Периферический отдел обонятельной системы. биполярные хеморецепторные клетки. опорные и базальные клетки.

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

Полная или частичная потеря обоняния сопровождает многие случаи коронавирусной инфекции COVID-19 и часто является единственным специфическим симптомом. Но точный механизм потери обоняния по-прежнему остается неизвестным. Международная группа ученых смогла получить и проанализировать образцы обонятельной области у людей, скончавшихся от COVID-19.

Важно, что во всех случаях биопсия была взята в кратчайшие сроки после смерти. Ученые обнаружили, что реплицирующийся вирус SARS-CoV-2 преимущественно поражает поддерживающие клетки обонятельной области, а не сами обонятельные нейроны.

Авторы предполагают, что из-за недостаточной функции поддерживающих клеток обонятельные нейроны не могут нормально работать, следствием чего и является потеря обоняния.

Симптомы, которые возникают при COVID-19, традиционно связывают с респираторными заболеваниями: высокая температура, сухой кашель, насморк, одышка. Но некоторые симптомы встречаются чаще, чем при простых ОРВИ.

Один из них — полная или частичная потеря обоняния у некоторых пациентов (есть данные, что примерно для 25% это первый симптом заболевания, см. R. Kaye et al., 2020. COVID-19 Anosmia Reporting Tool: Initial Findings).

Примерно у половины она наблюдается в ходе заболевания (разные метаанализы дают немного разные оценки распространенности этого симптома; например, в статье M. Aziz et al., 2021. The Association of «Loss of Smell» to COVID-19: A Systematic Review and Meta-Analysis на основе учета 11 074 пациентов из 51 исследования получили оценку 52%, а в статье J.

 Saniasiaya et al., 2020. Prevalence of Olfactory Dysfunction in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19): A Meta-analysis of 27,492 Patients на основе учета 27 492 пациентов из 83 исследований — 47,85%).

Несмотря на то, что это состояние кажется неопасным (что в том числе приводит к тому, что у нас нет достаточного количества данных о его встречаемости в некоторых регионах мира, например в Восточной Азии), нарушение обоняния может долго сопровождать людей, переболевших COVID-19. Это безусловно снижает качество жизни и может иметь более серьезные долговременные последствия (например, увеличить риск пищевого отравления).

Слизистая носовой полости состоит из двух областей.

Дыхательная область покрыта дыхательным эпителием, который содержит бокаловидные клетки (выделяют слизь, необходимую для защитной функции носового секрета), реснитчатые клетки (они продвигают носовой секрет и способны выводить попавшие в него патогены), а также базальные клетки, которые обеспечивают восстановление слизистой оболочки. Под ними располагается базальная мембрана и собственная пластинка (lamina propria), состоящая из рыхлой соединительной ткани. Лишь небольшую часть полости носа занимает обонятельная область. У человека это островки общей площадью 2–4 см2, которые располагаются на задней стенке носовой полости. Слизистая обонятельной области состоит из трех основных типов клеток: собственно обонятельных нейронов, дендриты которых покрыты ресничками, взаимодействующими с молекулами, а также поддерживающих клеток (sustentacular cell), выполняющих структурную функцию, и базальных клеток, которые способны к делению и дифференцировке как в поддерживающие клетки, так и в обонятельные нейроны (рис. 2). Под базальными клетками располагается собственная пластинка. Сигнал от обонятельных нейронов через их аксоны, проходящие через решетчатую пластинку, направляется в обонятельную луковицу. Она представляет собой отдел мозга и покрыта мозговыми оболочками: мягкой, а затем паутинной, прилегающей к твердой оболочке. В обонятельной луковице происходит образование синапсов с митральными клетками (см. mitral cell), через которые стимулы поступают в первичную обонятельную кору, миндалину и гипоталамус. Это приводит к ощущению запаха, а также различным эмоциям и поведению, связанными с ним.

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

Несмотря на то, что нарушение обоняния — это распространенный синдром при COVID-19, точный механизм его развития остается неизвестным, и, вероятно, зависит от множества факторов. Самые очевидные из них — это воспаление слизистой оболочки носовой полости, что неудивительно, так как SARS-CoV-2 зачастую попадает в организм через клетки дыхательного эпителия.

Но что происходит с обонятельным эпителием? Для входа в клетку вирусу необходимо присутствие рецептора ACE2, а также протеазы TMPRSS2. Рецептор ACE2 присутствует на поверхности разнообразных клеток различных органов, в том числе и центральной нервной системы.

Поэтому потенциально вирус может поражать и повреждать как сами обонятельные нейроны, так и клетки обонятельной луковицы.

Летом 2020 года вышло исследование, посвященное возможности вируса проникать в различные элементы обонятельной системы (D. Brann et al., 2020. Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia).

Авторы проанализировали уже опубликованные результаты секвенирования РНК отдельных клеток обонятельной системы человека. Этот метод позволяет разделить ткани и органы на различные группы клеток в зависимости от экспрессирующихся в них генов.

Они обнаружили, что белок ACE2 экспрессируется преимущественно в поддерживающих и базальных клетках обонятельного эпителия, а также в клетках, окружающих кровеносные сосуды, но не в нейронах. Тем не менее, дальнейшее исследование в рамках данной публикации проводилось преимущественно на мышах и не включало в себя эксперименты с заражением SARS-CoV-2.

Поэтому для подтверждения этого наблюдения требовались дальнейшие эксперименты, желательно с задействованием биопсии пациентов, больных COVID-19. Именно такой подход использовали в своей работе исследователи из Бельгии, Германии и США. Статья с ее описанием была опубликована в недавнем выпуске журнала Cell.

Получить биопсии обонятельной области оказалось довольно сложным занятием. Во-первых, при макроскопическом исследовании (с помощью носовых зондов) различить обонятельную и дыхательную область очень трудно.

Более того, у человека, в отличие от мышей, она состоит из отдельных труднодоступных островков, запрятанных в носовых раковинах.

