Печатать книгу
Понятие о брожении. Не всем организмам для жизнедеятельности необходим молекулярный кислород. Кроме аэробов, существуют также анаэробы — организмы, способные жить и развиваться в отсутствие О2. К этой группе относятся многие бактерии, некоторые протисты, грибы (например, дрожжи) и животные (сосальщики, ленточные черви, аскариды и др.).
*Строгие (облигáтные) анаэробы способны существовать только при отсутствии в среде молекулярного кислорода — он для них губителен.
Примером могут служить клостридии — род бактерий, к которому относятся возбудители столбняка, газовой гангрены и ботулизма. Факультативные анаэробы могут жить как в присутствии кислорода, так и в бескислородной среде.
Это, например, кишечная палочка, холерный вибрион, дрожжи, паразитические черви.*
Большинство анаэробных организмов получает энергию для жизнедеятельности в ходе брожения.
Брожение — процесс бескислородного расщепления органических веществ, преимущественно углеводов, происходящий под действием ферментов.
При дефиците кислорода брожение может протекать и в клетках аэробных организмов. В зависимости от основного конечного продукта различают молочнокислое, спиртовое и другие виды брожения.
Молочнокислое брожение протекает в два этапа, причем первый этап фактически представляет собой гликолиз (рис. 21-1.1). Молекула глюкозы расщепляется и окисляется с образованием 2 молекул ПВК и *2 молекул НАД∙Н+Н+.* Суммарный энергетический выход этого процесса, как вы знаете, составляет 2 молекулы АТФ:
*1. C6H12O6 + 2НАД+ + 2АДФ + 2H3PO4 → 2C3H4O3 + 2НАД∙Н+Н+ + 2АТФ.
На втором этапе ПВК восстанавливается за счет НАД∙Н+Н+ до молочной кислоты (С3Н6О3), АТФ при этом не синтезируется:
2. 2С3Н4О3 + 2НАД∙Н+Н+ → 2С3Н6О3 + 2НАД+.*
- *Просуммировав приведенные уравнения и исключив НАД, который на первом этапе восстанавливается, а на втором снова окисляется, получаем* общее уравнение молочнокислого брожения:
- С6Н12О6 + 2АДФ + 2Н3РО4 → 2С3Н6О3 + 2АТФ.
Этот вид брожения осуществляют молочнокислые бактерии. Кроме того, молочнокислое брожение происходит в мышечных волокнах человека и животных в условиях недостатка кислорода. Накопление молочной кислоты является одной из причин развития утомления мышц.
*Молочная кислота, образовавшаяся в мышцах, с током крови поступает в печень, где подвергается ферментативному окислению до ПВК. При наличии кислорода ПВК может вступать в кислородный этап клеточного дыхания. Кроме того, в клетках печени под действием ферментов ПВК может превращаться в глюкозу, которая запасается в виде гликогена либо снова поступает в мышцы.*
Спиртовое брожение на первом этапе протекает аналогично молочнокислому (рис. 21-1.2):
*1. C6H12O6 + 2НАД+ + 2АДФ + 2H3PO4 → 2C3H4O3 + 2НАД∙Н+Н+ + 2АТФ.
Далее ПВК расщепляется с образованием уксусного альдегида (ацетальдегида) и углекислого газа:
2. 
.
Брожение завершается восстановлением ацетальдегида до этилового спирта (этанола) при помощи НАД∙Н+Н+:
3. 
.*
- Таким образом, конечными продуктами спиртового брожения являются этиловый спирт (С2Н5ОН) и углекислый газ. Приведенные процессы можно выразить следующим суммарным уравнением:
- С6Н12О6 + 2АДФ + 2Н3РО4 → 2С2Н5ОН + 2СО2 + 2АТФ.
Спиртовое брожение осуществляют дрожжи и некоторые бактерии. Также оно протекает в клетках растений при дефиците О2.
*Способностью окислять этиловый спирт до уксусной кислоты (СН3СООН) обладают уксуснокислые бактерии.
С использованием молекулярного кислорода эти аэробные микроорганизмы осуществляют ферментативное превращение, которое можно записать в виде: C2Н5OH + O2 → CH3COOH + H2O.
Этот процесс иногда называют «уксуснокислым брожением», хотя по сути он не является разновидностью брожения, т. к. протекает при участии кислорода.
В природе уксуснокислые бактерии встречаются обычно там же, где и дрожжи — на поверхности фруктов, в цветочном нектаре, сокотечениях деревьев и т. п. Этиловый спирт, который образуют дрожжи при спиртовом брожении, они используют как субстрат для получения энергии.
При доступе кислорода уксуснокислые бактерии могут развиваться в различных продуктах, содержащих этанол (вине, пиве, квасе и др.), что приводит к их порче. Вместе с тем уксуснокислые бактерии используются для промышленного получения разных видов пищевого уксуса. Например, с их помощью из яблочного сока производят яблочный уксус, а из виноградного — винный.*
*Другие виды брожения. Помимо молочнокислого и спиртового, известны и другие виды брожения — пропионовокислое, маслянокислое, муравьинокислое, ацетоно-бутиловое и т. д.
Пропионовокислые бактерии обитают преимущественно в рубце и кишечнике жвачных животных. Они расщепляют углеводы, в частности глюкозу, с образованием углекислого газа и двух карбоновых кислот: пропионовой (пропановой) С2Н5СООН и уксусной СН3СООН.
Для некоторых бактерий характерно маслянокислое брожение, основным продуктом которого, как следует из названия, является масляная (бутановая) кислота С3Н7СООН.
Эти микроорганизмы могут вызывать порчу продуктов питания (прогоркание сливочного масла, сметаны, квашеных овощей и др.) и кормов для животных.
При муравьинокислом брожении в качестве одного из главных продуктов выделяется муравьиная (метановая) кислота НСООН.
Этот вид брожения осуществляют энтеробактерии, многие из которых, например кишечная палочка, обитают в толстом кишечнике млекопитающих и человека в качестве симбионтов.
Ацетоно-бутиловое брожение, свойственное ряду микроорганизмов, приводит к образованию ацетона Н3С—СО—СН3 и бутилового спирта С4Н9ОН.*
При любом виде брожения не происходит полного окисления глюкозы, поэтому значительная часть энергии остается в конечных продуктах — молочной кислоте, этиловом спирте и др.
Энергетический выход брожения — 2 молекулы АТФ (из расчета на одну молекулу глюкозы).
Поэтому при расщеплении одинакового количества углеводов в ходе энергетического обмена анаэробы получают гораздо меньше энергии, чем аэробы.
*Долгое время брожение рассматривалось как химический процесс, не связанный с живыми организмами. В 1830-х гг. несколько исследователей, в числе которых был и Т.
Шванн, установили, что дрожжи, которые издавна использовались в виноделии и пивоварении, являются живыми организмами. Шванн прокипятил бродивший виноградный сок, что привело к гибели дрожжей, и убедился, что брожение могло возобновиться только после добавления новых дрожжей.
Но и после этих исследований многие ученые продолжали отрицать причастность живых организмов к процессам брожения.
Ситуация изменилась благодаря трудам Л. Пастера — одного из основоположников микробиологии и иммунологии. В 1850—1860-х гг. он провел ряд экспериментов и убедительно доказал, что брожение является результатом деятельности живых организмов.
При этом было установлено, что разные виды брожения вызываются различными группами микроорганизмов. Л. Пастер дал знаменитое определение брожению как «жизни без кислорода».
Он же ввел термины «аэробы» для обозначения организмов, нуждающихся в молекулярном кислороде, и «анаэробы» для организмов, способных существовать при его отсутствии.*
*Ученые полагают, что брожение как способ получения энергии возникло на Земле очень давно — еще в ту эпоху, когда в атмосфере не было молекулярного кислорода.
Древнейшие обитатели нашей планеты использовали этот малоэффективный тип энергетического обмена для синтеза необходимой им АТФ. В дальнейшем появились новые, более энергетически выгодные пути катаболизма.
Но, тем не менее, брожение по-прежнему используется рядом организмов, т. к. позволяет им существовать в условиях дефицита или полного отсутствия кислорода.*
Практическое значение брожения. Брожение с древних времен используется человеком для получения различных продуктов. Известно, что пивоварением и виноделием, в основе которых лежит спиртовое брожение, люди занимались еще 8 тыс. лет назад. Конечно, в то время они не знали, что эти процессы протекают при участии микроорганизмов.
В современном мире брожение широко используется в пищевой промышленности. Продукты и напитки, полученные с помощью различных видов брожения, входят в состав практически всех кухонь мира.
Спиртовое брожение применяется для получения этилового спирта, вина, пива, кваса и т. д.
Использование дрожжей в хлебопечении связано с тем, что пузырьки углекислого газа, образующегося в процессе спиртового брожения, разрыхляют тесто, делая его пышным.
С помощью молочнокислого брожения получают творог, сыры, сметану, йогурты и другие кисломолочные продукты. Молочная кислота — хороший природный консервант.
Она образуется, например, при квашении капусты, засолке огурцов, мочении яблок, предотвращая гниение этих продуктов и позволяя сохранять их долгое время.
В основе силосования кормов для животных также лежит процесс молочнокислого брожения.
