Поляризационная микроскопия. интерференционная микроскопия. люминесцентная микроскопия. техника микроскопии.

Световая, или оптическая, микроскопия — это один из основных методов исследования частиц, неразличимых человеческим глазом. Данный метод имеет широкое распространение в медицине, фармакологии, биологии, металлографии, криминалистике и других сферах.

Увеличение изображения в световом микроскопе обеспечивается системой собирательных линз, расположенных в окуляре и объективе.

Световой микроскоп — оптический прибор, позволяющий рассмотреть мелкие детали.

Предельная разрешающая способность человеческого глаза составляет около 0,1 мм. Это понятие отражает минимальное расстояние, на котором 2 соседние точки определяются как отдельные объекты. Микрочастицы, клеточные структуры и дефекты поверхности имеют размер менее 100 мкм, поэтому для их исследования требуется специальное оборудование.

Историческая справка

Первые оптические микроскопы были изобретены в XVI-XVII вв. Первым, кто заметил увеличительный эффект комбинации из нескольких линз, был венецианский врач Джироламо Фракасторо. В 1609 г. Галилео Галилей представил собственный вариант прибора с 2 стеклами: выпуклым и вогнутым. Первое устройство называлось оккиолино (occhiolino).

Через 10 лет после этого голландский ученый Корнелиус Дреббель усовершенствовал конструкцию, использовав для объектива 2 выпуклые линзы.

Практическое применение микроскопа началось с конца XVII в., когда Антони Ван Левенгук использовал собственное оптическое устройство для исследования биологических структур. Его микроскоп содержал всего одно мощное стекло, что уменьшало количество дефектов картинки.

Приборы Левенгука позволяли увеличить изображение в 275 раз и рассмотреть строение бактерий, дрожжей, эритроцитов, одноклеточных микроорганизмов и насекомых.

Популяризации микроскопии способствовала и книга английского исследователя Роберта Гука, которая вышла в 1664 г. В ней ученый ввел термин «клетка» и опубликовал гравюры некоторых микрообъектов.

Методы микроскопии выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

В течение следующих столетий конструкция оптического микроскопа непрерывно совершенствовалась. Несмотря на то, что в первой половине XX в.

были изобретены электронные приборы, которые позволяли рассмотреть нанообъекты, световой метод не теряет своей популярности. В 2006 г.

группа немецких ученых разработала оптическое устройство под названием наноскоп, которое обладает разрешающей способностью 10 нм.

Подробно о принципе действия

Принцип работы оптического микроскопа основывается на прохождении прямого или отраженного луча света через систему линз.

Объектив прибора содержит до 14 стекол. При прохождении светового пучка через эту часть устройства изображение увеличивается до 100 раз, а при прохождении окуляра — в 20-24 раза. Выпуклые и вогнутые стекла позволяют сфокусировать картинку на сетчатке или приспособлениях для документирования информации.

Видимое излучение, которое создает осветительная система прибора, ограничивают несколькими диафрагмами. Это повышает четкость изображения.

Увеличивающие линзы имеют 2 дефекта. Сферическая аберрация мешает фокусировать сразу все поле исследования, а хроническая приводит к появлению яркой каймы по контуру изображения. Чтобы компенсировать дефекты, окуляр и объектив оснащаются корригирующими стеклами.

Где применяется

Методы световой микроскопии применяют в следующих областях науки и промышленности:

• медицине и лабораторной диагностике;
• биологии;
• металлографии, неразрушающих методах контроля на производстве;
• микроэлектронике;
• минералогии, кристаллографии;
• археологии, геологии;
• криминалистике;
• пищевой промышленности;
• ювелирном деле и др.

Световая микроскопия применяется в медицине и биологии.

Оптический микроскоп состоит из следующих элементов:

• штатива;
• тубуса;
• окуляра;
• объектива;
• призмы;
• источника света;
• конденсора;
• апертурной и полевой диафрагм;
• фокусировочного механизма;
• светофильтра;
• зеркала;
• предметного столика.

Устройство светового микроскопа.

Некоторые модели прибора оборудованы дополнительными объективами, системами записи и передачи информации.

Особенности конструкции зависят от предназначения микроскопа. Для увеличения четкости изображения используют методы флуоресценции, люминесценции, инверсии и др.