И если получить биопсию обонятельной области еще возможно, хоть и с примесью дыхательного эпителия, то получить образец обонятельной луковицы у живого человека практически невозможно из-за труднодоступности и необходимости разрушить решетчатую пластинку решетчатой кости.

Образцы можно собрать у пациентов post mortem, однако нужно учитывать, что обычно за время от смерти пациента до вскрытия ткани уже начинают разрушаться. Таким образом, авторам исследования потребовалось создать протокол, который позволит получить эти образцы как можно быстрее после смерти пациента.

Как только фиксировалась смерть пациента, предварительно подписавшего согласие на использование своего биоматериала в исследованиях, врачи должны были позвонить дежурной команде отоларингологов. Они использовали эндоскопическую систему, которая обычно используется для операций на основании черепа.

Для сбора слизистой обонятельной области они отделяли носовые раковины, а также обонятельную луковицу. Весь процесс занимал не больше полутора часов, что гораздо меньше, чем стандартное время получения образцов при вскрытии.

Всего удалось получить образцы от 68 пациентов, скончавшихся от ковида, 15 контрольных пациентов и двух пациентов, которые ранее болели COVID-19, но умерли позже от других причин.

Теперь перед исследователями стояли две задачи. Первая — увидеть различные типы клеток в слизистой обонятельной области и обонятельной луковице. Для этого они использовали метод гибридизации РНК in situ.

С помощью этого метода можно пометить отдельные молекулы РНК в клетке с помощью ДНК-зонда, комплементарной целевой молекуле. Использовался улучшенный метод RNAscope, который позволяет увидеть отдельные молекулы РНК в виде точки на микрофотографии (рис. 3).

Кроме того, в том же самом образце можно определить расположение белков, специфических для каждого типа клеток с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

Вторая задача — определить присутствие SARS-CoV-2 в клетках разных типов. Для этого также использовали зонды RNAscope к различным РНК вирусного происхождения и окрашивание вирусного нуклеокапсида. Вирус присутствовал у 30 пациентов из 68 исследованных.

Все (кроме одного) «информативные» случаи — пациенты, которым диагностировали COVID-19 в пределах 16 дней до смерти.

В слизистой дыхательной области вирус в основном определялся в реснитчатых клетках и, в некоторых случаях, в клетках выстилки протоков желез слизистой, причем в трех случаях это были единственные клетки, где был обнаружен вирус (рис. 4, K, L).

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

В 6 из 30 «информативных» случаев вирус обнаружили в клетках слизистой обонятельной области (рис. 5).

Авторы использовали большое количество различных маркеров обонятельных нейронов для того, чтобы детально изучить распределение вируса: мРНК ANO2, CNGA2, GNAL, GNG13, OMP, а также генов обонятельных рецепторов и белок TUBB3. Это позволило детально изучить распределение вируса в слизистой.

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

Пациент №8 умер от коронавирусной инфекции через 4 дня после постановки диагноза. Полученные от него образцы слизистой обонятельной области оказались самыми информативными. Авторы обнаружили, что клетки обонятельных нейронов не содержат следы нуклеокапсидного белка вируса. В тканях этого пациента этот белок присутствовал преимущественно в поддерживающих клетках (рис.

 5, D, Е), которые экспрессируют соответствующие маркеры UGT2A1 и ERMN. Интересно, что в инфицированных клетках интенсивность сигнала ниже. Это связано с тем, что инфекция SARS-CoV-2 приводит к снижению уровня трансляции и транскрипции клеток. Особенно это видно на примере рис.

 5, F: поддерживающая клетка заполнена сигналом от нуклеокапсидного белка вируса, а также РНК SARS-CoV-2-orf1ab-sense, но в ней отсутствуют сигнал от мРНК GPX3 (глутатион пероксидазы), характерный для поддерживающих клеток и клетки Боуменовой железы.

Поддерживающие клетки способны к фагоцитозу, поэтому использование нуклеокапсидного белка и антисмысловой РНК вируса показывает, что в них действительно находятся реплицирующиеся вирусные частицы, а не просто захваченный мусор.

Несмотря на все усилия, авторы не обнаружили признаков вируса в обонятельных нейронах: ни окрашиванием белка нуклеокапсида, ни поиском соответствующих вирусных РНК. На срезе слизистой обонятельной области (рис.

 5, G–I) видно, что сигнал от вирусных РНК находится во внешнем слое и совпадает с клетками, где экспрессируется белок KRT8 — маркер поддерживающих клеток.

Клетки нижнего слоя, соответствующие мРНК обонятельных рецепторов, находятся ниже и не совпадают с сигналом от вирусной РНК. Авторы провели такой же анализ биопсий других пациентов.

У двоих из них было невозможно изучить материал по причине повреждения, однако анализ сохранного материала показал такие же результаты. Это подтверждает результаты анализа мРНК обонятельной системы, показывающего, что обонятельные нейроны не инфицируются SARS-CoV-2.

Наконец были исследованы образцы обонятельной луковицы. Авторы использовали в качестве маркеров белки SSTR2A (маркер паутинной и мягкой оболочек головного мозга, покрывающих обонятельную луковицу) и TUBB3 (который экспрессируется в нейронах), а также мРНК PECAM1, которая экспрессируется в выстилке сосудов.

В 11 случаях из 30 были обнаружены следы присутствия вируса, однако он поражал только клетки мягкой оболочки головного мозга, состоящей из соединительной ткани, а также выстилку сосудов — известную мишень SARS-CoV-2. В паренхиму обонятельной луковицы, где располагаются нейроны и их синапсы, вирус не попадает (рис. 6).

Периферический отдел обонятельной системы. Биполярные хеморецепторные клетки. Опорные и базальные клетки.

Из всех полученных результатов авторы делают вывод, что SARS-CoV-2, вероятно, не поражает обонятельные нейроны заболевших, и что его основной мишенью являются поддерживающие клетки обонятельной области.

