Исторически вакцины сначала были основаны на ослабленных или инактивированных версиях живых вирусов, но у них были некоторые недостатки. Например, в некоторых случаях пораженный вирус может вернуться к активному вирусу и вызвать заболевание, для борьбы с которым он был создан.
Современные достижения в области генетики и технологии рекомбинантной ДНК, или рДНК, позволили ученым создать вакцины, которые больше не способны вызывать заболевание. Три различных типа препаратов, основанных на технологии вакцины рДНК, используются для вакцинации животных и человека.
Генетически модифицированные вирусы
Ученые использовали технологию вакцины рДНК для генетической модификации живых вирусов, чтобы они могли вызывать иммунный ответ, но не быть патогенными.
Это требует знания того, какие гены в вирусе связаны с репликацией вируса, и последующего удаления или выбивания этих генов.
Генетически модифицированный вирус, который больше не может реплицироваться, все еще имеет поверхностные белки или антигены, которые признаны чужеродными для хозяина, способствуя иммунному ответу на модифицированный вирус.
Рекомбинантные вирусные белки
Для тех вирусов, в которых известен белок или антиген, который индуцирует иммунный ответ, вирусная ДНК, которая кодирует этот конкретный белок, может быть выделена, клонирована и использована для получения вирусного белка в пробирке.
Большие количества вирусного белка, синтезированного из клонированной ДНК, затем очищают и используют в качестве вакцины.
Синтезированный белок из клонированной ДНК или набор вирусных белков, используемых для иммунизации, называют рекомбинантными инактивированными вакцинами.
Генетические вакцины
Генетические вакцины состоят из разорванных кусочков вирусной ДНК, которые сконструированы так, чтобы инициировать экспрессию белкового антигена, специфичного для заболевания, после инъекции животному, подвергающемуся вакцинации.
Эти маленькие кусочки вирусной ДНК вводят под кожу, после чего клетки-хозяева захватывают ДНК. ДНК-матрица транслируется, и вирусные белки образуются в клетках-хозяевах.
Иммунная система хозяина реагирует, если он подвергся воздействию самой болезни, и пытается бороться с ней, вырабатывая антитела против вновь синтезированных вирусных белков.
Другие соображения
Несмотря на все вакцины, разработанные с помощью технологии рДНК, инфекционные заболевания животных и человека продолжают оставаться проблемой во всем мире.
Избирательное давление и естественный отбор приводят к эволюционным изменениям в вирусах, которые в результате производят новые штаммы, с которыми современные вакцины больше не могут бороться. Есть также вирусы, для которых вакцин не существует, потому что они все еще плохо изучены.
Достижения в области биотехнологии и широкомасштабные усилия в рамках проекта «Вирусные геномы» в Национальном центре биотехнологической информации, Национальные институты здравоохранения, позволили секвенировать более 1200 различных вирусных геномов.
Геном — это полный набор генов, обнаруженных в данном организме. Эта продолжающаяся инициатива секвенирования дает ученым новую генетическую информацию, которая потенциально облегчит разработку новых вакцин с помощью технологии рДНК.
Рекомбинантные ДНК
Рекомбинантная ДНК — это искусственно полученная ДНК, которая включает ген (гены), являющийся объектом генетических манипуляций, и вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном.
Векторы должны обладать следующими особенностями:
- — иметь свойства репликона;
- — нести субстратные участки для рестриктаз, без чего невозможна встройка ДНК;
- — содержать один или несколько генов-маркеров, позволяющих по фенотипу констатировать факт его передачи.
Конструирование рекомбинантных молекул ДНК началось с получения гибридных ДНК между плазмидами. В 1978 г. М. Коеном был проведен опыт, в котором удалось создать новую гибридную плазмиду, объединившую устойчивость к антибиотикам, которой обладали молекулы ДНК объединяемых плазмид.
Схема получения рекомбинантной плазмиды и ее клонирования в клетках бактерий приведена на рис. 15.13.
Рис. 15.13. Получение рекомбинантной плазмиды и ее клонирование в клетках бактерий
Получены многочисленные факты переноса генов из клеток эукариот в клетки бактерий. Дж. Морроу и его сотрудники (1974) использовали в качестве вектора ДНК плазмиды pSClOl Е. coli и в качестве переносимого ген-специфичного материала — фрагмент ДНК из хромосомы африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), кодирующий синтез молекул рибо- сомной ДНК.
Фрагменты ДНК, детерминирующие синтез молекул рРНК (фрагменты рДНК), «пришивались» к плазмиде. Затем гибридными молекулами трансформировали Е. coli по признаку устойчивости к тетрациклину.
Из клеток трансформантов выделяли плазмидную ДНК, изучали ее в градиенте плотности хлористого цезия, под электронным микроскопом проверяли ее способность к гибридизации с меченой рибосомной РНК X laevis и исследовали, на какое число фрагментов она распадается под действием рестриктаз.
Все тесты показали наличие генетического материала X. laevis в плазмидах, способных к репликации в клетках бактерии. Кроме того, была исследована способность этого материала, включенного в ДНК плазмиды, к транскрипции. Для этой цели были использованы так называемые миниклетки, т. е.
бактериальные клетки одного из мутантов, не содержащие в определенных условиях ДНК. Опыты показали, что в мини-клетках, трансформированных рекомбинантными плазмидами, осуществляется транскрипция генов из ДНК X. 1аеук.
В последующие годы ряд генов человека был введен в клетки бактерий, с помощью которых синтезировали нужные белки человека (рис. 15.14).
Рис. 15.14.
Основные этапы производства белка методами генной инженерии: а — экстракция мРНК определенного гена; б — копирование экстрагированной мРНК в кДНК ферментом ревертазой; в — интеграция кДНК в соответствующий вектор, обычно плазмиду; г — введение рекомбинантных плазмид в клетки бактерии Е. coir, д — выделение из популяции трансформированных бактерий клона с нужной кДНК для продуцирования соответствующего белка
Непосредственное клонирование геномной ДНК все еще остается технически трудной задачей. Экспериментатор, желая выделить какой-либо ген, располагает для начала тремя источниками: белками, мРНК и геномной ДНК. Основой пока остается процедура, позволяющая по мРНК воспроизводить ДНК.
В качестве примера рассмотрим клонирование генов факторов крови. Сначапа находят орган, в котором выделяемый ген экспрессируется активнее всего, т. е. уровень соответствующей мРНК в нем самый высокий.
После экстракции мРНК из такой ткани приступают к получению с мРНК ДНК-копий (комплементарной ДНК, или кДНК) с помощью обратной транскриптазы. Комплементарная ДНК намного более стабильна, чем соответствующая мРНК.
Кроме того, в двухцепочечном виде ее можно интегрировать в плазмиду (бактериальную мини-хромосому), которую в свою очередь вводят в бактерию типа Е. coli.
Такие плазмиды, используемые сейчас во всех лабораториях, где проводят работы по генной инженерии, происходят от дикого типа и несут в большинстве своем по два гена устойчивости к антибиотикам (например, к пенициллину и тетрациклину).
Эти маркеры позволяют отбирать те бактерии, которые содержат плазмиду, а среди них в свою очередь те, у которых плазмида включила в себя кДНК. Поскольку кДНК встраивается внутрь гена устойчивости к пенициллину, такой «раздробленный» ген уже не работает, и бактерии вновь обретают чувствительность к антибиотику.
Устойчивость же к тетрациклину при этом сохраняется. Следовательно, достаточно высеять бактерии на питательную среду с тетрациклином, чтобы отобрать из них содержащие плазмиду, а затем из последних — содержащие так называемую рекомбинантную плазмиду и чувствительные к пенициллину. Таким образом и получают соответствующий «банк кДНК».
Следующий этап состоит в том, чтобы среди 104-105 независимых бактериальных колоний определить те, которые содержат генетическую информацию об интересующем нас гене несвертывания крови.
Для того чтобы среди десятков тысяч бактериальных колоний банка кДНК найти ту, которая содержит кДНК нужного белка, приходится использовать несколько методов, т. к. ни один из них в отдельности не гарантирует успеха.
Один из этих методов заключается в использовании синтетического зонда, гомологичного нужной молекуле кДНК. Такой меченый зонд гибридизируется с кДНК, так что метка вводится во всю колонию.
Разработано также несколько упрощенных методик, использующих ту или иную априорную информацию.
Предположим, что известны лишь фрагменты аминокислотной последовательности этого белка. Зная генетический код, химик может синтезировать соответствующие им фрагменты ДНК длиной 14-18 п. н.
Пометив их радиоактивным фосфором 32Р, биолог может воспользоваться ими как молекулярным зондом для выявления тех бактериальных клонов, которые содержат соответствующую кДНК. Метод основывается на том, что кДНК гомологичных последовательностей способны связываться друг с другом.
Колонию с кДНК, гомологичной какому-либо из меченых фрагментов, теперь легко определить после соответствующей экспозиции фотопленки.
За последние годы эта методика была существенно усовершенствована во многом благодаря успехам в химическом синтезе ДНК.
Получение кДНК человека возможно в два этапа: после выделения гомологичной кДНК какого-либо животного ее уже можно использовать в качестве зонда. Две молекулы кДНК, например мыши и человека, способны соединяться так же эффективно, как и в случае двух близкородственных млекопитающих.
Ситуация усложняется, если аминокислотная последовательность не известна. Методика исследования в этом случае сводится к тому, чтобы заставить бактерии непосредственно считывать содержащуюся кДНК, затем выявлять такие колонии специфическими антителами.
Способность кДНК связываться с мРНК также нашла применение. После гибридизации каждую мРНК элюируют (осаждают с помощью электрофореза), затем с нее считывают белок либо в бесклеточной системе, либо (после инъекции) в яйцеклетке земноводного. Белок характеризуют по его молекулярным свойствам и биологической активности.
Ученые разрабатывают новые методы, ускоряющие выделение клонов. Стало очевидным, что при выделении клонов следует использовать несколько методов одновременно. При таком подходе нужный клон кДНК всегда можно будет выделить.
После клонирования начинается «эксплуатация» кДНК. Ее подробное исследование позволяет быстро определить первичную структуру соответствующего белка.
В большинстве случаев кДНК непосредственно используют для производства «своего белка». Но можно ее заменить, воспользоваться ею для выделения самого гена из банка геномной ДНК (методом гибридизации).
Изучение самих генов позволяет лучше понять их структуру и механизмы действия в организме.
Генетическая инженерия (генная инженерия) – совокупность приемов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.
Например, получение «биологических реакторов» микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определенными ценными для человека признаками.
Сущность генной инженерии состоит в целенаправленной перестройке генетического аппарата (генома) клеток для изменения их генетических характеристик.
Эта задача осуществляется путем создания молекулярных химер ДНК, состоящих из фрагментов разного происхождения, например, из ДНК теленка, ДНК бактерии, или путем включения полученных искусственно ДНК, которых ранее не было в природе, в клетки-реципиенты, с целью синтеза ими определенного белка.
Генетическая инженерия позволяет получить молекулу бактериальной ДНК с встроенным в нее геном человека или животного. Первая рекомбинантная ДНК была получена в США в 1972 г.
, а десятью годами позже уже поступил в продажу человеческий инсулин (гормон, которого не хватает у больных сахарным диабетом), вырабатываемый бактериями Е. coli.
В настоящее время с помощью рекомбинантных ДНК производят интерфероны и интерлейкины (факторы иммунитета, применяющиеся при лечении многих заболеваний), гормон роста и другие полезные вещества.
ИСТОРИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Генетическая инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.
Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК.
Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали Е. coli, ее вирусы и плазмиды.
Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.
Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.
Историю развития генетической инженерии можно разделить на три этапа.
Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
Третий этап – начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.
Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стэнфордском университете П. Берг, С. Коэн, X. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и Е. coli.
Предпосылкой к исследованиям в генной инженерии послужили два открытия, сделанные в первой половине XX в.
Во-первых, было установлено, что вирусы, паразитирующие в бактериях (фаги), встраивают свою ДНК в геном бактерии, во-вторых, оказалось, что в бактериях, невосприимчивых к заражению фагами, содержатся специальные ферменты, которые разрезают двойные спирали фаговых ДНК в строго определенных местах.
Эти ферменты назвали рестриктазами. Первой была выделена реетриктаза Eco RI из кишечной палочки. Эта реетриктаза расщепляет связи между остатками адениловой и гуаниловой кислот в ДНК, содержащих в своих цепочках следующую нуклеотидную последовательность.
В настоящее время получены сотни рестриктаз из различных бактерий, обладающих специфичностью к участкам (сайтам) ДНК, имеющим палиндромное строение аналогично сайту для рестриктазы Eco RI. С помощью рестриктаз удается вырезать из молекул ДНК отдельные гены.
Следующее открытие, которое легло в основу технологии получения рекомбинантных ДНК, – обнаружение плазмид в бактериях.
Как известно, в клетках животных и высших растений основное количество ДНК сосредоточено в ядре и небольшая часть – в митохондриях (у растений также в хлоропластах).
В бактериях, не имеющих клеточного ядра, ДНК, в которой записана генетическая информация, находится в составе хромосом непосредственно в цитоплазме.
Но, кроме хромосомных ДНК, в бактериях содержатся, независимо от хромосомных, замкнутые кольцевые ДНК, которые также несут в себе генетическую информацию. Эта информация может передаваться из одной бактерии в другую трансмиссивными плазмидами. Процесс обмена генетической информацией между бактериями, отдаленно напоминающий механизм полового размножения растений и животных, называется конъюгацией. Перенос
ДНК из одной бактерии в другую при конъюгации осуществляется через микротрубочки (пили). Они построены из специального белка пилина, ген которого локализован в плазмиде. Таким путем возможна передача свойств даже микроорганизму другого вида, что было установлено еще в 1922 г. отечественным ученым Л. А. Зильбером.
Перенос генетической информации может произойти не только путем конъюгации двух клеток, но и свободная ДНК из лизированной (разрушенной) клетки может перейти в другую бактерию. Кроме того, паразиты бактерий (фаги) способны при заражении другой клетки передавать ей гены предыдущего хозяина. Процесс передачи генетического материала посредством плазмид и фагов называется трансдукцией.
Таким образом, способность микроорганизмов принимать чужеродную ДНК, а также существование плазмид, способных встраивать ее в свою структуру и переносить в другую клетку, предопределило возможность создания рекомбинантных ДНК.
При введении рекомбинантной ДНК, несущей чужеродный ген в клетки бактерий (реципиентов), последние включают их в свой генетический аппарат. Полученная из плазмиды кольцевая ДНК, способная переносить ген от одной клетки к другой, называется вектором.
Векторные ДНК отбирают или специально изменяют так, чтобы они были способны размножаться в клетках-реципиентах. Кроме того, векторы должны содержать гены-маркеры, придающие клеткам-реципиентам новые признаки, по которым их можно отличить от других клеток. Такими генами могут служить гены устойчивости к антибиотикам.
Для выбора генов пользуются библиотекой генов, насчитывающей миллионы единиц.
Для контроля их встраивания и переноса используют зонды – молекулы нуклеиновых кислот, меченные радиоактивным изотопом, обычно фосфором 32Р. Зонды содержат нуклеотидные последовательности, комплементарные участкам ДНК искомого гена.
После того как убеждаются в успешности переноса рекомбинантной ДНК в клетку-реципиент, производят клонирование, то есть из одной материнской клетки получают культуры дочерних клеток (клоны), имеющие одинаковый генетический аппарат.
Клоны клеток используются в промышленных целях для биотехнологического производства белковых веществ, в том числе ферментов. В частности, налажено производство сычужного фермента (ренина), необходимого для выработки сыра.
Клонирование клеток животных и растений – более сложный процесс, однако в настоящее время получают клоны лимфоцитов (иммунных клеток), которые синтезируют моноклональные антитела, используемые в диагностике инфекционных заболеваний.
Рекомбинантные штаммы бактерий и дрожжей широко используют для микробиологического синтеза не только белков, но и таких веществ, как витамины, аминокислоты, антибиотики и другие ценные соединения.
Методами генной инженерии можно усиливать природную способность определенных видов бактерий к осуществлению специфических биологических процессов и созданию высокоэффективных штаммов микроорганизмов, разрушающих токсичные субстраты или способствующих росту культурных растений.
Основные области применения рекомбинантных микроорганизмов – медицина и ветеринария (производство инсулина, интерлейкинов, интерферона, гормона роста, эритропоэтина, ДНК-азы, иммуноглобулинов, рекомбинантных вакцин); сельское хозяйство (микробные инсектициды, микробные удобрения, производство стимуляторов роста растений); экология (биодеградация и утилизация биополимеров); промышленность (синтез ароматических соединений, производство этанола, получение L-аскорбиновой кислоты, антибиотиков, аминокислот, ферментов и др.)
Таким образом, методами генной инженерии потенциально можно преобразовывать клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их для полезных целей – в качестве лекарственных средств, кормового и пищевого назначения.
В настоящее время кишечная палочка (Е. coli) стала основным поставщиком таких важных гормонов, как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока.
Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот.
При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Рекомбинантный инсулин не содержит белков Е. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках Е.
coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму.
Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.
Соматотропин – гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.
Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа – 4-6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.
В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре Е. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как Е. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов.
Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.
На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название обратная генетика.
При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку.
Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.
Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенную яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками.
Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.
С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками.
Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика, позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.
Методы генетической инженерии разнообразны и позволяют сегодня провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний, создавать новые виды микроорганизмов, растений и животных.
Технология рекомбинантных ДНК основана на следующих методах:
- специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
- быстрое секвенирование всех нуклеотидов на очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
- конструирование рекомбинантной ДНК;
- гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
- клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
- введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Загрузка...