Биологическое оборудование

Биологические приборы позволяют исследовать прозрачные или полупрозрачные объекты. Принцип их работы основан на изучении светлого поля в потоке проходящего света. Такие микроскопы применяют в лабораторной диагностике, ботанике, цитологии, микроэлектронике, археологии и пищевой промышленности.

Биологическое оборудование позволяет исследовать прозрачные объекты.

Для повышения разрешающей способности используют иммерсионные оптические системы. В этом случае между образцом и первым стеклом вводится жидкость с высоким коэффициентом преломления (минеральное масло, раствор глицерина, дистиллированная вода и др.).

Криминалистическое оборудование

Главная особенность криминалистического микроскопа — это возможность сравнения 2 объектов. Такое исследование помогает найти сходство между компонентами взрывных устройств, гильзами, пулями, волосами, волокнами и другими уликами.

Приборы для криминалистики оснащают фото- и видеокамерами, а также программным обеспечением.

Это позволяет снизить вероятность ошибок, построить модели объектов и сравнить с данными из электронных источников.

Флуоресцентные микроскопы

Флуоресцентные, или люминесцентные, микроскопы позволяют исследовать объекты, которые испускают световой поток после облучения ультрафиолетом. Они оборудованы коротковолновым источником освещения, светофильтрами и интерференционной пластинкой.

Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки.

Флуоресцентные микроскопы активно применяют в лабораторной диагностике, в частности, при изучении клеток крови и антигенов. Для анализа предметов, которые не излучают свет, используют люминесцентные красители и порошки.

Поляризационные микроскопы

Поляризационный прибор является наиболее сложным из всех представленных видов микроскопов. Его используют для исследования анизотропных материалов, полимеров, некоторых клеток и микробиологических объектов.

Источник света со специальными фильтрами формирует поляризованный поток, который облучает образец.

Оптическая система интерпретирует двойное лучепреломление среды и позволяет изучить ее структуру.

Инвертированные с перевернутым положением объектива

В инвертированном микроскопе объектив располагается не над образцом, а под предметным столиком. Такие приборы применяют в биологии, медицине, промышленности, металлографии, криминалистике и других сферах.

Инвертированный микроскоп имеет особенную конструкцию.

Перевернутое положение оптической системы позволяет изучать более крупные образцы и работать со специальной посудой.

Микроскопы для металлографии

Металлографические микроскопы предназначены для исследования поверхности непрозрачных объектов. Изображение получают путем преломления отраженного светового луча.

Предметом изучения являются микродефекты поверхности и зерна сплавов. Помимо металлургии и промышленности, такие устройства применяют в геологии и археологии. Для обеспечения четкости используют специальные системы линз и зеркал.

Стереомикроскопы (дают объемное изображение)

Стереомикроскопы оснащены 2 объективами, что позволяет получать объемное изображение исследуемого образца. По сравнению с устройствами плоского поля они дают более резкую, четкую и контрастную картинку.

Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение.

Такие приборы используют в точном машиностроении, ювелирном деле и других областях промышленности.

Моновидеомикроскопы с возможностью получения видео

Видеомикроскопы предназначены для динамического наблюдения за образцом и фиксации изображения. Для повышения эффективности работы их оснащают специальными линзами, светофильтрами и адаптерами.

Разновидности методов световой микроскопии

Выбор метода оптической микроскопии определяется особенностями объектов и целью исследования.

Светлое поле в потоке проходящего света

Данный метод основан на принципе прохождения потока света через образец. Предмет частично поглощает и рассеивает попадающие на него лучи, что позволяет сформировать изображение.

Светлое поле в потоке — метод, который построен на принципе прохождения света.

Светлопольную микроскопию применяют для изучения окрашенных тканей животных и растений, тонких шлифов и др. Для прохождения светового пучка препарат должен быть прозрачным.

Косое освещение

Данный метод является разновидностью микроскопии светлого поля. Чтобы выявить рельеф и сделать изображение более контрастным, поток направляют под большим углом к образцу.

Светлое поле в отраженном свете

Светопольная микроскопия в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов (сплавов, покрытий, руд и др.). Свет падает на образец сверху, а основная оптическая система исполняет роль объектива и конденсора.