Учитывая, что эти клетки выполняют множество функций (не только структурную, но и функции фагоцитоза и выведения токсичных веществ), причем многие из этих функций практически не изучены у человека, не исключено, что заражение этих клеток и нарушение их работы приводит к нарушению функции нейронов.

Читайте также:  Репаглинид - инструкция по применению, аналоги, отзывы и формы выпуска (таблетки 0,5 мг, 1 мг и 2 мг) препарата для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета у взрослых, детей и при беременности и алкоголь

Эти результаты подтверждают ранние сообщения о том, что именно эти клетки экспрессируют рецептор ACE2.

Тем не менее, полученные результаты противоречат более ранним публикациям, которые описывали заражение обонятельных нейронов.

Например, немецкие исследователи обнаружили наибольший уровень вирусной РНК у пациентов, скончавшихся от COVID-19, в слизистой обонятельного поля ровно под решетчатой пластинкой и обонятельной луковицей (J. Meihard et al., 2021.

Olfactory transmucosal SARS-CoV-2 invasion as a port of central nervous system entry in individuals with COVID-19). Вирусная РНК детектировалась с помощью РНК гибридизации in situ, а вирусные частицы — с помощью электронной микроскопии.

Распределение вирусных частиц в различных типах клеток слизистой обонятельной области изучали с помощью окрашивания антителами к маркерам обонятельных нейронов и к S-белку SARS-CoV-2, а последнее может неспецифично взаимодействовать с другими антигенами, приводя к артефактам. Кроме того, отсутствовали данные о возможной репликации вируса в обонятельных нейронах.

Авторы учитывают возможность того, что обонятельные нейроны могут быть инфицированы у некоторых пациентов или на каком-то этапе заболевания.

На самом деле утверждение, что SARS-CoV-2 не способен заражать нейроны, — это очень смелое заявление, особенно в свете существования немалого количества работ о способности вируса проникать в нервную ткань.

Одно из примечательных исследований — работа американских биологов, которая продемонстрировала возможность заражения использованием клеточных органоидов мозга, которые хорошо отражают процессы, происходящие в организме (E. Song, C. Zhang et al., 2021.

Neuroinvasion of SARS-CoV-2 in human and mouse brain). Поэтому явно требуется дальнейшее изучение не только того, какие клетки заражает SARS-CoV-2, но и какие последствия это имеет для пациентов.

Также пока непонятно следующее: раз SARS-CoV-2 не поражает обонятельные нейроны, то как же вирусные частицы попали в мягкую оболочку, окружающую обонятельную луковицу? Авторы считают, что обнаруженные вирусные частицы — это целые вирусы, которые не обязательно находятся в клетке, ведь РНК реплицирующихся вирусов они не обнаружили. Вирусы попали туда либо через спинномозговую жидкость, передвигаясь вдоль поверхности, но не внутри аксонов обонятельных нейронов, либо уже из крови пациентов, «протиснувшись» через сосуды мозговых оболочек.

Обсуждаемое исследование оставляет и другие вопросы. Как поражение поддерживающих клеток влияет на обонятельные нейроны? Может ли все же вирус попадать в головной мозг через них? И конечно же, как эти результаты могут помочь переболевшим SARS-CoV-2 восстановить обоняние?

Источник: M. Khan et al. Visualizing in deceased COVID-19 patients how SARS-CoV-2 attacks the respiratory and olfactory mucosae but spares the olfactory bulb // Cell. 2021. DOI: 10.1016/j.cell.2021.10.027.

Екатерина Грачева

Роль базальных клеток обонятельного эпителия в нейрогенезе

Обонятельная слизистая оболочка является оптимальным источником аутологичных нейральных стволовых клеток для трансплантации при повреждениях и дегенеративных заболеваниях ЦНС. В качестве возможных кандидатов для заместительной терапии рассмотрены обкладочные нейроэпителиальные, горизонтальные и шаровидные базальные клетки.

Обкладочные нейроэпителиальные клетки способствуют аксональной регенерации нейронов и ремиелинизации аксонов, но не относятся к стволовым. Горизонтальные и шаровидные базальные клетки являются единственными мультипотентными прогениторами обонятельного эпителия.

Они способствуют возобновлению нейрональных и не нейрональных клеток, как в норме, так и при восстановлении после травмы нервной ткани. Имеются экспериментальные данные и о существовании мезенхимоподобных стволовых/ прогениторных клеток в базальной мембране обонятельной слизистой.

Нейральные клетки взрослого обонятельного эпителия способны дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлении, причем из них возможно получение нейронов различного типа.

Ткань обонятельной слизистой оболочки является потенциальным источником аутологичных нейральных стволовых клеток для заместительной клеточной терапии при патологии ЦНС.

Существуют работы, в которых проведена экспериментальная трансплантация как ткани обонятельного эпителия в целом в поврежденные отделы ЦНС [1], так и отдельных, входящих в состав обонятельной слизистой оболочки мультипотентных клеток, предварительно культивированных in vitro.

Так, обкладочные нейроэпителиальные клетки, пересаженные в поврежденные участки спинного мозга, демонстрировали стимуляцию его восстановления и способность поддерживать ремиелинизацию демиелинизированных аксонов [2, 3], хотя в отдельных работах была продемонстрирована невысокая эффективность их применения [4].

Другими авторами показано более целесообразное использование стволовых клеток обонятельного эпителия для улучшения функции мозга после повреждения.

При трансплантации дофаминэргических нейронов, полученных in vitro из стволовых клеток обонятельного эпителия, крысам с моделированной болезнью Паркинсона, наблюдалось уменьшение поведенческой асимметрии и увеличение числа дофаминэргических клеток в головном мозге [5]. Пересаженные шаровидные базальные клетки, выделенные с использованием моноклональных антител GBC-2, давали как нейрональное, так и не нейрональное потомство. Продуцированные ими нейроны проецировали аксоны к обонятельной луковице. Напротив, горизонтальные базальные клетки не прививались у мышей, у которых была предварительно удалена фракция шаровидных клеток [6].