*Пропионовокислое брожение применяется при изготовлении некоторых видов сыров на стадии их дозревания. Карбоновые кислоты, образуемые пропионовокислыми бактериями, придают сырам специфический острый вкус.
* Производство некоторых продуктов *(например, кефира, соевого соуса)* связано с сочетанием разных видов брожения. Так, кефир получают с помощью молочнокислых бактерий и дрожжей, т. е.
он является продуктом молочнокислого и спиртового брожения.
Следует отметить, что с XX в. процессы брожения нашли применение для промышленного производства ряда химических веществ — различных спиртов и карбоновых кислот, ацетона, уксусного альдегида и др.
*Например, с помощью бактерий, осуществляющих маслянокислое брожение, получают масляную кислоту, необходимую для парфюмерной промышленности.
Пропионовокислые бактерии используются для получения некоторых карбоновых кислот и витамина В12.*
Анаэробы получают энергию для жизнедеятельности преимущественно в процессе брожения — ферментативного расщепления органических веществ без участия кислорода. Брожение может протекать и в клетках аэробных организмов при недостатке кислорода.
При брожении не происходит полного окисления глюкозы, поэтому его энергетический выход намного меньше, чем клеточного дыхания: 2 молекулы АТФ на каждую расщепленную молекулу глюкозы. Различают молочнокислое, спиртовое и другие виды брожения. В результате молочнокислого брожения образуется молочная кислота (С3Н6О3).
Конечными продуктами спиртового брожения являются этиловый спирт (С2Н5ОН) и углекислый газ.
 |
1. Что такое брожение? Может ли оно происходить в клетках аэробных организмов? 2. Как протекает процесс молочнокислого брожения? Спиртового? Назовите конечные продукты этих видов брожения. Сколько молекул АТФ синтезируется в ходе молочнокислого и спиртового брожения при расщеплении одной молекулы глюкозы? 3. Какие виды брожения, кроме молочнокислого и спиртового, вам известны? К образованию каких продуктов приводят эти виды брожения? 4. Охарактеризуйте практическое значение различных видов брожения. 5. Почему при брожении высвобождается меньше энергии, чем при клеточном дыхании? 6*. В чем заключается сходство брожения и клеточного дыхания? Чем брожение отличается от клеточного дыхания? 7*. Определите массу глюкозы, расщепленной молочнокислыми бактериями, если ими было образовано 135 г молочной кислоты. Какое максимальное количество АТФ (моль) могло синтезироваться в клетках молочнокислых бактерий? |
Молочнокислое брожение
- В открытую емкость налейте немного молока и оставьте его на несколько дней в теплом месте до скисания.
- Затем с помощью универсальной индикаторной бумаги измерьте величину рН свежего молока и полученной простокваши.
Для опыта можно также использовать лакмус, метилоранж или самодельный индикатор (о том, как его получить, рассказано в практическом задании к § 2 «Самодельный рН-индикатор»).
- Определите величину рН различных кисломолочных продуктов — кефира, йогурта, айрана, творога и т. д.
- Сравните кислотность сока свежей и квашеной капусты, свежих и подвергшихся засолке огурцов.
● Как изменяется кислотность среды в процессе скисания молока, квашения капусты, засолки огурцов? С чем это связано?
● Почему квашение и засолка овощей позволяют увеличить срок их хранения?
Спиртовое брожение
- Растворите примерно 40 г сахара (2 столовые ложки без горки) в 200 мл теплой, но не горячей воды.
- Добавьте 2 чайные ложки прессованных или сухих дрожжей и хорошо перемешайте.
- Полученную смесь разделите пополам и налейте в две одинаковые емкости с узким горлышком, например в стеклянные или пластиковые бутылки. После этого наденьте на горлышки каждой из них воздушный шарик.
- Одну емкость оставьте в теплом месте (оптимальной будет температура около 30 ºС), а другую поставьте в холодильник.
- Каждые 15—20 мин оценивайте степень наполнения шариков.
● Какой газ вызывает наполнение шариков? Из чего он образуется?
● При какой температуре происходит более интенсивное выделение газа и почему?
- В 100 мл теплой воды растворите одну столовую ложку сахара.
- Разлейте полученный раствор примерно поровну в две миски.
- В одну из них добавьте половину чайной ложки дрожжей и хорошо перемешайте, а в другую дрожжи не добавляйте.
- Затем добавьте в миски одинаковое количество муки — столько, чтобы после перемешивания получилось довольно вязкое тесто.
- После того как два вида теста будут готовы, накройте миски полотенцем и поставьте в теплое место.
- Примерно через час-полтора сравните объем и консистенцию теста в двух мисках.
● С чем связано использование дрожжей в хлебопечении?
Анаэробное разложение (брожение)- основы микробиологии — е. ю. тюменцева — 2015
Брожение — это анаэробный (происходящий без участия кислорода) метаболический распад молекул питательных веществ, например глюкозы. По выражению Луи Пастера, «брожение — это жизнь без кислорода». Большинство типов брожения осуществляют микроорганизмы — облигатные или факультативные анаэробы.
Термин «брожение» также используется в более широком смысле для обозначения бурного роста микроорганизмов в соответствующей среде. При использовании в этом смысле не делается различия между аэробным и анаэробным метаболизмом.
Брожение часто используется для приготовления или сохранения пищи. Говоря о брожении, обычно имеют в виду брожение сахара (превращение его в спирт) с использованием дрожжей, но, к примеру, при производстве йогурта используются другие виды брожения.
Использование брожения человеком обычно предполагает применение определенных видов и штаммов микроорганизмов. Вина иногда улучшают с использованием процессавзаимного брожения.
Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы — гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии (например, Lactobacillus delbrückii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии с суммарным уравнением:
C6H12O6 = 2CH3CHOH-COOH.
Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO2, а также образуют небольшое количество ароматических веществ — диацетила, эфиров и т. д.
При молочнокислом брожении превращение углеводов, особенно на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого от НАД-Н.
Гомоферментативное молочнокислое брожение, используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве.
Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит при консервировании различных плодов и овощей путём квашения.
Молочнокислое брожение представляет собой разложение сахара под действием молочнокислых бактерий с образованием молочной кислоты. В общем суммарном виде его можно представить следующим уравнением:
С6Н12О6 = 2С3Н6О3 + 18 ккал.
Это брожение часто наблюдается в молоке и вызывает его скисание. Отсюда и получили свое название вид брожения, бактерии, вызывающие его, а также основной продукт брожения — кислота. Молочнокислые бактерии бывают шаровидной и палочковидной формы. Они неподвижны, спор не образуют и являются факультативными анаэробами.
Различные виды молочнокислых бактерий в равных условиях продуцируют разное количество кислоты, что объясняется их неодинаковой кислотоустойчивостью. Палочковидные бактерии образуют больше кислоты, чем шаровидные (кокки).
Молочнокислые бактерии способны сбраживать только моно- и дисахариды и совсем не сбраживают крахмал и другие полисахариды, так как не выделяют соответствующих ферментов. Некоторые из этих бактерий вырабатывают антибиотические вещества, действующие против возбудителей кишечных заболеваний.
Молочнокислые бактерии широко распространены в природе, они постоянно встречаются в почве, на различных растениях, на плодах и овощах, в молоке и т. д.
Наибольшее значение имеют следующие молочнокислые бактерии: молочнокислый стрептококк, болгарская, ацидофильная, сырная, дельбрюковская, огуречная, капустная палочки и др.
Молочнокислый стрептококк — соединенные попарно или в короткие цепочки шаровидные бактерии. Лучше всего развиваются при температуре 30-35 °С, их температурный минимум около 10 °С. При брожении накапливают до 1 % кислоты. Широко применяются для приготовления молочнокислых продуктов (простокваши, кефира, сметаны, творога и др.).
Болгарская палочка нередко образует длинные цепочки, выделена из болгарской простокваши. Представляет собой неподвижную, бесспоровую палочку. Наилучшая для ее развития температура 40-45 °С, температурный минимум 20 °С. В молоке образует до 3,5%-ной молочной кислоты.
Ацидофильная палочка получена из выделений кишечника грудного ребенка. Имеет температурный оптимум около 40 °С, минимальная температура развития 20 °С. В молоке накапливает до 2,2%-ной молочной кислоты. Применяется для приготовления молочнокислых продуктов — ацидофилина и ацидофильного молока.
Сырная палочка имеет температурный оптимум около 40 °С, используется в сыроделии.
Дельбрюковская палочка представляет собой одиночные или собранные в короткие цепочки клетки, не образующие спор. Температурный оптимум 45 °С. Образует в среде до 2,5%-ной кислоты. Применяется для промышленного получения молочной кислоты, а также в производстве хлебных заквасок.
Огуречная и капустная палочки развиваются при квашении овощей. Молочнокислое брожение имеет важное промышленное значение. Оно применяется в производстве молочнокислых продуктов, в хлебопечении, в процессах квашения овощей и силосования кормов, при изготовлении кваса, в производстве молочной кислоты и т. д.
- Молочнокислое брожение в хлебопечении позволяет предотвратить развитие вредных бактерий в тесте, вызывающих картофельную болезнь (тягучесть) хлеба, а также способствует улучшению вкусовых свойств хлеба.
- Молочная кислота, образующаяся в результате этого брожения, придает особый вкус квашеным овощам и препятствует развитию гнилостных бактерий.