Светлое поле в отраженном свете позволяет исследовать поверхности непрозрачных предметов.

Изображение формируется за счет того, что элементы поверхности по-разному отражают и рассеивают попадающие лучи. Травление дает возможность изучить не только дефекты, но и микроструктуру и фазовый состав образца.

Темное поле

Метод темного поля предназначен для изучения прозрачных образцов, которые не абсорбируют свет. Специальный конденсор направляет лучи так, что они формируют полый конус, в центре которого находится объектив. Таким образом, большая часть лучей не попадает в оптическую систему.

Изображение представляет собой темное поле с небольшими светлыми включениями, которые формируются за счет рассеяния света частицами препарата.

Ультрамикроскопия

Метод ультрамикроскопии является разновидностью темнопольного. Для исследования образцов используют сильные источники света, а лучи направляют перпендикулярно предметному столу. Эффект рассеяния волн позволяет обнаружить частицы менее 10 нм.

Ультрамикроскопия — метод наблюдения и анализа коллоидных частиц.

Метод фазового контраста позволяет изучать прозрачные и неокрашенные образцы. При малом различии в коэффициенте преломления изображение нельзя получить ни на светлопольном, ни на темнопольном микроскопе, поскольку разница в поглощении и рассеянии света будет минимальной.

Однако при прохождении через образец волна приобретает фазовый рельеф, который фиксируется специальным объективом. В изображении он отображается как различие в яркости элементов.

Аноптральный контраст

Данная методика является подвидом фазовой микроскопии. На иммерсионную линзу наносят кольцо из сажи, которое пропускает 10% лучей и совпадает с контуром кольцевой диафрагмы конденсора. При отсутствии образца амплитуда световых волн уменьшается на 90%.

Проходя через среды разной плотности, лучи дифрагируют, в результате чего их амплитуда остается неизменной.

За счет этого поле исследования получается темным, а частицы образца — светлыми.

Поляризационный метод

Анализ анизотропных материалов проводят в свете, пропущенном через специальную фильтрующую пластинку. При прохождении через образец плоскость поляризации лучей меняется.

По разнице между начальными и конечными характеристиками волн определяют количество оптических осей, их ориентацию и др.

Интерференционная микроскопия

Интерференционный метод основан на параллельном прохождении 2 лучей через предметный столик и мимо него. В окуляре микроскопа когерентные волны соединяются и интерферируют между собой.

При прохождении через образец первый луч запаздывает по фазе, что влияет на результирующую амплитуду и яркость изображения.

Люминесценция или флуоресценция

Принцип люминесцентной микроскопии основан на том, что некоторые образцы испускают видимый свет после облучения ультрафиолетом. Перед исследованием препараты обрабатывают флуоресцирующими антисыворотками, порошками или маркерами.

Волны ультрафиолетового спектра применяют для повышения разрешающей способности микроскопа. Для изучения препаратов, которые не испускают видимый свет после воздействия УФ-лучей, используют фотокамеры и кварцевые линзы.

МИКРОСКОПИ́Я ОПТИ́ЧЕСКАЯ

Авторы: А. А. Шехонин

МИКРОСКОПИ́Я ОПТИ́ЧЕСКАЯ, об­щее на­зва­ние ме­то­дов на­блю­де­ния объ­ек­тов, не раз­ли­чи­мых че­ло­ве­че­ским гла­зом, с ис­поль­зо­ва­ни­ем оп­тич. мик­ро­ско­па.

Струк­ту­ру объ­ек­та мож­но раз­ли­чить, ес­ли раз­ные его час­ти­цы по-раз­но­му по­гло­ща­ют и от­ра­жа­ют свет ли­бо от­ли­ча­ют­ся од­на от дру­гой (или от сре­ды) по­ка­за­те­ля­ми пре­лом­ле­ния.

Эти свой­ст­ва обус­лов­ли­ва­ют раз­ли­чие ам­пли­туд и фаз све­то­вых волн, про­шед­ших че­рез раз­ные уча­ст­ки объ­ек­та, и от это­го за­ви­сит кон­тра­ст­ность изо­бра­же­ния. Раз­ные ме­то­ды на­блю­де­ния, при­ме­няе­мые в М. о., вы­би­ра­ют­ся в за­ви­си­мо­сти от свойств изу­чае­мо­го объ­ек­та (пре­па­ра­та).