Таким образом, эффективность трансплантации мультипотентных клеток обонятельного эпителия во многом зависит от характеристик используемых клеток.

В связи с этим, исследование типов стволовых и прогениторных нейральных клеток обонятельной слизистой оболочки, их морфологических особенностей, а также участия в регенерации в физиологических условиях, является актуальной задачей клеточной трансплантологии.

Мультипотентные клетки обонятельной слизистой оболочки

Обонятельный нейроэпителий млекопитающих известен своей уникальной особенностью активно генерировать нейроны во взрослом состоянии, такими темпами, которые намного превышают нейрогенез в субвентрикулярной зоне и зубчатой извилине [7–13]. F.J. Roisen и соавторы (2001) выделили из обонятельного эпителия популяцию мультипотентных клеток.

С помощью иммунофлуоресцентного анализа было показано, что нейросферы, полученные из данных клеток, содержали как нейрональные, так и глиальные клеточные линии, а около 10% клеток были отрицательными по всем известным нейрональным и глиальным маркерам. Авторы предположили, что немаркируемые клетки относятся к пулу прогениторов и некоммитированных клеток [14].

Культура сохраняла митотическую активность более 8 месяцев (около 70 пассажей).

Слизистая оболочка обонятельной области формируется обонятельным эпителием (olfactory epithelium – OE) и базальной пластинкой (lamina propria – LP), слоем рыхлой соединительной ткани, расположенным ниже эпителия.

Обонятельный эпителий является псевдомногослойным нейроэпителием и содержит единственный тип нейронов – биполярные нейроны обонятельных рецепторов (olfactory receptor neurons – ORN) [15, 16] (рис. 1). B.P. Menco и J.E.

Jackson в 1997 году показали, что в состав обонятельного эпителия, помимо нейронов и таких не нейрональных клеток, как поддерживающие (sustentacular cells), клетки желез Боумена и протоков (Bowman’s glands and ducts), входят базальные клетки, расположенные на границе с базальной пластиной [17]. A. Mackay-Sim и P.W. Kittel (1990) и J.P.

Hind с соавт. (1984) было установлено, что данные клетки играют ключевую роль в механизмах дегенерации и регенерации в обонятельном нейроэпителии [18, 19].

Базальные клетки характеризовались высокой метаболической активностью, что было продемонстрировано с использованием иммуногистохимического окрашивания по ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) [20].

В обонятельном эпителии в местах локализации положительного окрашивания по PCNA трансмиссионной электронной микроскопией были обнаружены клетки с электронно-плотной цитоплазмой и наличием эухроматина, что также подтверждало их митотическую активность [21]. В исследованиях W. Murrell с соавт. (2005) мультипотентность клеток обонятельной слизистой оболочки человека и грызунов была показана как in vitro, так и in vivo при трансплантации в курином эмбрионе (генерация различных типов клеток) и при трансплантации в костный мозг облученных животных [22].

Помимо базальных клеток, регенеративную способность проявляют обкладочные нейроэпителиальные клетки (olfactory ensheathing cells – OECs,) которые находятся в базальной пластинке и защищают аксоны ORNs, проходящие из обонятельного эпителия к обонятельной луковице.

OECs проявляют определенное фенотипическое сходство с эмбриональными Шванновскими клетками, но имеют некоторые функциональные различия.

Они не относятся к стволовым, однако могут постоянно поддерживать аксональную регенерацию нейронов обонятельных рецепторов, а также ремиелинизацию демиелинизированных аксонов [23].

Базальные клетки обонятельного эпителия

Базальные клетки состоят из двух отдельных клеточных типов: горизонтальные (horizontal basal cells – HBCs) и шаровидные (globose basal cells – GBCs) [9, 10].

HBCs находятся наиболее базально в обонятельном эпителии, напрямую прикреплены к базальной пластине, формируя хемидесмосомы [24].

Они отличаются более темной окраской цитоплазмы и уплощенной формой, содержат значительное количество свободных цитоплазматических рибосом и слои тонофиламентов [25].

В некоторых источниках [26] горизонтальные базальные клетки именуются уплощенными клетками – flattened basal cell (FB).

В работе E.H. Holbrook с соавт. (1995) было показано, что основной особенностью расположения горизонтальных базальных клеток является их нахождение в нишах между пучками аксонов в месте их выхода из эпителия [24].

Там же отмечается крайне низкая скорость пролиферации HBCs. A. Mackay-Sim и P.W.

Kittel [18] считают HBCs настоящими стволовыми клетками, поскольку они асимметрично делятся, формируя одну горизонтальную дочернюю клетку и одну шаровидную клетку [27].

HBCs являются единственными клетками обонятельной слизистой оболочки, которые экспрессируют кератин 5 и кератин 14 [27–29], однако они «отрицательны» для нейрональных маркеров [29].

Горизонтальные базальные клетки также экспрессируют α-галактозу или α-N-ацетил галактозамин. Помимо этого, HBCs маркируются двумя дифференциальными антителами к рецепторам эпителиального ростового фактора EGF [24].

Эти характеристики также присущи базальным клеткам респираторного эпителия.

Шаровидные базальные клетки (GBC) лежат непосредственно выше слоя HBC, имеют круглую или овальную форму, более светлый и меньший, чем у HBCs, цитоплазматический матрикс [9]. По сравнению с горизонтальными базальными клетками, у них меньше тонофиламентов, значительное количество гранулярного эндоплазматического ретикулума и заметный комплекс Гольджи [30].

GBCs, напротив, обладают высокой скоростью пролиферации, о чем свидетельствует то, что подавляющее большинство взрослых клеток этой популяции отмечены включением аналогов тимидина [10, 31, 32].

