На поверхности бактерий имеются молекулы, способные к стереоспецифичному связыванию с комплементарными молекулами на мембранах эукариотических клеток (например, гемагглютининыили тейхоевые кислоты).
Другие механизмы колонизации.Некоторые бактерии способны «заранее подготавливать» место для дальнейшего размножения; например, нейраминидаза облегчает проникновение холерного вибриона через слой слизи и контакт с сиалосодержащими рецепторами эпителия кишечника.
Микроорганизмы также способны сорбироваться на бактериях, уже колонизировавших поверхность слизистых оболочек, либо связывать белки (например, фибронектин), рецепторы к которому имеются на многих клетках макроорганизма.
У капсулированных бактерий в прикреплении активно участвуют полисахариды капсулы.
Для успешной колонизации очага первичного инфицирования бактерии должны выдержать действие многочисленных и разнообразных микробицидных факторов хозяина. Для защиты от них микроорганизмы активно используют ряд структур (например, капсулы) и синтезируемых веществ (например, ферменты).
Капсула
Капсула (или её менее выраженный аналог — слизистый слой) ингибирует начальные этапы защитных реакций — распознавание и поглощение.
• Капсулы «экранируют» бактериальные структуры, активирующие систему комплемента, а также структуры, распознаваемые иммунокомпетентными клетками. Например, слой капсульного вещества защищает тейхоевые кислоты стафилококков от связывания опсонинами.
• Гидрофильность капсул затрудняет их поглощение фагоцитами, а само капсульное вещество защищает бактерию от действия лизосомальных ферментов и токсичных оксидантов, выделяемых фагоцитирующими клетками.
• Большое значение имеет лёгкая отделяемость капсул или слизистого слоя от поверхности бактерий. В частности, при поглощении капсулированных бактерий (например, синегнойной палочки), последние легко «снимают с себя» капсулы и избегают прямого контакта с фагоцитом.
Инактивирующие ферменты
Микроорганизмы синтезируют различные ферменты, обезвреживающие многие гуморальные защитные факторы. Например, многие возбудители, особенно паразитирующие на слизистых оболочках, выделяют протеазы, расщепляющие в том числе и молекулы IgA.
В инактивировании токсических кислородных продуктов фагоцитов задействованы каталазаи супероксид-дисмутаза. Бактериальные ферменты также способны изменять рН окружающей среды, делая её пригодной для размножения.
Например, Helicobacter pylori выделяет уреазу, нейтрализующую кислую среду в желудке.
Инвазивность
Патогенность многих микроорганизмов (например, шигелл) связана с проникновением в эпителиальные клетки, где они размножаются, вызывая нарушение целостности пласта эпителия.
Основные факторы, обеспечивающие инвазивность бактерий, — подвижность(обеспечивает проникновение как в клетки, так и межклеточные пространства) и особые клеточные факторы — инвазины[от лат.
invasio, проникать, атаковать], способствующие проникновению в эпителиоциты посредством эндоцитоза (например, поверхностные белки грамотрицательных бактерий).
Некоторые микроорганизмы проникают за пределы эпителия либо посредством активной инвазии, либо в результате имплантации через различные повреждения кожных покровов. Как разновидность инвазии можно рассматривать способность микроорганизмов диссеминировать из первичного очага инфекции и циркулировать в крови.
Токсигенность
Токсины
Токсины [от трем, toxikon, яд] — важнейшие факторы патогенности, вырабатываемые микроорганизмами и реализующие основные механизмы инфекционного процесса.
Роль микробных токсинов в патогенезе инфекционных болезней впервые доказали Э. Ру и А.
Иерсён (1888), отделившие «ядовитое начало» возбудителя дифтерии от бактериальных клеток и сумевшие воспроизвести с его помощью клиническую картину болезни у морских свинок.
Токсины облегчают первичную колонизацию и вызывают системные поражения, характеризующие специфические проявления той или иной инфекционной болезни. Некоторые токсины не ведут к развитию клинической картины, но вносят вклад в патогенез заболевания (так называемые парциальные токсины).
Спектр активности токсинов необычайно широк: от веществ, облегчающих распространение по тканям, до метаболитов, селективно повреждающих активность определённых клеток. Бактериальные токсины традиционно подразделяют на эндотоксиныи экзотоксины(их основные характеристики представлены в табл.
8-1), хотя подобная классификация не совсем корректна. Более правильной была бы систематизация токсинов по химическому составу (например, фосфолипазы или детергенты) либо по механизму действия, например, на поражающие клеточную мембрану (цитолизины) и действующие на различные внутриклеточные мишени.
К сожалению, химический состав значительной части токсинов и комплекс оказываемых ими биологических эффектов изучены недостаточно. Многие бактериальные токсины вырабатываются в форме предшественников (протоксины), трансформирующихся в активную форму.
За единицу измерения биологической активности токсинов, как и вирулентности микроорганизмов, принята величина летальной дозы.
Экзотоксины
Экзотоксины (табл. 8-2)— секреторные белковые вещества, обычно проявляющие ферментативную активность.
Нередко экзотоксины служат единственным фактором вирулентности микроорганизма, действуют дистанционно (далеко за пределами очага инфицирования) и ответственны за клинические проявления инфекции (например, энтеротоксины вызывают диарею, нейротоксины — параличи и другие неврологические симптомы).
Наибольшую токсичность проявляет ботулотоксин — 6 кг токсина могли бы убить всё человечество. Высокая токсичность экзотоксинов обусловлена особенностью структуры их фрагментов, имитирующей строение субъединиц гормонов, ферментов или нейромедиаторов хозяина.
