Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.

Репарация — клеточный механизм коррекции повреждённой последовательности ДНК (точечные мутации, делеции, структурные нарушения и др.).

Системы репарации

• Темновая (фотореактивация): удаляются УФ-индуцированные ковалентные связи между смежными основаниями ДНК.

• Эксцизионная: удаляет неправильно спаренные или повреждённые основания из ДНК с последующим синтезом новой последовательности по неповреждённой цепи.

Состоит из 5 этапов, контролируемых множеством генов, кодирующих участвующие в репарации ферменты (эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза): распознавание дефекта, рассечение повреждённого участка, удаление «ошибочного» олигонуклеотида, синтез ДНК с использованием комплементарной цепи как матрицы, лигирование. Дефекты эксцизионной репарации регистрируют при пигментной ксеродерме, синдроме Коккейна, трихотиодистрофии.

• Рекомбинационная: для восстановления одной хромосомы используется материал гомолога. Дефекты рекомбинационной репарации регистрируют при синдроме Блума.

Гены, участвующие в репарации ДНК • 126380, ген ERCC1, 19q13.2–19q13.3. До настоящего времени его клиническое значение неясно; совместно с белками XPA и XPF (продукт гена ERCC4) участвует в процессах распознавания и вырезания дефектного участка ДНК • 126340, ген ERCC2, 19q13.2–19q13. 3.

Кодирует геликазу с неясными функциями; мутации вызывают пигментную ксеродерму типа D • 133510, ген ERCC3, 2q21. Кодирует геликазу репарации ДНК; различные мутации вызывают пигментную ксеродерму типа B, комплекс пигментной ксеродермы и синдрома Коккейна, трихотиодистрофию • 133530, ген ERCC5, 13q32–13q32, 13q33–13q33.

Мутации вызывают комплекс пигментной ксеродермы и синдрома Коккейна типа А • 133540, ген ERCC6 (CKN2), 10q11–10q21 . Мутации вызывают синдром Коккейна типа В.

Приложение. Трихотиодистрофия — наследственное заболевание с ломкостью волос и ногтей (из-за уменьшенного содержания богатых цистеином матричных белков), ихтиозиформными изменениями кожи, физической и умственной отсталостью.

Генетические аспекты: 50% пациентов имеют повышенную фоточувствительность, связанную с дефектом эксцизионной репарации ДНК (#601675, гены ERCC2/XPD и ERCC3/XPB, r).

Клиническая картина: ломкие волосы и ногти, ихтиоз, небуллёзная ихтиозиформная эритродермия, фоточувствительность, недоразвитие подкожной клетчатки, задержка физического развития, низкая масса плода при рождении, умственная отсталость, кишечная непроходимость, гипогонадизм, амастия, катаракта, микроцефалия, бронхиальная астма, контрактуры суставов, частые инфекционные заболевания. Лабораторные данные: снижение содержания богатого цистеином белка в волосах и ногтях, гипогаммаглобулинемия. Синонимы: синдром Тэя, врождённый ихтиоз с трихотиодистрофией. МКБ-10. L67.8 Другие аномалии цвета волос и волосяного стержня.

Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.

Мутации генов, участвующих в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации (HRR)

Гены HRR – это группа генов, продукты которых участвуют в процессе репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации (homologous recombination repair).

К этой группе относят, например, следующие гены:

BRCA1 BARD1 CHEK1 PALB2 RAD51C
BRCA2 BRIP1 CHEK2 PPP2R2A RAD51D
ATM CDK12 FANCL RAD51B RAD54L

Дефекты в этих генах могут приводить к нарушению репарации ДНК, увеличению геномной нестабильности и, тем самым, развитию рака (например, рака предстательной железы).

Как зарубежные, так и российские рекомендации указывают на целесообразность тестирования мутаций в некоторых генах HRR для пациентов с местнораспространенным или метастатическим РПЖ.

HRR-тестирование может выполняться в разном объеме, включая различные гены из числа участвующих в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации. Например, тест на мутации генов BRCA1/2 и ATM – частный случай HRR-тестирования.

Для чего нужно знать статус мутаций в генах HRR?

Наличие у пациента мутаций в некоторых генах HRR может сказать о многом:

Прогноз Тактика лечения Обследование родственников Внимание к другим видам рака
Результаты нескольких крупных ретроспективных исследований выявили связь между мутациями BRCA1/2 и агрессивным течением заболевания. Кроме того, наличие герминальной мутации BRCA2 оказывает негативное влияние на прогноз при мКРРПЖ. Также наблюдается плохой ответ на стандартную терапию при наличии в опухоли мутации в гене HRR. Выявление мутаций может помочь определению тактики лечения Если выявленная в гене BRCA/ATM мутация является наследственной, то целесообразно поискать ее у кровных родственников Наследственная мутация BRCA/ATM приводит к развитию не только РПЖ, но и рака грудной и поджелудочной железы

Какие биоматериалы нужно отправлять на HRR-тестирование?

На HRR-тестирование следует отправлять одновременно кровь и гистологический материал пациента.