Популяция шаровидных базальных клеток помимо мультипотентных прогениторов (GBCmpp) и временно амплифицирующихся клеток GBCta (transient amplifying cell – дочерние клетки, вступившие на путь дифференцировки, делящиеся более часто, чем стволовые, но обладаюшие ограниченным пролиферативным потенциалом [33]) содержит подкласс непосредственных нейрональных предшественников (GBCinp) [10]. Митотически активными являются только два первых подкласса клеток, тогда как GBCinp рассматриваются как постмитотические клетки.

До недавнего времени шаровидные базальные клетки определяли по отсутствию окрашивания другими маркерами, а также включением митотических индикаторов (последнее справедливо и для HBCs) [28, 30].

Однако в 1996 году были получены моноклональные антитела, которые действуют с GBCs обонятельного эпителия крыс [34].

Помимо общих маркеров GBC, например, моноклональных антител GBC-2, не существует специфических маркеров для идентификации подклассов этих мультипотентных прогениторов.

Читайте также:  Слабое место локтевого сустава. Связки локтевого сустава. Кровоснабжение и иннервация локтевого сустава.

Эксперименты с меченым аналогом тимидина [9, 31] выявили наличие в популяции GBCs прямых предшественников нейронов ORN, что в дальнейшем было подтверждено иммунохимически наличием в ней клеток, положительных для ранних маркеров дифференцировки нейронов, таких как Mash1 и Neurogenin1 [35, 36]. Результаты исследований нейрогенеза in vitro также подтвердили, что некоторые GBCs являются непосредственными предшественниками нейронов [27]. Ретровирусное исследование клеточных линий показало, что ORNs происходят из GBCs, но не из HBCs, что привело к модели, считающей, что стволовые клетки, порождающие ORNs, проживают в популяции GBC, и что HBCs находятся за пределами происхождения ORN [37, 38]. Согласно данной модели, GBCs являются только совершенными нейронными предшественниками [39], а поддерживающие клетки, клетки Боуменовых желез и протоков, HBCs возобновляют сами себя.

Однако недавние исследования, проведенные C. Leung и cоавт. (2007) на мышах, показали, что HBCs могут регенерировать как в нейрональные, так и в не нейрональные клетки после продолжительного повреждения обонятельного эпителия под действием токсичных для обоняния реагентов [40].

Тем не менее, у интактных мышей HBCs остаются в значительной степени в бездействии, и избирательное разрушение зрелых ORNs при обонятельной бульбэктомии не влияет на поведение HBCs.

Таким образом, было высказано предположение, что в нормальных условиях онтогенеза нейронов, а также после избирательной гибели нейронов, GBC прогениторы являются достаточными для регенерации обонятельного эпителия, и только в случае более значительного повреждения HBCs становятся активными и восстанавливают обонятельный эпителий [40]. Эти выводы, однако, подняли вопрос, являются ли эти регенеративные возможности HBCs нормальным физиологическим процессом или, скорее, аномальной дифференцировкой [15].

В работе N. Iwai с соавт. (2008) была продемонстрирована способность HBCs давать начало всем типам клеток – нейрональным и не нейрональным – во взрослом обонятельном эпителии [41].

Более того, наличие клеток, полученных из HBC во взрослом состоянии и создание крупных кластеров из HBCs при истощении зрелых ORN, подтверждает наличие долгоживущих мультипотентных прогениторов в популяции HBC, которые поддерживают в нормальном состоянии обонятельный эпителий как в норме, так при его восстановлении после травмы.

Данные, полученные группой исследователей [41], отличались от результатов С.К. Leung et al. [40], которые наблюдали кластеры полученных из HBC нейронов и не нейрональных клеток только после обширной травмы и разрушении поддерживающих клеток, ORNs и большинства GBCs. Вероятно, это расхождение связано с разницей используемых экспериментальных систем маркирования клеток. Leung et al.

использовали тамоксифен-индуцируемую Creактивацию системы, в результате одновременно маркировалось только около 10% всех HBCs [40]. N. Iwai [41], с другой стороны, использовали конститутивную активность Cre-системы (Cre reporter activity), которая позволила одновременно оценить примерно 70% HBCs.

Поскольку подавляющее большинство клеток, полученных из HBC, были нейрональными, N. Iwai с соавт. [41] высказали предположение, что и в нормальном, и в травмированном обонятельном эпителии основным направлением деятельности HBCs является производство GBCs и, в конечном итоге, ORNs.

HBCs не являются единственным источником мультипотентных прогениторов в обонятельном эпителии.

Ряд исследований полагают, что мультипотентные прогениторы популяции GBCs после повреждения тканей, могут генерировать как нейрональные, так и не нейрональные клетки [42–44].

Кроме того, следует учитывать, что HBCs не наблюдаются до конца эмбриогенеза [24, 45, 46], тогда как GBCs присутствуют уже на 10 день эмбриогенеза [47], предполагая, что HBCs могут образовываться из GBCs в эмбриональном обонятельном эпителии.

Таким образом, во взрослом обонятельном эпителии HBCs и GBCs содержат группы мультипотентных прогениторов, имеющих аналогичные возможности, но преимущественно функционирующие в различных условиях.

В нормальном обонятельном эпителии с устойчивым спросом на новые нейроны главной рабочей силой по поддержанию обонятельного эпителия являются мультипотентные GBCs, в то время как мультипотентные HBCs играют вспомогательную роль.

Однако при повреждении эпителия, мультипотентные HBCs становятся наиболее важными для улучшения регенерации эпителия (рис. 2).

Гистология. Полный курс за 3 дня

Обонятельный анализатор состоит, как любой, из центрального и периферического отделов.

Периферический отдел обонятельного анализатора представлен обонятельным полем – обонятельной выстилкой, которая находится на средней части верхней носовой раковины и соответствующем участке слизистой оболочки перегородки носа.

Обонятельный эпителий содержит рецепторные клетки. Их центральные отростки – аксоны – передают информацию в обонятельную луковицу. Обонятельные рецепторы являются первым нейроном обонятельного пути и окружены опорными клетками.

Тело обонятельной клетки содержит многочисленные митохондрии, цистерны эндоплазматической сети с рибосомами, элементы комплекса Гольджи, лизосомы.

Обонятельные клетки, кроме центральной, имеют также короткий периферический отросток – дендрит, заканчивающийся на поверхности обонятельного эпителия сферическим утолщением – обонятельной булавой диаметром 1 – 2 мм.

В ней присутствуют митохондрии, мелкие вакуоли и базальные тельца, отходящие от вершины булавы несколько обонятельных волосков длиной до 10 мм, имеющих строение типичных ресничек.

В подэпителиальной соединительной ткани расположены концевые отделы боуменовых желез, кровеносных сосудов, а также пучки безмиелиновых нервных волокон обонятельного нерва. Слизь, которая секретируется боуменовыми железами покрывает поверхность обонятельной выстилки.

В процессе хемовосприятия участвуют обонятельные реснички, погруженные в слизь.

Обонятельный нерв – совокупность тонких обонятельных нитей, проходящих через отверстие в решетчатой кости в мозг к обонятельным луковицам. Кроме безмиелиновых волокон, в соединительно-тканном слое обонятельной выстилки проходят отдельные миелиновые волокна тройничного нерва.

Рецепторные клетки обонятельной выстилки регистрируют 25 – 35 запахов.

Их комбинации образуют много миллионов воспринимаемых запахов. Обонятельные рецепторные нейроны в ответ на адекватную стимуляцию деполяризуются. В плазмолемму обонятельных ресничек встроена цАМФ-зависимые воротные ионные каналы, открывающиеся при взаимодействии с цАМФ.

ЦАМФ-зависимые воротные каналы активируются в результате последовательности событий – взаимодействия с белком-рецептором в плазмолемме обонятельных ресничек, активации G-белка, повышения активности аденилатциклазы, увеличения уровня цАМФ.

К механизму хемовосприятия в органе обоняния имеет также отношение система инозитолтрифосфата.

При действии некоторых пахучих веществ быстро возрастает уровень инозитолтрифосфата, который взаимодействует с кальциевыми каналами в плазмолемме обонятельных рецепторных нейронов.

Таким образом, системы вторичных посредников цАМФ и инозитолтрифосфата взаимодействуют между собой, обеспечивая лучшее восприятие различных запахов.

Через цАМФ-зависимые воротные ионные каналы внутрь клетки проходят не только одновалентные катионы, но и ионы кальция, который связывается с кальмодулином. Образовавшийся при этом комплекс «кальций – кальмодулин» взаимодействует с каналом, что препятствует активации цАМФ, в результате чего рецепторная клетка становится нечувствительной к действию пахучих веществ-раздражителей.

Продолжительность жизни обонятельных клеток составляет около 30 – 35 дней. Обонятельные рецепторы составляют исключение среди всех других нейронов, они обновляются за счет клеток-предшественников – базальных клеток эпителия обонятельной выстилки.

Опорные клетки. Среди них различают высокие цилиндрические и клетки меньших размеров, не достигающие поверхности рецепторного слоя. Цилиндрические клетки на апикальной поверхности содержат микроворсинки длиной 3 – 5 мкм. Кроме хорошо развитых органелл общего значения, опорные клетки в апикальной части содержат множество секреторных гранул.

Получение нейросфер и нейрональных прогениторных клеток из обонятельного эпителия

Использование стволовых клеток в терапевтических целях является перспективным направлением для различных областей медицины, в том числе связанных с лечением нарушений функций центральной и периферической нервных систем. В его основе лежит выбор подходящего источника аутологических и прогениторных клеток.

По мнению многих исследователей, таким источником может быть обонятельный эпителий (ОЭ) полости носа [1—3], содержащий в своем составе прогениторные клетки, которые в процессе культивирования in vivo сохраняют способность к непрерывному образованию нейросфер, которые, в свою очередь, являются основным материалом для клеточной терапии.

ОЭ представляет собой нейрональную ткань, клетки которой способны к регенерации. В этой ткани происходит постоянное обновление мультипотентных клеток с их дифференциацией в зрелые нейроны. Анатомическое расположение ОЭ в полости носа определяет его доступность.

На сегодняшний день это единственный источник аутологических нейральных стволовых прогениторных клеток, которые могут быть использованы для изучения патогенеза обонятельных расстройств [4], психических и неврологических заболеваний [3], а также обкладочных глиальных клеток, трансплантация которых открывает новые перспективы в лечении травматических повреждений спинного мозга и периферических нервов. Аутологичные нейральные стволовые клетки и прогениторные клетки являются мультипотентными предшественниками и способны дифференцироваться во все типы клеток ОЭ, в том числе в зрелые нейроны, а также в глиальные клетки. Обкладочные клетки (ensheathing cells) выполняют разнообразные функции: создают микроокружение для нейронов, способствуют росту аксонов и ремиелинизации нервных волокон. В последнее время большие надежды возлагаются на использование клеточных моделей, созданных на основе стволовых клеток, для проведения фундаментальных исследований (поиск молекулярных маркеров заболевания, изучение функций генов, выявление генетических дефектов и их репарация с помощью инновационной технологии геномного редактирования). Успешность создания таких моделей прямым образом зависит от получения достаточного количества материала, отбираемого у одного пациента, и возможности включения в исследование большого числа образцов. Стволовые технологии подразумевают междисциплинарный подход в решении поставленных задач и во многом зависят от качества выполнения каждого этапа исследования. Оториноларинголог является первым звеном в цепи сложных научных изысканий по получению стволовых клеток из ОЭ полости носа. Передняя риноскопия, эндоскопическое исследование полости носа и ольфактометрическое тестирование позволяют провести отбор пациентов по ранее определенным параметрам. Оториноларинголог, выполняя свой этап работы, проводит хирургические манипуляции в обонятельной области полости носа, которая распространяется от нижнего края средней носовой раковины до свода полости носа. Эпителиальный покров слизистой оболочки в этой области состоит из обонятельных биполярных клеток, представленных веретенообразными, базальными и поддерживающими клетками [5]. Распределение О.Э. в обонятельной области полости носа не однородно и может варьировать от 10 до 90% [6]. Исследования, проведенные на аутопсийном материале, показали, что ОЭ был обнаружен в 83% образцов, взятых из верхней носовой раковины, и только в 17% — из средней носовой раковины [7]. Но следует отметить, что эти данные не отражают концентрацию ОЭ в слизистой оболочке изученных локусов полости носа.