при­ме­ня­ет­ся при ис­сле­до­ва­нии про­зрач­ных пре­па­ра­тов с вклю­чён­ны­ми в них аб­сор­би­рую­щи­ми (по­гло­щаю­щи­ми свет) час­ти­ца­ми. Та­ко­вы, напр., тон­кие ок­ра­шен­ные сре­зы жи­вот­ных и рас­тит. тка­ней, тон­кие шли­фы ми­не­ра­лов. В от­сут­ст­вие пре­па­ра­та лу­чи от ис­точ­ни­ка све­та 1 (см. рис. к ст.

 Мик­ро­скоп) че­рез кол­лек­тор 2 и кон­ден­сор 5 про­хо­дят че­рез объ­ек­тив 7 и да­ют рав­но­мер­но ос­ве­щён­ное по­ле в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 9 оку­ля­ра 10.

Ес­ли в пре­па­ра­те, рас­по­ло­жен­ном на пред­мет­ном сто­ли­ке 6, име­ет­ся аб­сор­би­рую­щий эле­мент (ча­сти­ца), то он час­тич­но по­гло­ща­ет и рас­сеи­ва­ет па­даю­щий на не­го свет, вслед­ст­вие че­го ам­пли­ту­да све­та, про­шед­ше­го че­рез эту час­ти­цу, бу­дет мень­ше, и час­ти­ца вы­гля­дит тём­ным пят­ном на свет­лом фо­не, что и обу­слов­ли­ва­ет, со­глас­но ди­фрак­ци­он­ной тео­рии, воз­ник­но­ве­ние изо­бра­же­ния. Ме­тод мож­но ис­поль­зо­вать и в слу­чае не­аб­сор­би­рую­щих частиц, ес­ли они рас­сеи­ва­ют ос­ве­щаю­щий пу­чок так силь­но, что б. ч. пуч­ка не по­па­да­ет в объ­ек­тив.

при­ме­ня­ет­ся для на­блю­де­ния не­про­зрач­ных объ­ек­тов, напр. шли­фов ме­тал­лов. Ос­ве­ще­ние пре­па­ра­та 4 (рис. 1) про­из­во­дит­ся от ос­ве­ти­те­ля 1 и по­лу­про­зрач­но­го зер­ка­ла 2 свер­ху че­рез объ­ек­тив 3, ко­то­рый вы­пол­ня­ет од­но­вре­мен­но и роль кон­ден­со­ра.

Про­ме­жу­точ­ное изо­бра­же­ние соз­да­ёт­ся в плос­ко­сти 6 объ­ек­ти­вом со­вме­ст­но с ту­бус­ной лин­зой 5. Струк­ту­ра пре­па­ра­та вид­на вслед­ст­вие раз­ли­чия от­ра­жаю­щей спо­соб­но­сти его эле­мен­тов.

На свет­лом фо­не наблюда­ют­ся тём­ные изо­бра­же­ния не­од­но­род­но­стей струк­ту­ры по­верх­но­сти.

при­ме­ня­ет­ся для по­лу­че­ния изо­бра­же­ний про­зрач­ных, не­аб­сор­би­рую­щих объ­ек­тов. Свет от ис­точ­ни­ка 1 (рис. 2) че­рез кол­лек­тор 2 про­хо­дит спец. кон­ден­сор тём­но­го по­ля 4, со­дер­жа­щий коль­це­вую диа­фраг­му 3. Ка­ж­дая точ­ка пре­па­ра­та 5 ос­ве­ща­ет­ся све­то­вым пуч­ком в ви­де по­ло­го ко­ну­са.

В от­сут­ст­вие рас­сеи­ваю­щих эле­мен­тов свет не­по­сред­ст­вен­но в объ­ек­тив 6 не по­па­да­ет. Объ­ек­тив соз­да­ёт в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 7 оку­ля­ра 8 изо­бра­же­ние толь­ко тех эле­мен­тов пре­па­ра­та, на ко­то­рых про­изош­ло рас­сея­ние све­та.

На тём­ном фо­не вид­ны свет­лые изо­бра­же­ния час­тиц, от­ли­чаю­щих­ся от ок­ру­жаю­щей сре­ды по­ка­за­те­лем пре­лом­ле­ния.

Этот ме­тод, ис­поль­зуе­мый так­же в ульт­ра­мик­ро­ско­пах (в них пре­па­рат ос­ве­ща­ют пер­пен­ди­ку­ляр­но на­прав­ле­нию на­блю­де­ния), да­ёт воз­мож­ность об­на­ру­жи­вать сверх­мел­кие де­та­ли, раз­ме­ры ко­то­рых (по­ряд­ка 2 нм) зна­чи­тель­но мень­ше пре­де­лов раз­ре­ше­ния наи­бо­лее силь­ных мик­ро­ско­пов. Од­на­ко при этом изо­бра­же­ния час­тиц име­ют вид ди­фрак­ци­он­ных то­чек и их ис­тин­ную фор­му нель­зя оп­ре­де­лить.

ис­поль­зу­ет­ся для ис­сле­до­ва­ния не­про­зрач­ных пре­па­ра­тов (напр., шли­фов ме­тал­лов) с вы­со­ким ко­эф. от­ра­же­ния. Ос­ве­ти­тель­ный ка­нал со­сто­ит из ис­точ­ни­ка све­та 1, кол­лек­то­ра 2, до­пол­нит. лин­зы 4, в фо­ку­се ко­то­рой ус­та­нав­ли­ва­ют коль­це­вую диа­фраг­му 3 (рис. 3).

Све­то­вой по­ток в ви­де по­ло­го ци­лин­д­ра, от­ра­жа­ясь от по­лу­про­зрач­но­го зер­ка­ла 5, по­па­да­ет на па­ра­бо­лич. зер­ка­ло 6 (эпи­кон­ден­сор). Ка­ж­дая точ­ка пре­па­ра­та 7 ос­ве­ща­ет­ся све­то­вым пуч­ком в ви­де по­ло­го ко­ну­са. При от­сут­ст­вии к.-л.

де­фек­тов или рас­сеи­ваю­щих эле­мен­тов на по­верх­но­сти объ­ек­та свет, зер­каль­но от­ра­жа­ясь от по­верх­но­сти, не­по­сред­ст­вен­но в объ­ек­тив 8 не по­па­да­ет.

Объ­ек­тив со­вме­ст­но с ту­бус­ной лин­зой 9 соз­да­ёт в плос­ко­сти по­ле­вой диа­фраг­мы 10 оку­ля­ра 11 изо­бра­же­ние толь­ко тех эле­мен­тов пре­па­ра­та, на ко­то­рых про­изош­ло диф­фуз­ное рас­сея­ние све­та. На тём­ном фо­не вид­ны свет­лые изо­бра­же­ния час­тиц струк­ту­ры по­верх­но­сти.

(ме­тод на­блю­де­ния в про­хо­дя­щем и от­ра­жён­ном по­ля­ри­зо­ван­ном све­те) при­ме­ня­ет­ся для ис­сле­до­ва­ния ани­зо­троп­ных объ­ек­тов (ми­не­ра­лы, ру́­ды, зёр­на в шли­фах спла­вов, не­ко­то­рые жи­вот­ные и рас­тит. тка­ни и клет­ки).

При на­блю­де­нии в па­рал­лель­ных лу­чах (ор­то­ско­пи­че­ский ме­тод) с по­мо­щью ана­ли­за­то­ров и ком­пен­са­то­ров, ко­то­рые вклю­че­ны в оп­тич. сис­те­му, изу­ча­ет­ся из­ме­не­ние по­ля­ри­за­ции све­та, про­шед­ше­го че­рез пре­па­рат.

В этом слу­чае мож­но оп­ре­де­лить ани­зо­тро­пию по­ка­за­те­лей пре­лом­ле­ния и по­гло­ще­ния об­раз­ца, его оп­тич. ак­тив­ность и др. При вклю­че­нии в оп­тич.

сис­те­му мик­ро­ско­па линз Ла­зо и Бер­тра­на на­блю­де­ние объ­ек­та про­ис­хо­дит в схо­дя­щих­ся лу­чах (ко­но­ско­пи­че­ский ме­тод); при этом ис­сле­ду­ют­ся ори­ен­ти­ров­ка кри­стал­ла, ко­ли­че­ст­во и на­прав­ле­ние его осей.

слу­жит для по­лу­че­ния изо­бра­же­ний про­зрач­ных и бес­цвет­ных объ­ек­тов (напр., жи­вых не­ок­ра­шен­ных жи­вот­ных тка­ней), не­ви­ди­мых при на­блю­де­нии ме­то­дом свет­ло­го по­ля.

Да­же при ма­лом раз­ли­чии по­ка­за­те­лей пре­лом­ле­ния объ­ек­та и сре­ды или их тол­щин све­то­вая вол­на, про­шед­шая сквозь них, пре­тер­пе­ва­ет разл. из­ме­не­ния по фа­зе и при­об­ре­та­ет т. н. фа­зо­вый рель­еф.

Эти фа­зо­вые из­ме­не­ния с по­мо­щью фа­зо­вой пла­стин­ки (фа­зо­во­го коль­ца), рас­по­ло­жен­ной вбли­зи зад­не­го фо­ку­са объ­ек­ти­ва, пре­об­ра­зу­ют­ся в из­ме­не­ния яр­ко­сти (ам­пли­туд­ный рель­еф).

Лу­чи, про­шед­шие че­рез пре­па­рат, пол­но­стью про­хо­дят че­рез фа­зо­вое коль­цо, ко­то­рое из­ме­ня­ет их фа­зу на $π$/2. Лу­чи, рас­се­ян­ные в пре­па­ра­те (от­кло­нён­ные), не по­па­да­ют в фа­зо­вое коль­цо и не по­лу­ча­ют до­пол­нит. сдви­га фа­зы.

С учё­том фа­зо­во­го сдви­га, вне­сён­но­го са­мим пре­па­ра­том, раз­ность фаз ме­ж­ду от­кло­нён­ны­ми и не­от­кло­нён­ны­ми лу­ча­ми ока­зы­ва­ет­ся близ­кой к 0 или $π$. В ре­зуль­та­те ин­тер­фе­рен­ции све­та в плос­ко­сти изо­бра­же­ния пре­па­ра­та фор­ми­ру­ет­ся кон­тра­ст­ное изо­бра­же­ние его струк­ту­ры, в ко­то­ром рас­пре­де­ле­ние яр­ко­стей вос­про­из­во­дит фа­зо­вый рель­еф.

со­сто­ит в том, что ка­ж­дый луч, вхо­дя­щий в мик­ро­скоп, раз­дваи­ва­ет­ся: один про­хо­дит сквозь на­блю­дае­мую час­ти­цу, а вто­рой – ми­мо неё.

В оку­ляр­ной час­ти мик­ро­ско­па оба лу­ча со­еди­ня­ют­ся с раз­но­стью хо­да $δ=Nλ=(n_{ ext{ч}}-n_{ ext{ср}})d$ и ин­тер­фе­ри­ру­ют.

(Здесь $n_{ ext{ч}}$, $n_{ ext{ср}}$ – по­ка­за­те­ли пре­лом­ле­ния час­ти­цы и ок­ру­жаю­щей сре­ды, $d$ – тол­щи­на час­ти­цы, $λ$  – дли­на вол­ны све­та, $N$ – по­ря­док ин­тер­фе­рен­ции.)

Сход­ст­во ме­то­дов ин­тер­фе­рен­ци­он­но­го и фа­зо­во­го кон­тра­ста со­сто­ит в том, что оба они ос­но­ва­ны на ин­тер­фе­рен­ции лу­чей, про­шед­ших че­рез мик­ро­час­ти­цу и ми­но­вав­ших её. От­ли­чие ин­тер­фе­рен­ци­он­но­го ме­то­да от ме­то­да фа­зо­во­го кон­трас­та за­клю­ча­ет­ся гл. обр.

в воз­мож­но­сти с вы­со­кой точ­но­стью (до $λ$/300) из­ме­рять раз­но­сти хо­да лу­чей, вно­си­мые мик­ро­объ­ек­том, ис­поль­зуя оп­тич. ком­пен­са­то­ры. На ос­но­ва­нии этих из­ме­ре­ний мож­но рас­счи­тать, напр., об­щую мас­су и кон­цен­тра­цию су­хо­го ве­ще­ст­ва в клет­ках био­ло­гич. пре­па­ра­тов.

ос­но­ва­на на яв­ле­нии лю­ми­нес­цен­ции, ли­бо свой­ст­вен­ной са­мо­му мик­ро­объ­ек­ту, ли­бо по­лу­чен­ной им по­сле спец. ок­ра­ски. Под мик­ро­ско­пом изу­ча­ет­ся зе­лё­но-оран­же­вое све­че­ние объ­ек­та, воз­ни­каю­щее при его ос­ве­ще­нии си­не-фио­ле­то­вым или УФ-из­лу­че­ни­ем.

Для этой це­ли пе­ред кон­ден­со­ром и по­сле объ­ек­ти­ва мик­ро­ско­па вво­дят со­от­вет­ст­вую­щие све­то­фильт­ры. Пер­вый из них про­пус­ка­ет от ис­точ­ни­ка-ос­ве­ти­те­ля толь­ко из­лу­че­ние, вы­зы­ваю­щее лю­ми­нес­цен­цию объ­ек­та, вто­рой (по­сле объ­ек­ти­ва) про­пус­ка­ет к гла­зу на­блю­да­те­ля толь­ко свет лю­ми­нес­цен­ции.

Ме­тод при­ме­ня­ет­ся в мик­ро­био­ло­гии, ци­то­ло­гии, мик­ро­хи­мич. ана­ли­зе, де­фек­то­ско­пии и т. п.

по­зво­ля­ет уве­ли­чить пре­дель­ную раз­ре­шаю­щую спо­соб­ность мик­ро­ско­па, про­пор­цио­наль­ную 1/$λ$. Этот ме­тод рас­ши­ря­ет воз­мож­но­сти мик­ро­ско­пич. ис­сле­до­ва­ний так­же за счёт то­го, что час­ти­цы мн.

ве­ществ, про­зрач­ные в ви­ди­мом све­те, силь­но по­гло­ща­ют УФ-из­лу­че­ние оп­ре­де­лён­ных длин волн и, сле­до­ва­тель­но, лег­ко раз­ли­чи­мы на УФ-изо­бра­же­ни­ях. Изо­бра­же­ния в УФ-мик­ро­ско­пии ре­ги­ст­ри­ру­ют фо­то­гра­фи­ро­ва­ни­ем, с по­мо­щью элек­трон­но-оп­тич.

пре­об­ра­зо­ва­те­ля, при­ём­ни­ка за­ря­до­вой свя­зи, лю­ми­нес­ци­рую­ще­го эк­ра­на.

Для на­блю­де­ния в ИК-лу­чах так­же не­об­хо­ди­мо пре­об­ра­зо­ва­ние не ви­ди­мо­го для гла­за изо­бра­же­ния в ви­ди­мое пу­тём его фо­то­гра­фи­ро­ва­ния, ви­део­съём­ки или с по­мо­щью элек­трон­но-оп­тич. пре­об­ра­зо­ва­те­ля. ИК-мик­ро­ско­пия по­зво­ля­ет изу­чать внутр. струк­ту­ру объ­ек­тов, не­про­зрач­ных в ви­ди­мом све­те, напр. тём­ных стё­кол, не­ко­то­рых кри­стал­лов, ми­не­ра­лов.

Световая микроскопия и электронная микроскопия: суть метода

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

• Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.
• Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль.
• Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.

Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Виды световой микроскопии

1. Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа.
2. Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.

3. Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.

4. Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа.

   В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом).

5. Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).
6. Темнопольная микроскопия.

   При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия — метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами

Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света.

При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета.

Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.).

Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом.

Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи.

В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом.

Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам.

По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки.

Темнопольная микроскопия

При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив.

В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

1. Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы.
2. Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.
3. Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Фазово-контрастная микроскопия

Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона.

При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

• Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.
• Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света.
• Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный.

Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы.

Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды.

Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.

Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).

Электронная микроскопия

Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию.

Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете.

Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

1. Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной).
2. При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.
3. Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными.

Электронные микроскопы: системы

В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом.

Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца.

Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран.

Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование.

Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов

1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране.

Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров).

Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ.STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем.

При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме.

Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов.

При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение.

В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами.

Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа

• 1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;
• 2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;
• 3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;
• 4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

• Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера.
• Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.
• Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа.

Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения.

Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.