Правила получения, хранения и транспортировки крови на HRR-тестирование – такие же, как для, например, BRCA-тестирования:

  • Кровь необходимо собрать в пробирки с консервантом ЭДТА (с фиолетовой крышкой)
  • До прибытия курьера кровь может храниться в холодильнике (при 2-8°С) до 3-х дней или в морозильнике (при ≤–18°С) – длительно
  • Кровь можно транспортировать в лабораторию при комнатной температуре до 3-х дней

Для направляемого на HRR-тестирование гистологического материала кроме общих правил изготовления, подготовки и отправки блоков (эти правила можно посмотреть на стр. 6 в этой брошюре) следует учитывать дополнительные условия:

Для тестирования пригодны любые операционные образцы и биоптаты, полученные менее 5 лет назад. Операционный материал и свежий биоптат предпочтительны для отправки (по сравнению с архивным биопсийным материалом).

Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.

Частота мутаций в генах HRR при мКРРПЖ в России доподлинно неизвестна. По данным зарубежных исследований, мутация хотя бы в одном гене HRR найдётся примерно у 27% пациентов при тестировании блока и 14% – при тестировании крови. Иными словами, около половины мутаций генов HRR при мКРРПЖ – соматические, т.е. могут быть выявлены только при тестировании материала опухоли.

Большая часть мутаций генов HRR при мКРРПЖ приходятся на ген BRCA2. Значительная доля случаев HRRm-ассоциированного мКРРПЖ приходится на мутации генов ATM, CHEK2 и CDK12.

Каким пациентам целесообразно выполнять HRR-тестирование?

Согласно действующим клиническим рекомендациям Минздрава «Рак предстательной железы»:

Генетическое тестирование на наличие герминальных мутаций [в генах, отвечающих за репарацию ДНК] рекомендуется для всех мужчин с локализованным или метастатическим раком предстательной железы высокого и очень высокого риска.

Исследование на соматические мутации в потенциале позволит получить более полные результаты по сравнению с тестированием только герминальных мутаций.

Тестирование опухоли на наличие соматических мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и других может быть рекомендовано для пациентов с местнораспространенным или метастатическим РПЖ.

В рамках Национальной Программы RUSSCO «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации с целью повышения эффективности противоопухолевого лечения» HRR-тестирование выполняется для пациентов с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы, которые получали или получают новые гормональные препараты (абиратерон/ апалутамид/ энзалутамид).

Каким методом выполняется HRR-тестирование?

В рамках Программы RUSSCO исследование HRR-мутаций выполняется методом NGS (секвенирования следующего поколения), который позволяет проанализировать все участки генов, мутации в которых могут приводить к потере их функции и, как результат, дефектам репарации путем гомологичной рекомбинации.

Если направленный в лабораторию гистологический материал пригоден для тестирования (содержит достаточное количество опухолевой ткани и позволяет получить пригодную для анализа ДНК), то HRR-тестирование выполняется по ДНК, выделенной из гистологического материала. Если поступивший в лабораторию гистологический блок для анализа непригоден, то тестирование проводится по крови.

В других лабораториях методы и материалы для исследования могут варьировать.

Нецелесообразно направлять образцы пациентов на широко распространенное исследование частых мутаций BRCA1/2 методом ПЦР, так как этот анализ выявляет в основном частые мутации в гене BRCA1, которые редки при раке предстательной железы.

Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.

Список литературы:

  1. Министерство здравоохранения РФ. Клинические рекомендации. Рак предстательной железы. 2020.
  2. Castro E, et al. Eur Urol. 2015; 68: 186-193.
  3. Castro E, et al. J Clin Oncol. 2013; 31: 1748-1757.
  4. Mohler JL, et al. Prostate Cancer, Version 2.2019, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 2019; 17, 479-505.
  5. Robinson D, Van Allen EM, Wu YM, et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 2015; 161(5): 1215-28.
  6. Grasso CS, Wu YM, Robinson DR, et al. The mutational landscape of lethal castration-resistant prostate cancer. Nature. 2012; 487(7406): 239-43.
  7. Annala M, et al. Cancer Discovery. 2018. doi:10.1158/2159-8290.CD-17-0937.

 Войтив базу данных

Для того, чтобы отправить материал на диагностику, вы должны быть зарегистрированным пользователем. Если у вас уже есть логин и пароль, то повторная регистрация не требуется.

Регистрацияв программе

Если вы новый пользователь, пожалуйста, пройдите процедуру регистрации.

К вопросу о механизмах репарации днк в клетке

Хестанова, М. С. К вопросу о механизмах репарации днк в клетке / М. С. Хестанова, С. Р. Кертанов, Е. А. Хестанова, Г. Г. Макиев. — Текст : непосредственный // Молодой ученый. — 2020. — № 3 (293). — С. 113-115. — URL: https://moluch.ru/archive/293/66334/ (дата обращения: 13.04.2022).



В данной статье обоснована необходимость более детального изучения механизмов репарации ДНК в клетках для обоснования этиологии и возможных генно-инженерных методов лечения различных заболеваний.

Ключевые слова: ДНК, репарация ДНК, прямая репарация, эксцизионная репарация, ДНК-лигазы, SOS-репарация.

Читайте также:  Цитозоль. Состав цитозоля. Содержимое цитозоля.

Обмен нуклеотидов, в частности ДНК, является ключевым для нормальной жизнедеятельности клетки. Поэтому для поддержания гомеостаза клетки весьма необходима стабильная защита генома от спонтанных мутаций и случайных поломок.

  • Согласно имеющимся оценкам, в каждой клетке человеческого тела в сутки происходят десятки тысяч событий повреждений ДНК. Эндогенные повреждения в основном относятся к следующим категориям:
  • 1) ошибочное включение в геном урацила или спонтанное деаминирование цитозина;
  • 2) гидролиз или окисление любого из четырёх оснований активными формами кислорода, гормонами, активными формами азота, предшественниками гема или аминокислотами;
  • 3) алкилирование пуринов и пиримидинов S-аденилметионином или другими агентами [7].

Также ежесуточно происходит спонтанное отщепление оснований, в количестве до 10 тысяч событий на весь объём генома. Сходные повреждения вызываются также экзогенными факторами, такими как ксенобиотики и радиация.

Молекулы ДНК являются для клетки настолько важными и уникальными, что в процессе эволюции в клетке выработалась сложная система репарации структуры ДНК, состоящая из нескольких механизмов и сотен белков, обеспечивающих процесс восстановления нормальной структуры ДНК.

Основа всех репарационных механизмов — наличие в молекуле ДНК двух цепочек, таким образом в клетке есть 2 копии генетической информации: поврежденный участок восстанавливается по второй комплементарной сохранной цепи; если же повреждение затрагивает обе цепи ДНК, то используется информация для восстановления из гомологичной хромосомы [10].

Прямая репарация — наиболее простой и быстрый вариант для клетки устранить дефект за одну стадию. Однако с помощью реакций этого типа может быть исправлено небольшое число повреждений. К реакциям прямой репарации относятся фотореактивация пиримидиновых димеров, репарация АР-сайтов прямой вставкой пуринов и прямая репарация однонитевых разрывов ДНК [6].

Фотореактивация пиримидиновых димеров реализуется за счёт группы ферментов ДНК-фотолиаз. Фотолиазы активируются светом, с длиной волны 300–600 нм (видимая область). Фермент связывается с поврежденным участком.

Затем после активации фотолиазы видимым светом происходит разрыв связей, возникших между пиримидиновыми кольцами ДНК. Фотолиазы были найдены у бактерий, дрожжей, мушки дрозофилы, некоторых видов иглокожих.

Наличие фотолиаз у высших млекопитающих, включая человека, пока не доказано.

Репарация АР-сайтов прямой вставкой пуринов реализуется при участии фермента ДНК-инсертаза [4]. Инсертаза комплементарно присоединяет основание к дезоксирибозе и структура ДНК приобретает исходный вид.

При этом типе репарации нет необходимости в разрезании цепи ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв, однако данный механизм работает медленно и таким образом может быть исправлено небольшое число поломок.

Прямая репарация однонитевых разрывов ДНК осуществляется за счёт работы одного фермента — ДНК-лигазы. Данная группа ферментов катализирует ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации.

Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК. Реакция протекает с затратой энергии АТФ.

Помимо прямой репарации, ДНК-лигазы играют важную роль в механизмах эксцизионной репарации.

Эксцизионная репарация — более сложный механизм восстановления структуры ДНК, при котором поврежденные участки извлекаются из цепи ДНК; при этом могут удаляться даже соседние с повреждёнными участками нуклеотиды.

В образовавшийся промежуток вставляется недостающий участок. Для эксцизионной репарации необходима комплементарная цепь ДНК [9].

Несмотря на разнообразие типов эксцизионной репарации и белков, участвующих в ней, можно выделить общие этапы:

  1. 1) распознавание повреждения с помощью ДНК-гликозилазы [5];
  2. 2) разрезание нити ДНК с помощью эндонуклеаз;
  3. 3) удаление повреждённого участка посредством различных экзонуклеаз;
  4. 4) репаративный синтез на неповрежденной матрице при участии ДНК-полимераз.

Для Е.coli был описан особый вид репарации — SOS-репарация [1]. Это целая система белков, активирующихся при угрозе гибели клетки. Система несовершенна, так как происходит вставка некомплементарных нуклеотидов. Однако этот механизм необходим для осуществления митоза и проведения репликации даже при значительных повреждениях ДНК.

В части процессов репарации в клетке также участвует и рекомбинация. Этот механизм восстановления ДНК является приоритетным при возникновении двунитевых разрывов и из-за обширности требует более детального рассмотрения.

  • У млекопитающих найдено несколько различных видов ДНК-лигаз [8]:
  • – ДНК-лигаза I связывает фрагменты Оказаки в ходе репликации ДНК и вносит свою лепту в реакции эксцизионной репарации.
  • – ДНК-лигаза II — недостаточно изучена; имеются две теории образования этого фермента, связанные с лигазой III и альтернативным сплайсингом.
  • – ДНК-лигаза III также задействована в реакциях эксцизионной репарации и в рекомбинации.