Читайте также:  Простейшие - статьи для изучения по медицинской микробиологии

Несмотря на то что назальная биопсия является стандартной процедурой для оториноларинголога, получение культур клеток из биоптата зависит от многих условий и факторов.

Выбор места забора биоптата должен соответствовать критериям безопасности для больного и соответствовать максимально возможной концентрации клеточного материала, необходимого для выполнения последующих этапов работы.

Рутинный характер работы подразумевает проведение данной хирургической манипуляции под местной анестезией. В этой связи забор биоптата слизистой оболочки верхней носовой раковины накладывает ряд объективных ограничений.

Цель исследования — определение наиболее оптимального локуса в полости носа для забора биологического материала, служащего источником прогениторных нейрональных клеток.

Исследование проведено в рамках проекта, связанного с изучением молекулярно-генетических аспектов особенностей мышления больных шизофренией и психически здоровых людей.

Под нашим наблюдением находились 45 человек (21 женщина и 24 мужчины в возрасте от 22 до 45 лет), которые были разделены на две клинические группы. В 1-ю группу были включены 30 пациентов с искривлением перегородки носа и вазомоторным ринитом, поступившие на хирургическое лечение в ГБУЗ НИКИО им. Л.И.

Свержевского (Москва). 2-ю группу (15 человек) составили больные шизофренией, которые находились на стационарном лечении в ГКУЗ ПКБ № 1 им. Н.А. Алексеева (Москва) и были включены в исследование после клинического состояния.

Критерии включения: пациенты без нарушения обонятельной функции носа, возраст от 18 до 45 лет, образование не менее 9 классов, европейское происхождение (желательно этнически русские), отсутствие тяжелых соматических заболеваний.

Критерии исключения: наличие сопутствующих тяжелых неврологических и соматических заболеваний, сотрясение головного мозга в анамнезе, аллергический ринит, острый и хронический синусит.

Протокол исследования и образец информированного согласия были одобрены Этическим комитетом ФГБНУ НЦПЗ.

Следуя установленным критериям включения, всем пациентам проводилось ольфактометрическое исследование в соответствии с обонятельной шкалой Bernstein (рис. 1).

Рис. 1. Набор пахучих веществ, воздействующих на обонятельный рецептор.

Нашу работу мы условно разделили на два этапа. На первом этапе у пациентов 1-й группы изучали концентрацию нейрональных прогениторов в слизистой оболочке в трех локусах полости носа, легко доступных в рутинной практике оториноларинголога.

Локус, А — слизистая оболочка перегородки носа на уровне прикрепления переднего конца нижней носовой раковины, локус В — передний отдел медиальной поверхности средней носовой раковины в месте ее крепления к латеральной стенке полости носа и локус С — верхний отдел перегородки носа, находящийся напротив локуса В (рис. 2).

Рис. 2. Точки забора слизистой оболочки полости носа в изучении концентрации нейрональных прогениторных клеток. Локус, А — *, локус В — ** и локус С — ***.

У пациентов 1-й группы забор биологического материала проводили по завершении септопластики носовыми биопсийными щипцами под визуальным контролем ригидными эндоскопами Carl Storz, HOPKINS II 0°, 4 мм (Германия). Размер биоптата в каждом исследовании был идентичен и не превышал 2 мм в диаметре.

Далее перегородку носа шинировали оригинальными септальными стентами, которые фиксировали по методике А.И. Крюкова и соавт. [8]. На завершающем этапе распатором подслизисто разрушали кавернозную ткань нижних носовых раковин.

Полость носа тампонировали силиконовыми секционными гидротампонами, которые удаляли через 24 ч после операции [9].

Отобранный материал помещали в пробирку, содержащую 1 мл среды DMEM/HAM F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (10%) и антибиотика (1%). Образцы доставляли в лабораторию в течение 3 ч после отбора биопсии. Информация о локусе забора биопсии не раскрывалась до завершения экспериментов (слепой метод).

Образец эпителия промывали в среде DMEM/HAM F12, далее помещали в чашку Петри с раствором реагента для диссоциации клеток (диспаза) и инкубировали 1 ч при 37 °C. Здесь и далее во все среды добавляли 1% раствор антибиотика. Под микроскопом отделяли эпителий от собственной пластинки (lamina propria) и разделяли на 3—4 фрагмента толщиной не более 0,5 мм.

Каждый фрагмент помещали в отдельную лунку 6-луночного планшета, покрывали сверху покровным стеклом, в каждую лунку добавляли 1,5 мл среды DMEM/HAM F12 с 10% FBS. Планшет помещали в СО2-инкубатор (5% СО2, 37 °С) на 14—18 дней, смену среды проводили каждые 3—4 дня для получения не менее 10 000 клеток.

Каждую клеточную популяцию, полученную из биоптата полости носа, разделяли поровну на 2 образца.

Первый использовали в качестве контроля для выявления автофлуоресценции, а второй окрашивали двумя типами антител: антитела к нейрональной молекуле клеточной адгезии (NCAM) для распознавания нейронов и их предшественников и А2B5 для распознавания предшественников олигодендроцитов («BioLegend», США) по протоколу, предложенному производителем.