В результате экзотоксины проявляют свойства антиметаболитов, блокируя функциональную активность естественных аналогов. Экзотоксины проявляют высокую иммуногенностъ, в ответ на их введение образуются специфические нейтрализующие AT (антитоксины). По степени связи с бактериальной клеткой экзотоксины разделяют на три группы — А, В и С.
Группа А — токсины, секретируемые во внешнюю среду (например, токсин дифтерийной палочки).
Таблица 8-1.Характеристика бактериальных токсинов
| Экзотоксины | Эндотоксины | |
| Продуцент | Грамположительные и грамотрицательные бактерии | Грамотрицательные бактерии |
| Локализация | Внутри- и внеклеточная | Внутриклеточная |
| Химическая природа | пептиды | Комплексы «белок-ЛПС» |
| Стабильность при 1000С | Лабильны | Стабильны |
| Инактивация формальдегидом | Инактивируются | Не инактивируются |
| Нейтрализация гомологичными АТ | Полная | Частичная |
| Биологическая активность | Индивидуальная для каждого токсина | Общая для все токсинов |
| Токсичность | 100-1 000 000 | 0,1 |
- Группа В — токсины, частично секретируемые во внешнюю среду и частично ассоциированные с бактериальной клеткой (например, тетаноспазмин столбнячной палочки).
- Группа С — токсины, связанные с бактериальной клеткой и высвобождающиеся после её гибели (например, экзотоксины энтеробактерий).
- Свойства экзотоксинов
• Экзотоксины обычно содержат бифункциональные (лигандныс и эффскторные) структуры. Первые распознают и связывают комплементарный рецептор (ганглиозиды, белки, гликопротеиды) на мембране клетки, вторые обеспечивают эффекторное действие, наиболее часто — гидролиз НАД до АДФ-рибозы и никотинамида с последующим переносом АДФ-рибозильного остатка на мишени.
• Связывание и проникновение экзотоксинов в определённой степени напоминает механизм действия пептидных и гликопротеиновых гормонов, что обусловлено родством их молекулярных структур.
Внутриклеточная мишень для эффекторной части молекулы токсина — обычно жизненно важная система, например биосинтеза белка (для А-токсина синегнойной палочки и шигелл) либо адснилатциклазная система (для холерогена, термолабилыюго токсина кишечной палочки или экзотоксина Bordetella pertussis).
• Наиболее распространённая классификация экзотоксинов основана на характере мишеней для их эффектов: нейротоксиныпоражают клетки нервной ткани, гемолизиныразрушают эритроциты, энтеротоксиныпоражают эпителий тонкого кишечника, дерматонекро-токсинывызывают некротические поражения кожных покровов, лейкоцидиныповреждают фагоциты (лейкоциты) и т.д.
• По механизму действия выделяют цитотоксины(например, энтеротоксины или дерматонекротоксины), мембранотоксины(например, гемолизины и лейкоцидины), функциональные блокаторы(например, холероген), эксфолиатиныи эритрогенины. Нередко патогенные бактерии синтезируют несколько экзотоксинов, проявляющих различное действие (летальное, гемолитическое, цитотоксическое и т.д.).
Эндотоксины
В определённой степени токсигенным микроорганизмам (активно секретирующими токсины) противопоставлены патогенные бактерии, обладающие токсическими субстанциями, слабо диффундирующими в окружающую среду и названные (по предложению Р. Пфайффера) эндотоксинами.
Эндотоксины — интегральные компоненты клеточной стенки грамотрицателъных бактерий; большая их часть высвобождается только после гибели бактериальной клетки. Представлены комплексомпротеинов, липидных и полисахаридных остатков.
За проявление биологического эффекта ответственны все группировки молекулы эндотоксина. Биологическая активность напоминает таковую у некоторых медиаторов воспаления; эндотоксинемия обычно сопровождается лихорадкой, обусловленной выбросом эндогенных пирогенов из гранулоцитов и моноцитов.
При попадании значительного количества эндотоксина в кровоток возможен эндотоксиновый шок, обычно заканчивающийся смертью больного. Бактериальные эндотоксины проявляют сравнительно слабое иммуногенное действие, и иммунные сыворотки не способны полностью блокировать их токсические эффекты.
Некоторые бактерии могут одновременно синтезировать экзотоксины и выделять (при гибели) эндотоксины (например, токсигенные Escherichia coli и холерные вибрионы).
Экзоферменты
Важными факторами патогенности следует считать экзоферменты (например, лецитиназа, гиалуронидаза, коллагеназа и др.), нарушающие гомеостаз клеток и тканей, что приводит к их повреждению.
Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий — возможность проникать через слизистые оболочки, соединительнотканные и другие барьеры.
Например, гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость различных тканей.
Этот фермент синтезируют бактерии родов Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus и др, Нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточных пространствах. Нейраминидазу секретируют холерные вибрионы, дифтерийная палочка; он также входит в состав вируса гриппа. К этой же группе следует отнести и бактериальные ферменты, разлагающие антибиотики.
Суперантигены
Некоторые токсины (например, токсин Дика стрептококков или энтеротоксин стафилококков) способны действовать как суперантигены, вызывая поликлональную активацию различных клонов лимфоцитов. Поликлональная активация сопровождается гиперсекрецией лимфокинов с развитием цитокинопосредованной интоксикации.
Загрузка...