- При маслянокислом брожении происходит процесс разложения сахара под действием бактерий в анаэробных условиях с образованием масляной кислоты, углекислого газа и водорода. Оно протекает по уравнению:
- С6Н12О6 = С3Н7СООН + 2СО2 + 2Н2 + 20 ккал.
В качестве побочных продуктов при этом получаются этиловый и бутиловый спирты, уксусная кислота и др. Такое брожение может протекать в молоке и молочных продуктах, придавая им неприятные вкус и запах, характерные для масляной кислоты.
Маслянокислые бактерии, вызывающие это брожение, представляют собой перитрихиально жгутованные подвижные, спорообразующие палочки, температурный оптимум их развития находится в пределах 30-40 °С.
Они являются строгими анаэробами и могут размножаться только при полном отсутствии кислорода воздуха или при очень незначительном его содержании.
Споры, образуемые маслянокислыми бактериями, весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям, выдерживают кипячение в течение нескольких минут и погибают только при длительной стерилизации. Располагаются они либо в середине, либо ближе к одному из концов клетки, придавая ей форму веретена или теннисной ракетки.
Маслянокислые бактерии способны сбраживать как простые сахара, так и более сложные углеводы — крахмал, пектиновые вещества и другие, а также глицерин.
Эти бактерии широко распространены в природе, находясь в почве, в иле озер, прудов и болот, в скоплениях различных остатков и отбросов, навозе, загрязненной воде, молоке, сыре и т. д.
Вызываемое этими бактериями брожение имеет важное значение в превращениях веществ в природе.
В народном хозяйстве маслянокислое брожение может принести большой вред, так как маслянокислые бактерии способны вызывать массовую гибель картофеля и овощей, прогоркание молока и вспучивание сыров, порчу консервов и т. д.
На маслянокислые бактерии подавляюще действует кислая реакция среды, поэтому там, где развиваются молочнокислые бактерии, выделяющие молочную кислоту, жизнедеятельность маслянокислых бактерий приостанавливается.
Если же в заквашенных овощах медленно накапливается молочная кислота, то они могут быть испорчены в результате размножения в них маслянокислых бактерий.
Эти бактерии вызывают порчу пастеризованного молока, в котором исключено молочнокислое брожение, а также сырого молока при длительном хранении его на холоде, когда деятельность молочнокислых бактерий ослаблена.
Развиваясь во влажной муке, маслянокислые бактерии придают ей прогорклый вкус. Маслянокислое брожение находит практическое применение в производстве масляной кислоты, которая широко используется в технике.
- Методика выполнения лабораторной работы
- Цель работы: изучить процесс брожения как результат жизнедеятельности молочнокислых и маслянокислых бактерий.
- Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли и пипетки; покровные и предметные стекла; спиртовка; термостат; батистовая салфетка; набор пробирок; фильтровальная бумага; метиленовая синь; иммерсионное масло; бензин; молоко; кисломолочный продукт; неочищенный картофель; мел; раствор Люголя; смесь спирта и эфира (1:1); 5%-ный раствор FеСl3; этиловый спирт; концентрированная серная кислота.
- Опыт № 1. Получение микроорганизмов процесса молочнокислого брожения
- Инокулятом для получения накопительных культур молочнокислых бактерий могут служить кисломолочные продукты.
В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В пробирку со стерильным молоком вносят 1 мл кислого молока или другого молочнокислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со стерильным молоком) ставят в термостат при 30-32 °С на 1-2 дня (при 20-25 °С на неделю).
Затем отмечают по свертыванию молока характер роста микроорганизмов — образование сгустка (плотного, рыхлого, слизистого), газообразование. Далее проводят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовленного из культуральной жидкости.
Отмечают морфологические особенности бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т. д.
Учитывая особенность субстрата (молока), препарат фиксированных клеток готовят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло из пробирки с помощью стерильной бактериологической петли наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно размазывают покровным стеклом.
Мазок высушивают на воздухе, фиксируют (захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки) и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (1:1) в течение 10 мин, которую наносят непосредственно на мазок. После испарения смесь наливают повторно.
Высушенный мазок окрашивают мегиленовым синим (фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки; наносят на стекло из пипетки раствор красителя; срок окрашивания колеблется от 1 до 3 мин; в этот период краситель должен покрывать весь мазок, затем его смывают легкой струей воды, при этом смывается краситель, не адсорбированный микроорганизмами; потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтровальной бумагой).
Опыт № 2. Получение микроорганизмов процесса маслянокислого брожения
Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий в большую пробирку емкостью 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водопроводной водой (расстояние до пробки 2-3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80 °С в течение 10 мин на водяной бане, после чего помещают в термостат при 37 °С.
Через 1-2 суток в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек.
Отличительной способностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество — гранулезу, а также образовывать споры.
При спорообразовании клетки утолщаются либо в середине, либо в конце клетки. После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.
После 5-6 дней культивирования анализируют накопительную культуру. Для приготовления микроскопического препарата культуральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.
Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции.
1. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1-2 мл 5%-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за появления маслянокислого железа.
2. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1-2 мл 96%-ного этилового спирта, 1 мл конц. серной кислоты. После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах образовавшегося масляно-этилового эфира.
Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5-10 мин каплю конц. раствора Люголя, после чего накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темнокоричневый цвет.
Оформление и анализ результатов исследований
1. Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кефира, кислого молока, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.
2. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.
В ходе изучения данной темы студенты научатся получать накопительную культуру молочнокислых и маслянокислых бактерий и закрепят методы исследования микробиологических объектов, необходимые для их профессиональной деятельности.
Контрольные вопросы
1. Что такое молочнокислое брожение, и какое значение оно имеет для молочнокислых бактерий?
2. Какую форму имеют клетки молочнокислых бактерий?
3. Какой тип питания и дыхания у молочнокислых бактерий?
4. Одинакова ли оптимальная температура развития различных молочнокислых бактерий?
5. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению молочнокислых бактерий, и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?
6. Каково практическое использование молочнокислых бактерий?
7. Что такое маслянокислое брожение, и каково его значение для маслянокислых бактерий?
8. Какую форму имеют клетки маслянокислых бактерий, и образуют ли они споры?
9. Каков тип питания и дыхания маслянокислых бактерий?
10. Как обнаружить наличие в опыте маслянокислых бактерий и продуктов их жизнедеятельности? Подтвердить уравнениями реакций.
11. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению маслянокислых бактерий?
12. Каково практическое использование маслянокислых бактерий?
13. Какие еще виды брожения Вы знаете? Какой биологический смысл имеет процесс брожения для жизнедеятельности микроорганизмов?
ПредыдущаяСодержаниеСледующая
Химизм брожения и типы брожения
- С6Н12О6
2СН3СНОН-СООН - глюкоза молочная кислота
- При гетероферментативном брожении кроме молочной кислоты, образуется значительное количество уксусной кислоты, этилового спирта, глицерина и СО2. Окисление глюкозы молочнокислыми бактериями при этом идет по гексозомонофосфатному пути:
- С6Н12О6
→ 2СН3СНОН-СООН + СН3-СООН + СН3-СН2ОН + - глюкоза молочная кислота уксусная этиловый
- кислота спирт
- + СН2ОН-СНОН-СН2ОН + СО2
- глицерин
Молочнокислые бактерии относятся к трем семействам Lactobacteriaceae, Streptococcaceae и Peptococcaceae. Характерные виды молочнокислых бактерий относятся к родам Streptococcus, Lactobacillus и Leuconostoc.
По отношению
к источникам углерода и азота
молочнокислые бактерии сильно отличаются друг от друга. Это свойство используется для их систематики. Моносахариды легко сбраживаются всеми молочнокислыми бактериями. Дисахариды ассимилируются избирательно, а полисахариды сбраживаются лишь единичными культурами. Некоторые из них потребляют органические кислоты.
Молочнокислые бактерии потребляют аминокислоты, пептиды, иногда и белки в качестве источника азота. Они нуждаются в ростовом веществе (рибофлавине) и одновременно сами накапливают В1. Оптимумом температуры для их развития является 25-30ºС, минимальная — 5ºС, а максимальная – 55-57ºС. Спор не образуют, поэтому при дальнейшем повышении температуры они быстро погибают.
По отношению
к кислороду молочнокислые бактерии являются факультативными анаэробами, т.е. живут как при наличии кислорода воздуха, так и без него. При развитии довольно сильно подкисляют среду, поэтому приспособились к существованию в зоне кислого интервала.
Молоко, сквашенное бактерией Lactobacillus acidophilum, является хорошим лечебным средством при желудочно-кишечных заболеваниях.
В молоке и молочных продуктах обычно обнаруживают два вида бактерий — Lactobacillus casei и L.plantarum. Первая играет важную роль в созревании сыров, а вторая – при квашении овощей и силосовании.
Следовательно, молочнокислые бактерии имеют огромное практическое значение.
В различных
географических зонах в молоке встречаются
разные молочнокислые бактерии. Например, молоко в северной зоне содержит шаровидные бактерии Streptococcus lactis, а в южной полосе– палочковидные бактерии Lactobacillus caucasicum, L.bulgaricum. В связи с этим кислое молоко различных зон существенно различается по вкусовым качествам.
Ряд молочнокислых
продуктов готовят, используя закваску, содержащую симбиотические комплексы микроорганизмов. Например, для приготовления кефира в молоко вносят так называемые кефирное зерно. Оно содержит молочнокислые бактерии Lactobacillus casei и Streptococcus lactis, дрожжи Saccharomyces kefir. Продуктом брожения кефирного зерна являются молочная кислота и этиловый спирт.
Смешанное брожение наблюдается и при приготовлении
кумыса из кобыльего молока. В данном случае молочнокислое брожение осуществляется бактерией L.bulgaricum и дрожжами, сбраживающими лактозу.
При смешанном
брожении получают кислое молоко разной консистенции. Если молочнокислое брожение преобладает над спиртовым, то получается кислое молоко густой консистенции (простокваша, катык и др.). Если спиртовое брожение преобладает над молочнокислым получается жидкий продукт (кумыс, чал). Если оба типа брожения протекают в одинаковой степени, то получается полужидкий продукт (кефир).
Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются:
а) в молоке, местах его переработки и молочных продуктах
(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis);
б) на растениях
и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis; Leuconostoc mesenteroides);
в) в кишечнике
и на слизистых оболочках человека и животных
(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S. salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).
Streptococcus faecalis — обычный обитатель кишечника человека; S. bovis распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стрептококки являются безобидными обитателями слизистых рта, дыхательных и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты крови — весьма вирулентные возбудители болезней.
Благодаря образованию
больших количеств молочной кислоты, к которой сами они в значительной степени толерантны, молочно кислые бактерии при подходящих условиях могут
довольно быстро размножаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой причине их легко культивировать на элективных средах и легко выделять. «Естественные накопительные культуры» этих бактерий содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т.п.
Катаболизм
углеводов и продукты брожения. В зависимости от того, какие продукты образуются при сбраживании глюкозы — только молочная кислота или также другие органические продукты и СО2, — молочнокислые бактерии принято подразделять на гомоферментативные и гетероферментативные (табл. 8.2). Это старое деление отражает коренные различия в путях катаболизма сахаров.
Гомоферментативное молочнокислое
брожение. Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90% всех продуктов брожения).
Катаболизм глюкозы происходит у них по фруктозодифосфатному пути (бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу), а водород, отщепляющийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата, передается на пируват. От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы (а) и от наличия лактатрацемазы зависит, какой продукт образуется — D (-)-, L (+)- или DL-молочная кислота.
Лишь небольшая часть пирувата декарбоксилируется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и СО2, а также в ацетоин. Количество образующихся побочных продуктов зависит, по-видимому, от доступа кислорода.
Гетероферментативное
молочнокислое брожение. У гетероферментативных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозодифосфатного пути — альдолазы и триозофосфатизомеразы. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатному пути, т.е.
через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат (см. рис. 7.4 и 8.2).
Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который в результате тиаминпирофосфат-зависимой реакции, катализируемой пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата:
Нерастущие, отмытые
клетки Leuconostoc mesenteroides сбраживают глюкозу почти стехиометрически согласно уравнению
С6Н12О6 -> СН3-СНОН-СООН + СН3-СН2ОН + СО2
в лактат, этанол и двуокись углерода. Таким образом, у этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается
через ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол (рис. 8.2).
Другие гетероферментативные молочнокислые бактерии переводят ацетилфосфат частично или целиком в уксусную кислоту, что сопровождается переносом высокоэнергетической фосфатной связи на ADP с образованием АТР.
Избыток водорода передается в этом случае глюкозе, из которой образуется маннитол. Глицеральдегидфосфат через пируват превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и ацетат.
- При сбраживании
фруктозы гетероферментативными бактериями образуются лактат, ацетат, СО2 и маннитол: - 3 Фруктоза -»
Лактат + Ацетат + СО2 + Маннитол - Фруктоза при
этом служит акцептором избыточных восстановительных
эквивалентов: - Фруктоза + NADH2 -» Маннитол + NAD
Lactobacillus plantarum (= pentosus или arabinosus) сбраживает глюкозу по гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы, превращая в лактат и ацетат.
Следует отметить, что даже такая типичная гомоферментативная бактерия, как Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат гетероферментативным путем. Рибоза индуцирует у нее синтез фосфокетолазы.
Если клетки, выросшие на среде с рибозой, отмыть, то после этого они и глюкозу будут сбраживать как гетероферментативные бактерии.
Брожение, осуществляемое Bifidobacterium bifidum. Гетероферментативная молочнокислая бактерия В.bifidum получила это название за свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus-раздвоенный). Она известна тем, что преобладает в кишечнике грудных детей, особенно детей, вскармливаемых грудью.