Затем проводили анализ образцов на проточном цитометре MoFlo XDP («Beckman Coulter Inc.», США). Нейросферы, полученные из образцов ОЭ, окрашивали антителами на βIII-tubulin, MAP2 («BioLegend», США), которые являются цитоплазматическими маркерами нейронов, и флуоресцентным красителем DAPI («Invitrogen», США) для выявления ядер. Микроскопическое исследование окрашенных нейросфер проводили на конфокальном микроскопе A1R Nikon Ti («Nikon», Япония) с увеличением ×20.

После выявления локуса полости носа с наибольшей концентрацией ОЭ приступали ко второму этапу нашей работы. Забор биопсийного материала слизистой оболочки полости носа проводили под местной анестезией (аппликация 10% раствора лидокаина) из одного локуса у больных 2-й группы.

Для получения культуры нейросфер первичную культуру клеток, полученную эксплантным методом из биоптатов обонятельной выстилки, пересевали при помощи раствора трипсина-ЭДТА (ООО «Панэко», Россия) на культуральные флаконы, предварительно покрытые раствором поли-L-лизина («Sigma», США).

Культивирование осуществляли при помощи среды DMEM/HAM F12 c добавлением 1% раствора ITS (Gibco), 1% раствора антибиотика-антимикотика, ростовых факторов (bFGF, EGF) в концентрации 50 нг/мл.

В результате проведенных измерений на проточном цитометре не было обнаружено клеток, окрашенных A2B5. Это свидетельствует о том, что в культуре отсутствовали глиальные клетки. Для маркера NCAM был получен положительный сигнал (NCAM+) во всех анализируемых образцах.

Среднее процентное содержание NCAM+ клеток для биоптатов из локуса, А составило 7,8%; из локуса В — 42,7%; из локуса С — 18,2%.

Обнаружены значимые различия доли NCAM+ клеток в зависимости от участка носовой полости, откуда была взята биопсия, при этом статистически значимые отличия наблюдались между областями A и В (p=0,00012) и В и С (p=0,011) (рис. 3).

Рис. 3. Доля клеток, окрашенных NCAM, в биоптатах обонятельной выстилки из разных областей носовой полости.

Для того чтобы показать, что данные культуры являются источником клеток-предшественников, из них были получены нейросферы, фотографии которых представлены на рис. 4 ().

Рис. 4. Нейросфера, полученная из первичной культуры обонятельного эпителия. а — совмещенное изображение; б — окрашивание ядерным красителем DAPI; в — окрашивание на βIII-tubulin; г — окрашивание на MAP2. Полученные нейросферы были окрашены при помощи цитоплазматических маркеров βIII-tubulin и MAP2, которые являются маркерами нейронов. Во всех случаях отобранный материал был пригоден для дальнейшего анализа (см. рис. 4).

Таким образом, нейрональные клетки присутствовали во всех исследуемых участках, которые могут быть доступны при проведении биопсии в условиях местной анестезии. Однако количество этих клеток значительно различалось.

Следует отметить, что поиску участков полости носа, из которых можно проводить отбор ОЭ для получения прогениторных клеток, было посвящено несколько работ, результаты которых не являются однозначными.

Так, в раннем исследовании [10] сообщалось об отборе клеток с верхних отделов перегородки носа и примыкающей к ней поверхности средней носовой раковины, однако не упоминалась степень эффективности отбора. В работе [6] исследовали участки в верхней носовой раковине, средней носовой раковине и перегородке носа.

Вероятность обнаружения ОЭ в этих участках варьировала от 30 до 76%, наибольшее число клеток удалось выявить в участках, расположенных в верхней носовой раковине и перегородке носа. W. Winstead и соавт. [11] получали образцы ОЭ из перегородки носа, верхней носовой раковины и средней носовой раковины.

В целом прогениторные клетки были выявлены только у половины пациентов, включенных в исследование, и находились они в основном в верхней носовой раковине. B. Wrobel и соавт. [12] показали, что средняя носовая раковина является легко достигаемым и безопасным в условиях местной анестезии источником прогениторных клеток.

В недавней работе, проведенной на выборке, состоящей из 5 пациентов, у которых биопсию проводили при местной анестезии, обнаружено, что в большинстве наблюдений источником нейросфер была область перегородки носа, и только у одного человека они были обнаружены в материале, взятом из верхней носовой раковины [13].

В нашем исследовании показано, что средняя носовая раковина является более эффективной в отношении содержания прогениторных клеток, чем верхняя треть перегородки носа. Этот участок также является доступным и безопасным при отборе ОЭ при местной анестезии, что подтверждается проведением биопсии в условиях отоларингологического кабинета у 15 пациентов.

1.

При цитометрическом исследовании эксплантных культур на 10 000 клеток, выращенных из биоптатов, взятых с медиальной поверхности средней носовой раковины в месте ее крепления к латеральной стенке полости носа, процентное содержание NCAM+ клеток составило 42,7%, с верхних отделов перегородки носа напротив места прикрепления переднего конца средней носовой раковины — 18,2%, с перегородки носа на уровне прикрепления нижней носовой раковины — 7,8%.

2. Отбор обонятельного эпителия из области средней носовой раковины в условиях местной анестезии у больных шизофренией в 100% случаев позволил получить нейросферы, содержащие клетки, окрашиваемые нейрональными маркерами.

  • Полученные нами результаты могут быть использованы как в дальнейших фундаментальных исследованиях, так и в практической оториноларингологии.
  • Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056) в части, связанной с выбором места забора назальной биопсии, проведением отбора образцов, культивированием клеточных культур, и гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 17−29−02164) в части, связанной с подбором больных шизофренией для проведения биопсии и цитометрического исследования.
  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: arzamazovs@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-9540-0696

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector