Проверка клеточной культуры на контаминацию вирусами. Вирусы контаминирующие клеточные культуры.

⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 9Следующая ⇒

• При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:
• · Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений (литическая инфекция);
• · Приобретение заражённой культурой клеток способностик гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя;
• · Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов;
• · Подавление процессов метаболизма в заражённой вирусом культуре клеток, выявляемое с помощью так называемой цветной пробы.

Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность.

2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки.

Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий.

Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет.

При острой вирусной инфекции может наблюдаться образование гигантских многоядерных клеток – симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (напр., парамиксовирусы).

Рис. 5. Проявление ЦПД в культуре клеток

К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа.

Перед заражением из пробирок отсасывают культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду.

Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 370С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:

1. — энтеровирусы (вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО) вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток;
2. — аденовирусы превращают клеточный слой в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда;
3. — парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита образуют симпласты.

Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры.

Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД50) в 1 мл.

За одну ЦПД50 принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра.

Для идентификации выделенного вируса по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки (разведение сыворотки 1:5 или 1:10).

После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями:

• 1 – контроль незаражённой культуры;
• 2 – контроль дозы вируса – клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте;
• 3 – контроль культуры, заражённой смесью культуральной жидкости с нормально сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем – обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

2.1.2. Реакция гемадсорбции

Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы. Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию – склеивание эритроцитов.

Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы.

По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно.

Рис. 6. Реакция гемадсорбции

Техника постановки реакции гемадсорбции

Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней).

Для этого в пробирку с заражённой культурой вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса.

Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов.

При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е.

происходит явление задержки гемадсорбции.

Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.

2.1.3.Метод бляшек

Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель – нейтральный красный.

ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются.

В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.

Рис. 7. Метод бляшек

Агаровое покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков.

Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта.

Часто вместо агара используют гель бентионита (5-6%) – это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток.

Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек

Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина).

Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации.

Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают.

Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,1-0,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через 30-60 минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после чего производят их подсчёт и изучение.

Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса.

Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учётом разведения вируса), вычисляют титр вируса – количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Метод бляшек даёт возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается.

2.1.4. Цветная проба

Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом.

В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток.

Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет.

Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток.

При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма.

Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.

При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл.

Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.

Титрование вируса методом цветной пробы

Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.

При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3).

При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала.

Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл.

В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 370С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.

Титром вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.

Таблица 3

Схема титрования вируса методом цветной пробы

Ингредиенты опыта (в мл)	№ пробирок
Разведения вируссодержащего материала	Контроль клеток
10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	1 доза	½ доза	¼ доза
Вируссодержащий материал	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—	—	—
Взвесь клеток (1 доза)	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Питательная среда	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5	0,5	0,5
Вазелиновое масло	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Возможные результаты
Цвет среды в пробирках (красный или жёлтый)	К-4	К-4	К-3   Ж-1	К-2 титр Ж-2	К-1   Ж-3	Ж-4	Ж-4	Ж-2   К-2	К-4
Обозначения:	К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки

Дата добавления: 2015-04-15; просмотров: 67; Нарушение авторских прав

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Journal of Biomedical Technologies

Курмышкина О. В., Ковчур П. И., Волкова Т. О. ПОЛУЧЕНИЕ ВРЕМЕННЫХ КУЛЬТУР ПЕРВИЧНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК РАКА ШЕЙКИ МАТКИ: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ И СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ // Journal of Biomedical Technologies. 2017. № 1. С. 9–24. DOI: 10.15393/j6.art.2017.3763

Выпуск № 1 (2017)

pdf-версия статьи

УДК 576.535.5

Курмышкина   Ольга Вадимовна

ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет», 185910 Россия, Республика Карелия, Петрозаводск, пр. Ленина, 33, studioza@mail.ru

Ковчур   Павел Иванович

ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет», 185910 Россия, Республика Карелия, Петрозаводск, пр. Ленина, 33, pkovchur@mail.ru

Волкова   Татьяна Олеговна

ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет», 185910 Россия, Республика Карелия, Петрозаводск, пр. Ленина, 33, VolkovaTO@yandex.ru

рак шейки матки эпителиальные клетки временная культура дифференцировка морфологияфенотип

В статье приведено подробное описание процедуры перевода первичных опухолевых клеток инвазивного рака шейки матки во временную культуру, включая описание условий диссоциации ткани и выбор состава среды для культивирования; представлена морфологическая характеристика полученных колоний клеток и результаты их фенотипирования (на основе анализа экспрессии цитокератинов). Полученные результаты обсуждаются в сравнении с опубликованными ранее работами, направленными на поиск оптимальных условий культивирования первичных клеток цервикальных неоплазий.

 Введение

Разработка клеточных систем, максимально приближенных к реальным условиям, для in vitro исследований механизмов развития рака шейки матки (РШМ) и тестирования потенциальных терапевтических агентов для его лечения, является актуальной задачей (Fan, 2017).

Стандартные клеточные линии РШМ, поддерживаемые в культуре уже на протяжении многих лет, не являются репрезентативными моделями первичных опухолей, что имеет большое количество экспериментальных подтверждений.

Например, обнаружено, что при получении постоянных линий РШМ клеточный транскриптом претерпевает более значительные изменения относительно первичных опухолей, чем при естественной трансформации нормальных эпителиальных клеток в опухолевые (Magaldi, 2012).

Важность этой задачи можно проиллюстрировать также тем, что канцерогенез РШМ и других вирус-ассоциированных онкопатологий обусловлен, как правило, не определенными «драйверными» мутациями, а процессом случайной интеграции папилломавируса (ВПЧ) в геном клетки-хозяина, в результате чего генетический и фенотипический «портрет» РШМ может варьировать в достаточно широких пределах. Использование лабораторных животных для моделирования патогенеза РШМ, несмотря на их незаменимость в некоторых случаях, также имеет ряд ограничений по причине строгой видовой  и тканевой специфичности ВПЧ.

Культивирование первичных клеток цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН) и инвазивного РШМ до сих пор не является тривиальной и простой задачей и по-прежнему нуждается в оптимизации методов и условий (Bononi, 2012; Liu, 2016).

В течение долгого времени усилия были направлены на поиск способа культивирования цервикальных кератиноцитов в отсутствие фидерного слоя (используемого в протоколе, опубликованном Stanley и соавт. в 2002 г.), с целью избежать контаминации целевой культуры мышиными фибробластами.

Разработка специализированных бессывороточных сред и использование покрытия из компонентов межклеточного матрикса  позволило улучшить выход колоний эпителиальных клеток из первичных опухолей РШМ.

Тем не менее, полученные временные культуры часто содержат существенное количество стромальных фибробластов, которые, несмотря на создание селективных для кератиноцитов условий, могут пролиферировать с большей скоростью и постепенно замещать кератиноциты (Koopman, 1999; Liu, 2013). В то же время, обсуждается возможность и потенциальные преимущества со-культивирования цервикальных опухолевых кератиноцитов и опухоль-ассоциированных фибробластов (Bononi, 2012).

Материалы и методы 

Процесс получения временной культуры первичных опухолевых клеток РШМ состоит из нескольких этапов, по каждому из которых возможно варьирование условий для оптимизации процесса культивирования цервикальных кератиноцитов. В нашем случае была использована комбинация различных подходов, опубликованных ранее другими исследователями; описание и обоснование выбора этих подходов приводится в данном разделе.

1. Образцы биоматериала. Образцы опухолевой ткани были получены в ходе операции тотальной гистерэктомии от пациенток ГБУЗ МЗ РК «Республиканский онкологический диспансер» с инвазивным раком шейки матки FIGO-стадий IB и IIB. Транспортировка образцов осуществлялась в стерильных контейнерах в среде DMEM-F12, содержащей 5% фетальной сыворотки теленка (FBS) и коктейль антибиотиков (Gibco), при +4°С в течение не более 2 ч.
2. Получение клеточной суспензии. Образцы ткани были разделены на несколько фрагментов и промыты стерильным раствором Хэнкса (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS, Gibco); каждый фрагмент был далее разрезан на фрагменты толщиной не более 1-2 мм с помощью стерильного одноразового скальпеля (№10, Sigma-Aldrich). Часть полученных фрагментов – опухолевых эксплантатов — была непосредственно помещена в чашки Петри с обработанной поверхностью для дальнейшего культивирования. Другая часть фрагментов использовалась для получения клеточной суспензии путем ферментативной дезинтеграции с помощью коллагеназы I типа, 50 е.а./мкл (Gibco), в 2 мл HBSS, в присутствии Ca2+, в течение 45-60 мин при +37°С и постоянном вращении (20 об/мин) на мини-ротаторе (BioSan). После инкубации клетки (а также оставшиеся неразрушенные фрагменты) были отмыты центрифугированием в HBSS. Для избавления от эритроцитов (образующихся в большом количестве в результате разрушения внутриопухолевой микрососудистой сети), которые в дальнейшем сильно затрудняют прикрепление клеток к матриксу и их пролиферацию, использовали осмотический шок путем кратковременной (5-7 мин) обработки стерильным аммонийным буфером (Red Blood Cell Lysis buffer: 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA), после чего клетки отмывали средой для культивирования.

Условия ферментативной диссоциации образцов ЦИН/РШМ могут варьировать: некоторые авторы предлагают использовать коллагеназу II типа в течение ночи при +37°С и 5% СО2 для максимального выхода цервикальных кератиноцитов (Bononi, 2012); Santin и соавт.

применяли инкубацию с 0,14% коллагеназой I типа и 0,01% ДНКазой в среде RPMI-1640 при +37°С (в течение 2 ч) или +4°С (в течение ночи) во флаконах большого объема на магнитной мешалке (Santin, 2005). Для получения нормальных цервикальных эпителиоцитов возможно использование диспазы II типа в сочетании с 0.25% трипсином-0.

01% EDTA в течение 20 ч (Fan, 2017).

Ряд авторов также включают в процесс пробоподготовки фильтрацию полученной суспензии клеток через 150 мкм-нейлоновую сетку с целью получения единичных клеток для их дальнейшего равномерного посева на пластик с определенной плотностью (Santin, 2005; Magaldi, 2012), однако, другие исследователи указывают на отсутствие необходимости данного этапа (Liu, 2016). Мы также не использовали клеточные фильтры перед посевом, так как, согласно нашим наблюдениям, неразрушенные после коллагеназной обработки эпителиальные фрагменты служат таким же важным источником клеточных колоний, как и необработанные эксплантаты (см. далее). Минимальное время ферментативной обработки ткани – до 1 ч – позволяет, согласно нашим наблюдениям, повысить выход жизнеспособных клеток.

1. Культивирование. Для культивирования опухолевых клеток РШМ использовали 35 мм-чашки Corning, покрытые коллагеном I типа. Для сравнения, часть клеток была посажена в 12-луночный планшет (TC treated, Eppendorf) с поверхностью, обработанной для культивирования адгезивных культур клеток, но без коллагенового покрытия; однако, на такой поверхности, цервикальные опухолевые кератиноциты (в отличие от фибробластов) были способны закрепляться только после первого пассажа, что совпадает с наблюдениями Liu и соавт. (Liu, 2016).

Все чашки (с опухолевыми эксплантатами или суспензией клеток от каждого образца) были разделены на 2 группы: в одной культивирование проводилось в среде DMEM-F12 с добавлением 1хPSN смеси антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-неомицин, Gibco) и 2,5 мкг/мл амфотерицина В (Fungizone, Gibco); в другой группе клетки были помещены в бессывороточную среду для культивирования кератиноцитов (Keratinocyte Serum-Free Medium, K-SFM, Gibco) с тем же содержанием антибиотиков и добавками: 30 мкг/мл бычьего гипофизарного экстракта (BPE) и 5 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (rhEGF), согласно инструкции производителя (Gibco). В обоих случаях для первоначального прикрепления клеток и начала роста колоний среда для культивирования содержала 5% FBS; в дальнейшем концентрация фетальной сыворотки была снижена в 2 раза в случае K-SFM, в то время как ее снижение в DMEM-F12 сопровождалось заметным ухудшением роста культуры; поэтому культивирование в DMEM-F12 на всем протяжении эксперимента проводилось в присутствии 5% FBS. Необходимость варьирования содержания сыворотки обусловлена тем, что при высокой ее концентрации (10%) может наблюдаться ускоренный рост фибробластов и дифференцировка («старение») цервикальных кератиноцитов, а в бессывороточной среде кератиноциты, извлеченные из ткани (нормальной или опухолевой), плохо прикрепляются к поверхности и погибают (Bononi, 2012; Liu, 2016). Поэтому рекомендуется посев кератиноцитов проводить при высокой концентрации фетальной сыворотки (5-10%), а после прикрепления клеток снижать ее содержание (до полного отсутствия) (Santin, 2005; Bononi, 2012; Liu, 2013, 2016; Fan, 2017). Для культивирования клеток ЦИН, Bononi и соавт. предлагают комбинировать среды DMEM-F12 и K-SFM в пропорции 1:1, что позволяет получить морфологически гомогенные колонии эпителиальных клеток.

Культивирование проводили в 5% СО2 при +37°С. Первую смену среды осуществляли на 4-е сутки после посева, причем не прикрепившиеся клетки были отсажены в новые чашки.

При пересеве, чашки промывали средой без добавок и инкубировали 5-10 мин с 0,05% раствором Трипсина-EDTA при +37°С; после отмывки средой (с 5% FBS) клетки были помещены на 2 ч в стерильные чашки с необработанной поверхностью (при +37°С и 5% СО2); за это время значительная часть фибробластов успевала прикрепиться к пластику (см. далее), а эпителиальные клетки оставались в суспензии и были пересажены в чашки, покрытые коллагеном I. Наблюдение за ростом и морфологией клеток проводили в фазовом контрасте с помощью инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus), оборудованного цифровой CCD-камерой, и программного обеспечения cellSens (Olympus).

1. Фенотипирование. Подтверждение эпителиальной принадлежности полученной временной культуры клеток было получено путем анализа экспрессии цитокератинов с помощью проточной цитометрии. При достижении 70-80% конфлуетности (0-й пассаж), с поверхности одной из чашек клетки были сняты путем обработки 0,05% раствором Трипсина-EDTA, отмыты средой и далее фосфатно-солевым буфером. После подсчета живых клеток (на TC20 счетчике клеток Bio-Rad), клетки обрабатывали компонентами InsideStain buffer для их фиксации и пермеабилизации согласно инструкции производителя (Miltenyi Biotec) и далее инкубировали с FITC-меченными пан-специфическими антителами к цитокератинам (-7, -8, -18, -19) человека (Miltenyi Biotec). Анализ клеток проводили с помощью проточного цитофлуориметра MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec) с использованием программного обеспечения MACSQuantify version2.8. 

Результаты и обсуждение

1. Характеристика роста первичных опухолевых клеток РШМ в культуре. При культивировании клеточной суспензии, полученной путем ферментативной диссоциации образца РШМ IIB стадии, были получены одиночные прикрепившиеся клетки или микро-кластеры, состоящие из двух-трех клеток, которые к концу первой недели приобрели типичную эпителиальную морфологию (Рисунок 1): форма клеток варьировала от прямоугольной до формы «булыжника» («cobblestone»); наблюдались выросты цитоплазмы в форме псевдоподий – в некоторых случаях с хорошо выраженными точечными (фокальными) адгезионными контактами с коллагеновым матриксом. В фазовом контрасте также была очень хорошо заметна зона адгезивных контактов клеток с поверхностью, представленная микрофиламентами (микроворсинками); клетки имели относительно низкое, характерное для кератиноцитов, ядерно-цитоплазматическое соотношение и зернистую цитоплазму. Различные варианты морфологии кератиноцитов приведены на микрофотографиях Рис.1. Если прикрепление кератиноцитов и приобретение ими характерной морфологии происходило в течение всей первой недели (что соответствует срокам, приводимым другими исследователями), то опухоль-ассоциированные фибробласты прикрепились к коллагену в течение 1-ых суток после переноса клеточной суспензии в чашки: как показано на Рис.1Л-М, они характеризовались веретеновидной формой и имели тенденцию располагаться параллельно друг другу.

По сравнению с посевом суспензии одиночных клеток РШМ IIB стадии, посадка на коллагеновый матрикс тканевых эксплантатов РШМ IB стадии, не обработанных коллагеназой, либо прошедших кратковременную (

Сравнение результатов культивирования эксплантатов, не обработанных коллагеназой I, и фрагментов ткани, подвергшихся кратковременной (менее 1 ч) коллагеназной обработке, позволяет говорить о том, что даже если коллагеназа не приводит к полной диссоциации ткани, она, тем не менее, частично деградирует межклеточный матрикс и тем самым облегчает переход клеток из 3D-фрагмента ткани на 2D-поверхность пластика (предварительно покрытую коллагеном). Процесс этого перехода показан на Рисунке 4А: на переднем фронте мигрирующих из эксплантата клеток, перешедших на поверхность пластика, видны хорошо выраженные выросты цитоплазмы. Кроме того, при таком способе обработки клеток наблюдались микроколонии, состоящие не из двух-трех (см. Рис.1), а из порядка 10 клеток с полигональной морфологией, плотно прилегающих друг к другу и с заметными в фазовом контрасте плотными межклеточными контактами, характерными для эпителиальных клеток (Рисунок 4Б).

Рисунок 1. Различные варианты морфологии клеток, полученных из первичной опухолевой ткани РШМ IIB, к концу первой недели культивирования на коллагеновом матриксе.

А-Б Прямоугольная морфология; В-Д Клетки вытянутой формы с ярко выраженными псевдоподиями; Е-Ж Округлая морфология (форма «булыжника»); З-К Микрокластеры эпителиальных клеток; Л-М  Фибробласты, формирующие параллельно ориентированные пучки.

Черными стрелками показаны зоны адгезионных клеточных контактов с матриксом в виде микроворсинок, белыми – выпячивания цитоплазмы в форме псевдоподий (ламеллоподий), с областью точечных контактов с матриксом (Г). Увеличение 10х40 (фазовый контраст). 

Figure 1. Different variants of morphology of cells derived from the primary tumor tissue of cervical cancer stage IIB and grown on the surface coated with type I collagen (by the end of the 1st week).

А—Б Rectangular morphology; В—Д Cells having elongated shape with clearly distinguishable pseudopodia; Е—Ж

Посев на культуре клеток (ВПГ, ЦМВ) в Москве и МО

Посев на культуре клеток (ВПГ, ЦМВ) — не только выявляет вирус, но и даёт информацию о его активности (агрессивности).

Анализ результатов посева на фоне лечения, позволяет делать заключение об эффективности проводимой терапии.

Вирус простого герпеса (ВПГ), или герпес, бывает двух видов: вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1) и вирус простого герпеса второго типа (ВПГ-2). Обе формы вируса — высококонтагиозны.

Основной путь передачи герпеса: воздушно-капельный, контактный, половой, внутриутробный, гемотрансфузионный, при пересадке органов. Первичная герпевирусная инфекция и реактивация инфекции (в гораздо меньшей степени) в период беременности могут вызывать патологию беременности или внутриутробное инфицирование плода. Причиной внутриутробного инфицирования плода чаще бывает ВПГ-2, но не исключено заражение и ВПГ-1. Кроме того, роженицы могут передать вирус новорождённому при родах, что может вызвать неонатальный герпес — редкое заболевание с летальным исходом.

ВПГ-1 (Herpes Simplex virus I) — передаётся через оральный контакт и зачастую вызывает «простуду» на губах (оролабиальный герпес).

К типичным симптомам ВПГ-1 относят:

• высыпание на губах и слизистой оболочке рта группы скученных мелких пузырьков (везикул), наполненных прозрачным содержимым;
• воспалённость, отёчность кожи и слизистой в области высыпаний.

ВПГ-1 также может вызвать генитальную форму заболевания. Заболевание губ, вызванное вирусом I типа, постепенно может перейти и на другие слизистые, в том числе, и на половые органы. Заражение может произойти в результате непосредственного контакта с инфицированными половыми органами при половом сношении, при трении половых органов друг о друга, при орально-генитальном контакте, анальном половом акте или орально-анальном контакте. И даже от больного полового партнёра, у которого внешние признаки болезни пока отсутствуют.

ВПГ-2 — относится к числу инфекций, передаваемых половым путем, которые могут вызвать генитальный герпес.

Распространяется, главным образом, половым путём при кожном контакте. Вирус генитального герпеса Herpes simplex 2 типа поражает, преимущественно, покровные ткани (эпителий) шейки матки у женщин и полового члена у мужчин, вызывая боль, зуд, появление прозрачных пузырьков (везикул) на месте которых образуются эрозии/язвочки. Однако при оральных контактах возможно поражение покровной ткани губ и ротовой полости.

HSV и беременность

У беременных: вирус может проникнуть через плаценту в плод и вызвать у него врождённые дефекты. Герпес может вызвать также самопроизвольный аборт или преждевременные роды. Но особенно вероятна опасность заражения плода в процессе родов, при прохождении через шейку матки и влагалище при первичной или рецидивирующей генитальной инфекции у матери. Такое заражение на 50% повышает смертность новорождённых или развитие у них тяжёлых повреждений головного мозга или глаз. При этом определённый риск инфицирования плода существует даже в тех случаях, когда у матери ко времени родов отсутствуют какие-либо симптомы генитального герпеса. Ребёнок может заразиться и после рождения, если у матери или у отца имеются поражения, во рту, или получить вирус с материнским молоком.

Цитомегаловирус (или ЦМВ) — это разновидность из группы герпесвирусов (Herpesvirus), относящаяся к роду Cytomegalovirus подсемейства 3-herpesviridae. Встречается везде.

Статистика частоты встречаемости очень вариативна — вероятно, из-за того, что у значительной массы носителей вируса заболевание протекает бессимптомно. Способов полного излечения от герпеса пока нет, т.е.

заражённый человек остается носителем возбудителя на всю жизнь.

ЦМВ — это инфекция, сходная с герпесом или ветрянкой, только с гораздо более серьёзными и неожиданными последствиями — от повреждения внутренних органов до необратимых изменений ЦНС.

Определить данное заболевание на ранних стадиях проблематично, его точный инкубационный период пока неизвестен. Проявления инфекции могут быть приняты за воспаление органов мочеполовой системы, обычные недомогания типа ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция) и прочие обычные болезни.

Весьма часто ЦМВ приводит к возникновению многочисленных воспалений сразу в нескольких внутренних органах.

При беременности вирус не всегда передаётся от больной матери к ребёнку. Но если инфицирование ЦМВ произошло в период беременности или болезнь усилилась, то вероятность передачи заболевания плоду значительно возрастает. Цитомегаловирусная инфекция передаётся половым путем, через слюну, материнское молоко, при беременности (от матери к ребёнку), через общую мочалку, полотенце, посуду и т.д. Наиболее часто цитомегаловирусная инфекция проявляется как острая респираторно-вирусная инфекция. От больных поступают жалобы на общее недомогание, насморк, быструю утомляемость. Происходит увеличение и воспаление слюнных желёз, сопровождающееся беловатым налётом на языке и дёснах, а так же обильным выделением слюны. При генерализованной форме ЦМВ-инфекции, наблюдается поражение паренхиматозных (внутренних) органов. Воспаляются почки, поджелудочная железа, печёночная ткань, селезёнка, надпочечники. Это сопровождается «беспричинными», на первый взгляд, бронхитами и пневмониями, которые плохо поддаются лечению антибиотиками. У больных снижается иммунный статус, в периферической крови становится меньше тромбоцитов. Довольно часто наблюдаются поражения стенок кишечника, периферических нервов, сосудов глаз и головного мозга. Увеличиваются подчелюстные и околоушные слюнные железы, воспаляются суставы. Могут появиться высыпания на коже. У женщин и мужчин поражение мочеполовой системы даёт симптомы хронического не специфического воспаления. В этом случае, если не обнаружена вирусная природа патологии, лечение заболевания при помощи антибиотиков будет малоэффективно. Самые серьёзные и опасные осложнения цитомегаловируса — это патология беременности, плода и новорождённого. Если произошло инфицирование плода во время беременности, то риск развития этой патологии будет максимальным. Однако, не стоит забывать, что проблемы могут возникнуть так же у беременных при активации латентной ЦМВ-ифекции, когда вирус попадает в кровь, впоследствии заражая плод. Согласно статистике, ЦМВ является наиболее частой причиной не вынашивания беременности. Внутриутробная цитомегаловирусная инфекция является причиной поражений центральной нервной системы (тугоухость и отставание в умственном развитии). В 20–30% случаев заканчивается смертью ребёнка. Симптомы герпеса у разных людей могут значительно отличаться. Если у Вас наблюдаются признаки инфекции, рекомендуем Вам пройти исследование «Посев на культуре клеток (ВПГ, ЦМВ)» для выявления герпесвируса на протяжении 48 часов с момента их возникновения.

• Преимущества посева на культуре клеток
• Подготовка
• Сбор мочи
• Подготовка ко взятию слюны:

Главным преимуществом посева на культуре клеток является высокая точность исследования в случае положительного результата. Кроме того, по культуре клеток можно определять, вирусом герпеса какого типа — первого, второго или ЦМВ, была вызвана инфекция. Если результат лабораторной диагностики на культуре клеток окажется у вас положительным, можете быть уверенным, что у вас вирус герпеса. Основным недостатком посева на культуре клеток является высокий процент ложноотрицательных результатов. Поскольку для посева вирус должен находиться в активном состоянии, если герпетический пузырёк или язвочка маленького размера или уже начинает заживать, то для нормального исследования количества вируса может быть недостаточно. При проведении диагностики позднее, чем через 48 часов после появления симптомов, высока угроза ложноотрицательного результата. Посев вируса на культуре клеток бывает еще менее достоверным при диагностике во время рецидивов (положительные результаты получают лишь в 30% случаев повторных вспышек герпеса). Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приёма пищи. Кровь берется в пробирку с ЭДТА. Накануне сдачи анализа не рекомендуется употреблять в пищу овощи и фрукты, которые могут изменить цвет мочи (свёкла, морковь, клюква и т.п.), принимать диуретики. Перед сбором мочи необходимо провести тщательный гигиенический туалет внешних половых органов. Собирают строго утреннюю порцию мочи, выделенную сразу же после сна. Женщинам не рекомендуется сдавать анализ мочи во время менструации; во избежание попадания в мочу выделений из влагалища, рекомендуется ввести во влагалище тампон. За сутки до сдачи исключить приём алкоголя и половой акт. Материал собирается в стерильный пластиковый контейнер. Собирается средняя порция утренней мочи. При первом утреннем мочеиспускании небольшое количество мочи (первые 3–5 сек) выпустить в унитаз, а затем, не прерывая мочеиспускания, собрать среднюю порцию мочи в чистую ёмкость. Продолжить мочеиспускание в унитаз. Ёмкость закрыть, промаркировать. Нужно постараться максимально сократить срок доставки материала в лабораторию. Длительное хранение приводит к размножению бактерий. Доставить контейнер с мочой в медицинский офис необходимо как можно скорее с момента взятия биоматериала. Моча в стерильном пластиковом контейнере для посева стабильна не более 2 часов при температуре 18–20°С, не более 6 часов при температуре хранения 4–8°С.

• желательно собирать утром;
• зубы не чистить, не есть как минимум 4 часа;
• слюна собирается в стерильный контейнер.

Мазок из урогенитального тракта женщины Сдача мазка не допускается в дни менструации. За трое суток до взятия необходимо отказаться от применения вагинальных свечей, тампонов, спермицидов, за сутки исключить половые контакты. Нельзя спринцеваться накануне проведения обследования. После УЗИ-исследования с применением вагинального датчика, кольпоскопии, биопсии должно пройти не менее 48 часов.

Мазок из урогенитального тракта мужчины 

За 1–2 суток до взятия мазка, необходимо исключить половые контакты. Нельзя мочиться в течение 1,5–2 часов до процедуры.

Интерпретация результатов

Результат исследования выдаётся в процентах. В норме данные вирусы на культуре клеток не обнаруживаются. Интерпретация результатов должна проводиться лечащим врачом.