Эту зависимость ее распространения от способа кормления грудного ребенка можно было связать с потребностью бактерии в углеводах, содержащих N-ацетилглюкозамин, которые имеются только в молоке человека, но не коровы.
Все представители рода Bifidobacterium — строгие анаэробы; они не переносят присутствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% СО2.
С тех пор как стали известны эти необычные для молочнокислых бактерий особенности, бифидобактерии были обнаружены и в кишечной флоре взрослых людей, и во многих других местах, даже в гниющем иле, и теперь различают много видов этого рода. Бифидобактерии расщепляют глюкозу согласно уравнению
2С6Н1206 -> 2СН3- СНОН-СООН + ЗСН3-СООН
Т.е. сбраживают ее по фосфокетолазному побочному пути. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие фруктозо-6-фосфат и ксилулозо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат или глицеральдегид-3-фосфат. Гексозы претерпевают следующие превращения:
Применение молочнокислых бактерий в домашнем хозяйстве, сельском хозяйстве и для приготовления пищевых продуктов.
Если нестерильный раствор, содержащий наряду с сахарами также сложные источники азота и факторы роста, оставить без доступа воздуха или просто налить в сосуд достаточно большое количество такого раствора, то вскоре в нем появятся молочнокислые бактерии.
Они снижают рН до значений < 5 и тем самым подавляют рост других анаэробных бактерий, которые не могут развиваться в столь кислой среде. Какие именно молочнокислые бактерии вырастут в таких накопительных культурах, зависит от прочих условий.
Благодаря своему стерилизующему и консервирующему действию, основанному на подкислении среды, молочнокислые бактерии используются в сельском и домашнем хозяйстве и в молочной промышленности.
Приготовление силоса. Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют большую роль при запасании впрок кормов для скота. Для приготовления силоса используют листья сахарной свеклы, кукурузу, картофель, травы и люцерну.
Растительную массу прессуют и прибавляют к ней мелассу, чтобы повысить отношение C/N, и муравьиную или какую-либо неорганическую кислоту, чтобы заранее обеспечить преимущественный рост лактобацилл и стрептококков.
В таких условиях происходит контролируемое молочнокислое брожение.
Приготовление кислой капусты. Кислая капуста тоже представляет собой продукт, в приготовлении которого участвуют молочнокислые бактерии.
В мелко нарезанной, посыпанной солью (2-3%) и спрессованной белокочанной капусте при исключении доступа воздуха начинается спонтанное молочнокислое брожение, в котором принимает участие сначала Leuconostoc (с образованием СО2), а позднее Lactobacillus plantarum.
Молочные
продукты. Молочнокислые бактерии, образующие кислоту и придающие продуктам определенный вкус, находят широкое применение в молочной промышленности.
Стерилизованное, или пастеризованное молоко, или же сливки сбраживают, прибавляя в качестве закваски чистые («стартовые») культуры молочнокислых бактерий. Кисломолочное масло готовят из сливок, сквашенных с помощью Streptococcus lactis, S.
cremoris и Leuconostoc cremoris. Образующийся в процессе брожения диацетил придает маслу специфический аромат.
Закваски, содержащие Streptococcus lactis или Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus, вызывают свертывание казеина при приготовлении творога и немецких сыров (гарцского и майнцского).
При изготовлении твердых сыров (в отличие от сыров из кислого молока) для свертывания казеина пользуются сычужным ферментом.
Молочнокислые бактерии (Lactobacillus casei, Streptococcus lactis) вместе с пропионовокислыми участвуют лишь на стадии созревания сыров.
Для приготовления
молочнокислых продуктов (табл. 8.3) в
качестве заквасок тоже используются стартовые культуры молочнокислых
бактерий, образующих кислоту и некоторые вещества, придающие продукту характерный запах.
Ароматное пахтанье получают с помощью упомянутых выше заквасок, применяемых для приготовления кисломолочного масла. Пахтанье наряду с молочной кислотой содержит также уксусную кислоту, ацетоин и диацетил.
Йогурт получают из пастеризованного гомогенизированного цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus (после внесения закваски молоко выдерживают 2-3 ч при 43-45°С).
Под названием биогурт в продажу поступает кислое молоко, сквашенное Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. Кефир принадлежит к молочнокислым продуктам, содержащим кислоты и этанол; его получают из молока (коровьего, овечьего или козьего).
Закваску готовят на так называемых кефирных зернах, которые состоят из пока еще не полностью изученного сообщества организмов, включающего лактобациллы, стрептококки, микрококки и дрожжи. Сквашивание молока ведут при 15-22°С в течение 24-36 ч. Для приготовления кумыса используют ослиное молоко, которое инокулируют культурой, содержащей Lactobacillus bulgaricus и дрожжи рода Torula.
Загрузка...