– ДНК-лигаза IV — катализатор для конечного этапа non-homologous end joining — NHEJ двухнитевых разрывов ДНК. Также это тип ферментов принимает участие в рекомбинации генов иммуноглобулинов.

Основные структуры, осуществляющие репарацию — это различные группы ферментов. У разных биологических видов обнаружены разные типы ферментов в пределах одной группы. Некоторые ферменты образуют большие комплексы с различными видами ферментной активности.

Как мы видим, все разнообразие механизмов связано с огромным множеством ферментов, вносящих свой вклад в реакции репарации.

С учетом развития молекулярной диагностики и генной терапии более детальное изучение механизмов репарации ДНК и структур, участвующих в них, является весьма приоритетным и многообещающим как для научного обоснования этиологии различных генетических [3] и онкологических заболеваний [2], так и для практического применения в качестве мишеней для лекарственных препаратов.

Литература:

  1. Ушаков В. Ю.SOS-система репарации ДНК у бактерий (обзор) // Вестник Пермского университета. — 2010. — Вып. 2. — С. 19–30.
  2. Bartkova J., Horejsi Z., Koed К., et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis // Nature. — 2005. — Vol. 434. — Р.864–870.
  3. Caldecott K. W. Single-strand break repair and genetic disease // Nat. Rev. Genet. — 2008. — Vol. 9. — Р.619–631.
  4. Flaherty D. M., Martha М. М., Hunninghake G. W. AP Endonucleases and the Many Functions of Ref-1 // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. — 2001. — Vol. 25. № 6. — Р.664–667.
  5. Scharer O. D., Jiricny J. Recent progress in the biology, chemistry and structural biology of DNA glycosylases // Bioessays. — 2001. — Vol. 23. — P.270–281.
  6. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т. 3: Пути передачи информации / Д. Нельсон, М. Кокс; пер. с англ. — 3-е изд., испр. — М.: Лаборатория знаний, 2017. — 448 с. — с. 66–79.
  7. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., перераб. М75 и доп. Т.1. Пер. с англ. -М. Мир, 1994. -517 c
  8. Клаг, Уильям С. Основы генетики / У. С. Клаг, М. Р. Каммингс. — М.: Техносфера, 2007. — 896. с
  9. Коничев С. А. Молекулярная биология / С. А. Коничев, Г. А. Севастьянова. — М.: Академия, 2005. — 400 с.
  10. Разани С. В. Хроматин: упакованный геном / С. В. Разин, А. А. Быстрицкий. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. — 176 с.

Основные термины (генерируются автоматически): прямая репарация, III, поврежденный участок, разрыв ДНК, репарация, NHEJ, детальное изучение механизмов репарации ДНК, прямая вставка пуринов, репарация АР-сайтов, тип ферментов.

Материалы конгрессов и конференций

Н.В. Томилин Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Много лет назад Джеймс Кливер и Дирк Бутсма показали, что фибробласты больных пигментной ксеродермой (ПК) имеют дефект по эксцизионной репарации (ЭР) ДНК после УФ облучения. Поскольку у большинства больных ПК образуется рак кожи, эти данные указывали, что у нормальных людей, редко болеющих раком кожи, репарация ДНК является важным фактором подавления канцерогенеза.

По определению, репарация уменьшает число повреждений в ДНК, в том числе и вступающих в репликацию, тем самым, снижая вероятность образования мутаций и хромосомных перестроек, а, следовательно, инициацию рака и прогрессию опухолей.

Эта простая концепция была впоследствии подтверждена на некоторых других моделях и стала весьма популярной, однако соотношения между репарацией ДНК и канцерогенезом оказались значительно более сложными, чем это представлялось ранее.

Выяснилось, в частности, что до самой репарации работают сложные сигнальные каскады идентификации повреждений в геноме и выбора между репарацией и апоптозом, а также выбора адекватной системы репарации для данного типа повреждений.

В последние годы значительный прогресс достигнут в понимании механизмов так называемой пострепликативной репарации или механизмов обхода повреждений ДНК во время и после репликации без их элиминации из генома, а также механизмов эпигеномных модификаций хроматина. Данный доклад будет посвящен краткому описанию известных к настоящему времени систем репарации ДНК в клетках высших эукариот и их роли в поддержании стабильности генома, обеспечивающей в нормальных клетках низкие темпы канцерогенеза.

Читайте также:  Молочнокислое брожение в биотехнологии. Молочные продукты в биотехнологии.

Основной функцией ДНК, как известно, является сохранение наследственной информации путем полуконсервативной репликации.

Матричный синтез, происходящий при репликации и транскрипции, следует правилам комплементарности азотистых оснований (А-Т и Г-Ц), основанным на их особой химической структуре, позволяющей ферментам этих синтезов, ДНК- и РНК-полимеразам, точно копировать последовательность нуклеотидов.

Большинство этих ферментов строго различают нормальные звенья в матричных молекулах, поэтому, как правило, химические модификации нуклеотидов в ДНК приводят к блоку нормальной транскрипции и репликации, то есть являются некодирующими повреждениями.

К таковым относятся внутритяжевые сшивки пиримидиновых нуклеотидов (циклобутановые димеры и 6-4 фотопродукты), образующиеся после УФ облучения, межтяжевые сшивки по пуриновым нуклеотидам, разнообразные ковалентные аддукты оснований, образуемые некоторыми химическими канцерогенами, тиминовые гликоли, апуриновые и апиримидиновые сайты и т.п.

В редких случаях химические модификации нуклеотидов сохраняют способность к комплементарному спариванию во время репликации и транскрипции, однако это спаривание происходит неоднозначно.

Например, окисленный гуанин, 8-оксогуанин (8-oxoG), спаривается не только с цитозином, но и с аденином, приводя к заменам в дочерних нитях ДНК при репликации. Можно отметить, что спонтанное окисление гуанина – это довольно частое событие, поскольку реакционно-способные соединения кислорода постоянно производятся митохондриями. И, наконец, к повреждениям можно отнести некоторые типы разрывов нитей ДНК, особенно при действии ионизирующих излучений, которые сопровождаются химическими модификациями оснований на концах.

Наиболее изученной системой репарации является эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН), частично дефектная у большинства больных пигментной ксеродермой.

При ЭРН модифицированные нуклеотиды (например, пиримидиновые димеры) удаляются из поврежденной нити благодаря действию нуклеаз XPG и ERCC1/XPF, а образующийся при этом однотяжевый пробел заполняется ДНК-полимеразами d или e с помощью PCNA и зашивается ДНК-лигазой.

В ЭРН работают также геликазы XPD и XPB, входящие в состав комплекса TFIIH, и комплекс XPA/RPA, стабилизирующий расплетенный участок и, по-видимому, определяющий, в какой нити будут сделаны разрезы.

Узнавание димеров в неактивной ДНК (так называемая глобальная репарация) обеспечивают комплексы XPC/HR23B и DDB2/DDB1, экспрессия которых контролируется хорошо известным опухолевым супрессором и транскрипционным фактором р53. Транскрипция гена DDB2 является индуцибельной, однако ген XPC экспрессируется постоянно.

При ЭРН повреждения ДНК могут распознаваться и без участия комплексов XPC/HR23B и DDB2/DDB1 при так называемой транскрипционной репарации, когда транскрипционный комплекс, содержащий РНК полимеразу II, блокируется на некодирующем повреждении, а репарация запускается белками CSA и CSB, дефектными при синдроме Кокейна.

В отличие от больных с пигментной ксеродермой, у больных с синдромом Кокейна (рано стареющие кахектичные карлики) не наблюдается повышения частоты рака кожи, хотя фибробласты УФ-чувствительны.

В одной из гипотез предполагается, что в клетках больных с синдромом Кокейна блок транскрипции быстро индуцирует апоптоз, поэтому раковые клоны образоваться не успевают.

Второй хорошо охарактеризованный путь репарации — это эксцизионная репарация оснований (ЭРО), при которой поврежденное азотистое основание, например тиминовый гликоль, удаляется специфической ДНК-гликозилазой до вскрытия сахарофосфатного каркаса ДНК.

В настоящее время у млекопитающих идентифицированы 11 различных ДНК-гликозилаз (UNG, SMUG1, TDG, MBD4, MYH, OGG1, NTH1, NEIL1, NEIL2, NEIL3, MPG), некоторые из которых удаляют одни и те же повреждения. Например, 8-oxoG может удаляться из ДНК с помощью OGG1 и NEIL1, а дезаминированный цитозин (урацил) – с помощью UNG, SMUG1, TDG и MBD4.

ДНК гликозилаза MYH удаляет только неспаренный аденин, вставляющийся при репликации в дочерние нити напротив 8-oxoG.

Образующийся после действия ДНК-гликозилаз апуриновый или апиримидиновый сайт далее репарируется с помощью надрезания ДНК специфической нуклеазой APE1/REF1, ДНК-полимеразы β, вставляющей один неповрежденный нуклеотид, и комплекса XRCC4/LIG1 (short patch BER).

В некоторых случаях комплексных повреждений во время ЭРО с помощью нуклеазы FEN1 удаляется несколько нуклеотидов, и тогда однотяжевый пробел заполняется с помощью PCNA и ДНК-полимеразы δ (long patch BER).

У мышей инактивирующие гомозиготные мутации генов ДНК-полимеразы β, APE1/REF1, LIG1 и XRCC1 приводят к эмбриональной летальности, а мутации по ДНК-гликозилазам дают очень небольшие фенотипические отклонения, что может быть связано с параллелизмом их функций, а также с тем, что некоторые окисленные нуклеотиды инактивируются еще на уровне предшественников до их инсерции в ДНК. Например, 8-oxoGTP расщепляется до 8-oxoGMP фосфатазой MTH1, являющейся гомологом гена mutТ, одного из главных антимутаторов кишечной палочки.

Третий важный механизм репарации — это устранение неправильно спаренных нормальных нуклеотидов, гетеродуплексных пар или мизматчей, часто образующихся при репликации некоторых последовательностей в матричных нитях, например микросателлитов, а также при репликации обычных последовательностей нуклеотидов.

Дефекты в генах системы репарации гетеродуплексов приводят к нестабильности микросателлитных сегментов и к мутациям по различным генам, в том числе и по генам опухолевых супрессоров.

Почему-то особенно хорошо это проявляется в клетках эпителия толстого кишечника и приводит к высокой частоте наследственных неполипозных раков толстой кишки (HNPCC). Наиболее часто встречаются пациенты с мутациями генов hMLH1 (60% всех случаев HNPCC) и hMSH2 (35%), реже — hMSH6, а мутации по hPMS1 и hPMS2 обнаружены лишь в нескольких семьях.

Мутации по генам hMLH3 и EXO1 (экзонуклеаза, взаимодействующая с hMSH2) тоже выявлены, но их значение пока неясно, поскольку у носителей рака нет. Мутаций по гену hMSH3 вообще пока не обнаружено.

Очень важной для клетки (и для канцерогенеза) является ее способность воссоединять случайные двойные разрывы (ДР) ДНК, что осуществляется двумя различными репарационными механизмами – негомогическим воссоединением концов (НГВК) ДНК и путем гомологической рекомбинации (ГР) при наличии по соседству второй копии неповрежденного идентичного по нуклеотидной последовательности сегмента ДНК, например сестринской хроматиды. Поскольку в диплоидных ядрах гомологичные хромосомы пространственно разделены (хромосомные территории), репарация путем ГР преимущественно происходит в S- и G2 фазах клеточного цикла, а НГВК осуществляется во время любой фазы цикла. В геномах высших эукариот имеется много повторов, по которым, в принципе, возможна репарация путем ГР, однако такая репарация ДР приводит к хромосомным транслокациям, и она практически полностью подавлена. Главным механизмом подавления потенциально кластогенной ГР между повторами и вообще неправильных (эктопических) воссоединений концов ДНК при репарации ДР является, по-видимому, локальная специфическая модификация хроматина по гистону Н2АХ – фосфорилирование лизина-139 (или образование γ-H2AX). Эта модификация, происходящая в мегабазных доменах хроматина рядом с ДР, способствует удержанию долгоживущих концов ДНК благодаря привлечению в эти домены специального белка когезинa (SMC1), а также белка hRad50, который может одномоментно связываться с двумя концами ДНК.

В клетках человека репарация путем НГВК непосредственно осуществляется продуктами генов DNA-PK, Ku70/80, XRCC4, LIG4, Artemis, hRAD50, hMRE11 и NBS1, а репарация путем ГР происходит с помощью белков RAD51 (paralogs XRCC2, XRCC3), RAD52, RAD54, BRCA1, BRCA2 (FANCD1), FANCD2, а также комплексов XPF/ERCC1 и hRAD50/hMRE11/NBS1. Узнавание случайных ДР осуществляется либо самим комплексом hRAD50/hMRE11/NBS1, который быстро связывается с концами ДНК, либо протеинкиназой АТМ (дефективной при наследственном синдроме атаксия-телеангиэктазия), которая выявляет какие-то не идентифицированные локальные изменения хроматина, вызванные ДР, и при этом активируется. АТМ-киназа быстро фосфорилирует гистон Н2АХ, белки NBS1, FANCD2 и Artemis, а также киназу Chk2 (RAD53), останавливающую клеточный цикл. Фосфорилирование белка Artemis необходимо для репарации примерно 10% случайных ДР. Образование γ-H2AX возможно и за счет активности других киназ (ATR и DNA-PK), но киназа ATR включается только при блоке репликации ДНК, когда в вилках репликации образуются достаточно протяженные однотяжевые бреши, связывающие белок RPA. Заметим, что репарация путем НГВК является неточной, и при ней всегда образуются микроделеции, тогда как ГР точно восстанавливает исходную последовательность нуклеотидов.

Важной для канцерогенеза является пострепликативная репарация (ПРР) или обход повреждений (lesion bypass or DNA damage tolerance) во время или после репликации.

Этот путь был открыт у бактерий почти 40 лет назад, когда было показано, что напротив не вырезанных пиримидиновых димеров во время репликации образуются однотяжевые пробелы в дочерних нитях, которые затем устраняются гомологической рекомбинацией между сестринскими дуплексами ДНК, контролируемой белком RecA. ПРР рассматривается как главный источник индуцируемых мутаций.

Основные результаты по генному контролю ПРР в клетках эукариот были получены на дрожжах — это гены эпистатической группы RAD6 (RAD18, RAD5, MMS2, UBC13, RAD30, REV3, POL30). Гомологи большинства из этих генов идентифицированы в геномах высших эукариот.

В настоящее время рассматриваются два основных (не альтернативных) механизма обхода некодирующих повреждений у эукариот: 1) прямой синтез ДНК напротив поврежденных нуклеотидов c помощью специальных ДНК-полимераз (translesion synthesis, TLS, or DNA polymerase switch); 2) использование как матрицы для синтеза напротив димера неповрежденного сестринского дуплекса без разрывов родительских нитей, смена матрицы (template switch, TMS). Небольшая часть пострепликативных пробелов может устраняться, по-видимому, и с помощью ГР между сестринскими дуплексами, при которой происходят разрывы родительских нитей ДНК и сестринские хроматидные обмены. Этот механизм ПРР аналогичен точной репарации двойных разрывов ДНК путем ГР, но касается только двойных разрывов, образующихся при репликации. При блоке репликации, однако, клетка стремится избежать рекомбинации, при которой образуются двойные разрывы ДНК в репликативных вилках. Подавление рекомбинации в заблокированных вилках происходит благодаря сумоилированию по лизину-164 белка PCNA ферментом UBC9, после чего SUMO-PCNA связывает геликазу SRS2, которая уже блокирует образование RAD51 филаментов. Дополнительными факторами подавления ГР в вилках репликации являются также известные геликазы BLM, WRN и RECQ4, дефективные при синдромах Блюма, Вернера и Ротмунда-Томсона, соответственно.

Читайте также:  Метаболизм в легких при их воспалении.

Главным событием при TLS является замена блокированной репликативной ДНК полимеразы (ДПδ или ДПε) на другую ДНК полимеразу, способную вставлять нормальные нуклеотиды напротив поврежденных звеньев.

В клетках человека такой TLS-полимеразой является продукт гена, дефектного при вариантной пигментной ксеродерме, ДНК полимераза η (ДПη) (у дрожжей ген RAD30), которая связывается с репликативным белком PCNA (POL30), причем связывание усиливается при моно-убихитинилировании PCNA также по лизину-164.

Эта модификация зависит от белка RAD18 и происходит при торможении репликации, однако остается неясным, каким образом при этом активируется RAD18. По нашим данным, при торможении репликации hRAD18, как и ДПη, накапливается в заблокированных вилках (фокусах репликации) и при этом перестает экстрагироваться из ядра буфером, содержащим Тритон-Х100.

Эти изменения подавляются ингибиторами протеинкиназ стауроспорином и вортманнином, то есть могут быть связаны с фосфорилированием либо самого RAD18, либо какого-то взаимодействующего с ним белка. Есть основания предполагать, что это фосфорилирование осуществляется каскадом ATR/Chk1 в ответ на накопление однотяжевой ДНК в вилках репликации.

В дрожжах параллельно с моно-убихитинилированием PCNA происходит его поли-убихитинилирование по тому же лизину-164, зависисимое от продуктов генов RAD5, MMS2 и UBC13, которое направляет репарацию по второму механизму (смена матрицы, TMS).

В клетках человека ПРР по механизму смены матрицы зависит от гомолога дрожжевого гена MMS2, однако поли-убихитинилирования PCNA пока не обнаружено. Необходимо отметить, что ПРР путем смены матрицы (TMS) является точной, а при смене полимеразы (TLS) специальные ДНК-полимеразы могут делать ошибки.

Эти ошибки и являются, по-видимому, основным источником индуцированных точковых мутаций в геноме человека.

Необходимо, однако, иметь ввиду, что только 5% генома кодирует белки и требует точного воспроизведения во время репликации, поэтому мутации в 95% генома (в некодирующей ДНК), особенно в дифференцированных соматических клетках, редко приводят к заметным фенотипическим эффектам. Что касается половых и стволовых клеток, то в них повреждения ДНК должны легче индуцировать апоптоз, а не репарацию.

РНК-зависимая репарация ДНК

В клетке существует специальный механизм, поддерживающий целостность генетической информации. Ультрафиолетовые лучи могут разрушать азотистые основания, входящие в состав ДНК, и служить причиной образования одно- или двухцепочечных разрывов (ДЦР) в этой молекуле.

Механизм «залечивания» (репарации) ДНК восстанавливает status quo и является совершенно необходимым для жизни клетки. Нарушения в механизме репарации ДНК служат причиной серьезных заболеваний, таких как пигментная ксеродерма и рак кожи.

Оказывается, РНК может служить матрицей для синтеза ДНК во время устранения двухцепочечных разрывов в хромосомной ДНК дрожжей.

РНК выступает в роли матрицы для синтеза ДНК при обратной транскрипции ретровирусов (например, ВИЧ), ретротранспозонов и при поддержании длины теломер (повторяющихся последовательностей ДНК на концах хромосом, необходимых для их стабильности).

Никаких указаний на прямое участие РНК как матрицы в репарации хромосом, включая залечивание двухцепочечных разрывов, получено не было, несмотря на то, что РНК присутствует в ядре в большом количестве.

В большинстве организмов ДЦР устраняются за счёт гомологичной рекомбинации, или же за счёт негомологичного соединения концов разрыва.

Было обнаружено, что РНК косвенно может участвовать в репарации (негомологичном соединении концов), являясь матрицей для синтеза одноцепочечной ДНК-копии (кДНК), с последующим образованием комплиментарной цепи ДНК.

РНК также участвует в гомологичной рекомбинации в клетках почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), в которых рекомбинация проходит очень легко. И там РНК действует не напрямую, а посредством своей кДНК, синтезируемой в цитоплазме обратной транскриптазой, ферментом, поставляемым ретротранспозоном Ty.

Образование духцепочечных молекул (так называемых гетеродуплексов) одноцепочечными фрагментами ДНК и РНК возможно как in vitro, так и in vivo, однако прямой гомологичный обмен генетической информации между молекулами РНК и ДНК известен не был.

Авторы статьи, досрочно опубликованной на сайте журнала Nature, утверждают, что РНК может служить матрицей для синтеза ДНК во время репараци ДЦР хромосомной ДНК дрожжей [1]. Репарация осуществляется рибоолигонуклеотидами (одноцепочечными короткими фрагментами РНК), комплиментарными разорванным концам ДНК.

Принимая во внимание этот факт и то, что ДНК-полимеразы α и δ, участвующие в репликации дрожжевой ДНК, могут копировать короткие РНК-матрицы in vitro, можно говорить о возможности переноса генетической информации молекулами РНК in vivo за счёт прямого взаимодействия с гомологичными последовательностями хромосомной ДНК.

Открытие синтеза ДНК in vitro и in vivo полимеразами α и δ на матрице РНК-содержащих олигониклеотидов существенно в ситуациях, когда фрагменты РНК оказывается в составе цепи ДНК in vivo, как, например, в случае с митохондриальным геномом млекопитающих.

Включение рибонуклеотидных остатков в состав ДНК может происходить в процессе нормального метаболизма ДНК: некоторые ДНК полимеразы могут использовать в качестве субстрата рибонуклеотиды in vitro, a ДНК-лигаза I (фермент, сшивающий фрагменты ДНК) может пришивать к ДНК также и остатки рибонуклеотидов в процессе созревания фрагментов Оказаки in vitro.

Репарация двуцепочечных разрывов «на матрице РНК» четко отличается от открытой ранее РНК/кДНК-зависимой репарации. В первом случае, отсутствует барьер для прямого переноса генетической информации от РНК на хромосомную ДНК.

Исходя из этой новой способности РНК, авторы статьи предполагают, что эндогенные РНК могут непосредственно участвовать в залечивании фрагментов ДНК после транскрипции, тем более, что локальная концентрация РНК в данном случае высока.

Результаты, представленные в статье, закладывают основы нашего понимания возможных механизмов прямого переноса генетической информации от гомологичных эндогенных РНК к ДНК.

Способность РНК переносить генетическую информацию на гомологичные молекулы хромосомных ДНК открывает новые возможности для направленного изменения генов (gene targeting), учитывая легкость амплификации РНК внутри клетки. Более того, РНК-матрицы, участвующие в репарации ДНК, могут вносить свой вклад в процессы эволюции генома и поддержания его стабильности.

  1. Francesca Storici, Katarzyna Bebenek, Thomas A. Kunkel, Dmitry A. Gordenin, Michael A. Resnick. (2007). RNA-templated DNA repair. Nature. 447, 338-341.

Нобелевская премия по химии: репарация ДНК

В чем суть? Каждый день наше ДНК подвергается воздействию ультрафиолета, свободных радикалов и прочих канцерогенных агентов, из-за которых она разрушается. Но это полбеды, так как молекула ДНК по сути крайне нестабильна. Клетка генома спонтанно меняется чуть ли не каждый день, а различные дефекты в ДНК появляются, когда она копируется во время клеточного деления, а это происходит по несколько миллионов раз в день. Без молекулярных систем, которые постоянно наблюдают и ремонтируют ДНК, наш генетический материал, а вместе с ним и сами люди уже давно распались бы, превратившись в хаотичное скопление химических элементов.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Не занимайтесь самолечением! В наших статьях мы собираем последние научные данные и мнения авторитетных экспертов в области здоровья. Но помните: поставить диагноз и назначить лечение может только врач.

Именно эти молекулярные системы и их работу открыли и изучили ученые, получившие Нобелевскую премию по химии 2015 года.

Еще в начале 1970-х годов ученые полагали, что ДНК — это невероятно стабильная молекула, и именно Томас Линдал доказал, что ДНК разлагается, причем такими темпами, что жизнь на Земле по идее должна была быть невозможна.

Основываясь на этом факте, Линдал открыл один из механизмов репарации ДНК, а именно «эксцизионную репарацию оснований», то есть вырезание поврежденных участков из ДНК и замену их новыми. Открытие произошло еще в 1979 году.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Азиз Санкар изучил эксцизионную репарацию нуклеотидов, механизм, который клетки используют для устранения повреждений, нанесенных ДНК ультрафиолетом. Люди, рожденные с дефектом в данной системе, становятся жертвами рака кожи при длительном нахождении на Солнце.

Пол Модрич открыл процесс, благодаря которому клетки корректируются при репликации ДНК во время деления. Этот механизм, получивший название «коррекция неспаренных оснований», в тысячу раз снижает количество ошибок при репликации ДНК, и при сбоях в нем, например, проявляется наследственный рак толстой кишки.

Таким образом, открытия нобелевских лауреатов 2015 года стали основанием для глубокого проникновения в механизм функционирования человеческих клеток, а также на их основе при современных технологиях можно создать лекарства от рака.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector