Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий. Тест на нитратредуктазную активность бактерий. Хроматография при идентификации бактерий. Индикаторные бумажки для идентификации бактерий.

Набор «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-12» 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Цитрат натрия Сероводород ONPG Фенилаланин Лизин Орнитин Индол Малонат натрия Мочевина Сорбит Инозит АМК А 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Цитрат натрия Сероводород ONPG Фенилаланин Лизин Орнитин Индол Малонат натрия 9. Мочевина 10. Сорбит 11. Инозит 12. АМК

Постановка контрольных штаммов на «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-12»

A B C D E F G H 1 2 3 Набор «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24» 1 стрип 2 стрип 3 стрип 1 Цитрат натрия АМК Сорбит 2 Малонат натрия Индол Арабиноза 3 Эскулин Глюкоза Мальтоза 4 Лизин ONPG Адонит 5 Аргинин Лактоза Трегалоза 6 Орнитин Маннит Рамноза 7 Сероводород Сахароза Дульцит 8 Фенилаланин Инозит Мочевина

Постановка контрольных штаммов на «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24»

Р — 1431 Набор для биохимической идентификации и межвидовой дифференциации сальмонелл «ДС-ДИФ-САЛЬМОНЕЛЛА» Одноэтапная видовая биохимическая идентификация сальмонелл по 8 признакам, для изучения образования сероводорода и газа из глюкозы использовать среду Олькеницкого • • Экономически выгоден в сравнении с наборами с большим количеством тестов Рекомендуется к применению в лабораториях, занимающихся выделением и идентификацией сальмонелл Набор рассчитан на 24 анализа (24 вертикальных 8 -ми луночных стрипа) В составе набора готовый к применению раствор для приготовления микробной суспензии, отсутствие дополнительных реактивов Ссылка в инструкции по применению на использование контрольных штаммов для контроля специфической активности набора Каталог кодов входит в состав набора Возможность транспортирования набора при температуре до 20°С в течение 9 суток

Постановка контрольных штаммов на «ДС-ДИФ-Сальмонелла» 1 A B C D E F G H 1 стрип А. Цитрат натрия В. Лизин С. Орнитин D. Малонат натрия E. ONPG F. Лактоза G. Сорбит H. Дульцит

Коринебактерии Облигатные паразиты животных Облигатные паразиты человека Сапрофиты Условно-патогенные: Патогенные: C. ulcerans, C. pseudotuberculosis. Казеозные и гнойные лимфадениты, язвы, дифтериеподобные заболевания у крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, лабораторных животных Патогенные: C. diphtheriae (палочка Клебса.

Леффлера)-возбудитель дифтерии -поражения ротоглотки, носа и дыхательных путей, редкой локализации (глаз, наружных половых органов, кожи, раневых поверхностей), общая интоксикация организма с поражением внутренних органов и систем C.

jeikeium – поражения кожи, пневмонии, эндокардиты, перитониты, госпитальные поражения у пациентов с патологией кроветворения и сосудистыми шунтами; C. cistitidis – госпитальные пневмонии и бактериемии, воспаления кожи и слизистых оболочек, развитие мочекаменной болезни; С.

minutissimum – краснокоричневая сыпь (эритразма) в подмышечной и паховой областях, абсцессы легких, эндокардиты, септикопиемии; С. pseudodiphtheriticum (C. hofmanii); C. xerosis и другие дифтероиды (распространены в воздухе, почве, пыли, воде, пищевых продуктах)

Р-1031 Набор для биохимической идентификации и дифференциации микроорганизмов рода коринебактерий, в том числе возбудителя дифтерии «ДС-ДИФ-КОРИНЕ» A B C D E F G 1 1 стрип А. Глюкоза В. Сахароза С. Крахмал D. Мальтоза E. Фруктоза F. Галактоза G. Нитратредуктаза H. Уреаза H + утилизация цистиназы + определение токсигенности

«ДС-ДИФ-НЕФЕРМ» Тест-система для биохимической идентификации и дифференциации грамотрицательных неферментирующих бактерий

РО-132 Тест для выявления у микроорганизмов фермента цитохромоксидазы «ДС-ОКСИДАЗА» Нанесение микробной массы 30 сек Контрольные штаммы Реакция Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Enterobacter sakazakii 354/80 Alcaligenes faecalis 373 Escherichia coli 1882 Pseudomonas aeruginosa 1960 CCM + +

Интерпретация результатов с помощью каталога кодов Научно-производственное объединение «Диагностические системы» Дата________________ КОДОВАЯ КАРТОЧКА Источник выделения__________________ Штамм № ______________ Пластина биохимическая дифференцирующая энтеробактерии (ПБДЭ) ТЕСТЫ Числовые значения теста Результат теста ( «+» или «-» ) ЦН МН 4 2 — — Сумма положительных результатов Кодовое число ЦНГ ЛИЗ АРГ ОРН ФА ИНД АМК УР Н 2 S ГЛ β-ГАЛ ЛАК МТ САХ ИН СОР 1 4 2 1 + + — — + + 1 4 — 2 + 4 1421757 Серологическая Идентификация Результат 1 Escherichia coli 4 — 2 — — 1 1 + 4 + 2 + 1 + 4+2+1=7 4 + 2 — 4+1=5 АР МАЛ ПОДВ 4+2+1=7

Программное обеспечение для идентификации бактерий

Программное обеспечение для идентификации бактерий

Учет результатов ПБДЭ – (20 тестов) ПБДС – (17 тестов) ДС-ДИФ-САЛЬМОНЕЛЛА Программа ДС ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24 ДС-ДИФ-ЭНТЕРО – 12 ДС-ДИФ-СТАФИ-16 ДС-ДИФ-НЕФЕРМ ДС-ДИФ-КОРИНЕ «Микроб-2»

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

Методы выделения и идентификации бактерий

 Биохимические методы идентификации бактерий

 Методов, 
используемых для идентификации 
особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

  Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают 
по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов.

При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид.

Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные 
поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Расщепление белков

Некоторые бактерии проявляют 
протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ.

При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз.

Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H2S.

Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты {при образовании индола бумажка краснеет), во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H2S бумажка чернеет). Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном результате наблюдают появление красного кольца.

Хроматография

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий.

Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии.

Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий.

У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Индикаторные 
бумажки

Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов. 

Система индикаторных бумажек (СИБ) — набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии.

Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37  0С.

 

Наборы 
мультимикротестов — пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37 °С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч. 

Автоматические 
системы идентификации бактерий 

Автоматические 
системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.

Системы Microscan. Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа — 2 ч).

Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа — 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.  
Системы Vitek.

Читайте также:  Ламитор - инструкция по применению, аналоги, отзывы и формы выпуска (таблетки 25 мг, 50 мг и 100 мг, диспергируемые дт) лекарства для лечения эпилепсии, судорог и припадков у взрослых, детей и при беременности

В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками.В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке.

В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически. 

Методы идентификации 
нуклеиновых кислот

Методы выявления 
РНК и ДНК возбудителей нашли 
применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация 
нуклеиновых кислот

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот (рис. 1-17). Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты (рис. 1-18, А). Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе (рис. 1-18, Б) и его сэндвич- модификация (рис. 1-18, В) распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ   ЦЕПНАЯ   РЕАКЦИЯ  (ПЦР)

Основу метода ПЦР составляет катализируемое ДНК-полимеразой 
многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг — термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек.

Для запуска реакции применяют синтетические праймеры — олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в 50-1000 оснований.

Затем в среду вносят термостабильную taq-полимеразу (по названию бактерии Thermus aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают.

Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис. 1-19).

ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод ПЦР лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.

Серологические методы

Классические 
серологические реакции применяют 
для выявления бактериальных AT, а также для выявления Аг, особенно для идентификации бактериальных Аг. Среди современных методов наибольшее распространение нашли методы твердофазного ИФА и латекс-агглютинации.

Аллергологические методы

Сенсибилизирующей активностью обладает ограниченное количество бактериальных Аг. Поэтому метод кожных проб применяют лишь при диагностике туберкулёза, сапа, мелиоидоза, бруцеллёза и туляремии.

Биологические методы

Выделение патогенных бактерий от заражённых животных имеет 
большую диагностическую ценность, особенно при контрольном применении иммунных сывороток. Цель подобных манипуляций — уменьшение времени проведения бактериологических исследований.

  • При диагностике инфекций, вызванных эффектами токсина (например, ботулизма или сибирской язвы), материал, предположительно содержащий возбудитель и токсин, помещают в физиологический раствор, а затем фильтруют через бумажные фильтры, натёртые тальком (последний хорошо адсорбирует токсин). Смывами с фильтров заражают чувствительных животных. 
  • При диагностике инфекций, обусловленных различными патогенными свойствами самого возбудителя, лабораторных животных заражают микробной взвесью. 
  • Для диагностики бактериальных инфекций используют различных животных, так как проявляют видовую восприимчивость к различным этиологическим агентам.
  • Мыши чувствительны к пневмококкам, нейссериям, пастереллам, клостридиям, листериям, возудителям сибирской язвы, туляремии, чумы, ботулизма, столбняка, коклюша и мелиоидоза  
  •  Крысы чувствительны к возбудителям туберкулёза (бычьего типа), мелиоидоза и др.
  • Морские свинки чувствительны к возбудителям туберкулёза (человеческого типа), дифтерии, сапа, чумы, бруцеллёза, туляремии, холеры, газовой гангрены, ботулизма, псевдотуберкулёза и др.
  •  Кролики чувствительны к стафилококкам, стрептококкам, нейссериям, Mycobacterium bovis, возбудителям газовой гангрены, сибирской язвы, ботулизма, столбняка и др.

Кошки. Животных заражают стафилококками, возбудителями сапа, коклюша и др. 

Обезьяны. Их заражают шигеллами, листериями, сальмонеллами, возбудителями мелиоидоза, коклюша и др.

 Птицы. Кур и голубей используют для диагностики туберкулёза (птичьего типа), пастереллёза, риносклеромы и др.

  Заключение

Подробно рассмотрев известные способы идентификации различных микроорганизмов, можно сделать вывод, что в основном это длительный и трудоемкий процесс, требующий достаточного набора знаний, оборудования и специальных условий.

Но не смотря на все трудности,  диагностика необходима  в целях идентификации микроорганизмов при установлении диагноза инфекционных заболеваний или иных вызванных микробами процессов и определения физиологических свойств  культуры с другими целями, например при выборе химиотерапевтического препарата. Но жаль, что пока не существует универсального метода для быстрого и качественного определения микроорганизма. Каждый метод подходит для определённого ряда инфекций и не годиться для определения возбудителей других заболеваний. Также мало пока способов внелабораторной диагностики, потому что, например, часто необходимо наличие чистой культуры, что практически невозможно создать в полевых условиях. В мире постоянно появляются или обнаруживаются новые неизвестные микроорганизмы и, возможно, от скорости их идентификации будет зависеть жизнь многих людей. Из всего этого можно сделать вывод, что человечеству необходимо уделять больше внимания развитию микробиологии.

Литература:

  1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., «Медицинская микробиология, вирусология, иммунология», Москва, 1994 г.
  2. Гурина С.В., Соколова И.П., «Микробиология», СПб, 2000 г.
  3. Красильников А.П., Романовская Т.Р., «Микробиологический словарь-справочник», Минск, 1999 г.
  4. Поздеев О.К. под ред. Покровского В.И., «Медицинская микробиология», Москва, 2002 г.
  5. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., «Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии», Ростов-на-Дону, 2002 г.

Изучение ферментативной активности бактерий для идентификации микроорганизмов

Каждый вид микроорганизмов характеризуется специфическим набором ферментов, в связи с этим определение ферментного спектра является важнейшим этапом идентификации микроорганизмов. О наличии ферментов судят по способности микроорганизмов воздействовать на определенный субстрат.

Проявление ферментативной активности характеризуется изменением физического состояния субстрата (разжижение желатины), закислением питательной среды (среды Гисса с углеводами, среда Ресселя, среда Олькеницкого), образованием определенных продуктов метаболизма (индол, сероводород, аммиак) и т.д.

В идентификации видовой принадлежности особенно важное значение имеет определение у бактерий гидролаз и оксидоредуктаз. Группу гидролаз по действию на различные вещества практические микробиологи делят на сахаролитические, протеолитические, липолитические ферменты.

Определение сахаролитических гидролаз (карбогидраз — ферментов, разлагающих углеводы) проводят с помощью биохимического ряда Гисса. Определение протеаз — ферментов, разлагающих белки, проводят обнаружением газов, являющихся конечным продуктом ферментации белков (индол, сеоводород, аммиак).

с помощью специальных индикаторов. Липазы — ферменты разлагающие липиды, чаще всего определяют наличие лецитиназы посевом на желточный агар.

Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид в этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Среди оксидоредуктаз различают оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы. Определение последних имеет важное значение для дифференциации обширных групп родственных микроорганизмов (например, семейства Enterobacteriaceae).

Наиболее распространены следующие методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

4. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

Сахаролитическиесвойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа чаще всего изу­чают на дифференциально-диагностических средах Гисса, которые содержат питательный агар, тот или иной углевод и индика­тор Андреде (ВР или др.).

Читайте также:  Тыльная поверхность пальцев кисти. Тыл пальцев. Слои тыльной поверхности пальцев.

В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крах­мал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.

), в про­цессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты (С02, Н2, СН4).

В состав короткого “пестрого” ряда Гисса входит 5 углеводов: с глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза и сахароза. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами.

Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроорганизмов одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и соответственно цвет питательной среды.

По консистенции среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца.

“По­плавок” помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности.

Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Критерии учета результатов:

· цвет среды не меняется — культура не ферментирует углевод;

· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот), пробирку отмечают буквой «К»;

· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке — культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов. Такую пробирку отмечают буквами «КГ».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находя­щийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кис­лота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Таблица 17. Дифференциально-диагностические среды

Наименование и внешний вид среды Состав (компоненты) Назначение Принцип действия и внешний вид среды после посева
Среда Эндо Бледно-розовая плотная сре­да, разливается в чашки Петри Питательная основа-МПА, субстрат — лактоза, индикатор — основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия (Na2SO3) Для рассева исследуемого материала (нативного или после обогащения) с целью получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных знтеробактерий: эшерихий, сальмонелл, шигелл, йерсиний и других На среде можно наблюдать рост красных или бесцветных колоний. Эшерихии разлагают лактозу до кислых продук­тов, в том числе альдегидов, они соединятся с сульфитом натрия, при этом освобождается фуксии, который окраши­вает колонии и среду в красный цвет, часто с метал­лическим зеленоватым блеском (положительный результат). Сальмонеллы и шигеллы не разлагают лактозу и образуют бесцветные колонии (отрицательный результат).
Среда Левина Плотная среда красновато-фиолетового цвета. Среда является дифференциально-диагностической и слабо се­лективной, так как оказыва­ет ингибирующее действие на грамположительную микрофлору Питательная основа-МПА, Субстрат — лактоза. Индикаторы — эозин и метиленовый синий Для получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных энтеробактерий — см. среду Эндо. Среда Левина может быть использована также для выделения грибов Candida albicans На среде можно наблюдать рост синих или бесцветных колоний. Escherichia coli, разлагающая лактозу, вызывает сдвиг рН в кислую сторону, при этом комплекс индикаторов эозина и метиленового синего выпадает в осадок и колонии приобретают темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с металлическим блеском (положительный результат). Энтеробактерии не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные колонии.
Среды Гисса Набор пробирок с полужидкой средой розового цвета. Питательная основа — полужидкий МПА (0,4%), Субстрат (в каждой пробирке разный углевод), Индикатор — бром крезоловый пурпурный или BP (водный голубой и розоловая кислота) Определение спектра сахаролитической активности с целью идентификации (определение родовой и видовой принадлежности) выделенной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также других семейств и родов. При ферментации субстрата образуются кислые продукты (молочная, уксусная, муравьиная и другие кислоты), кото­рые снижают значение рН и розовый цвет индикатора изменяется на синий, что указы­вает на положительную реакцию. При образовании газа (Н2 и СО2) — пузырьки и трещины в толще среды. Рост бактерий в среде Гисса без изменения ее цвета свидетельствует об отсутствии фермента, расщепляющего данный углевод, то есть об отрицательной реакции

5. Методы определения протеолитической активности бактерий

Протеолитическая активность микробов направлена на расщепление белков до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов. Действие протеолитических ферментов изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном.

Тест на желатиназу. Культуру микроорганизмов засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины.

Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение нескольких (5-7) дней, при этом регистрируют не только наличие разжижения, но и его характер.

Разжижение может быть послойным, что свойственно бактериям сине-зеленого гноя; холерный вибрион разжижает желатину в виде гвоздя; стафилококки – в виде чулка. Рост сибиреязвенных бацилл напоминает елочку, перевернутую вершиной вниз (характер разжижения послойный).

Тест на растворение свертка казеина. Культуру засевают на обезжиренное молоко.

Культура расщепляет молочный сахар (лактозу) и за счет закисления среды наблюдается свертывание молочного белка (казеина).

При выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется – пептонизируется, в результате чего молоко просветляется и приобретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки формируется осадок.

Тест на свернутой кровяной сыворотке. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола. Для обнаружения индола по спо­собу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают.

Индикатор­ную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой, предварительно произведя посев исследуемой культуры. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобре­тает розовый цвет.

Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы при расщеплении сложной гетероциклической кислоты — триптофана.

Определение сероводорода. Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бу­маги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют меж­ду стенкой засеянной пробирки и пробкой.

Читайте также:  Лимфатическая система, systema lymphaticum. Функция, строение лимфатической системы

При взаимодействии серово­дорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования суль­фида свинца.

Тест на аммиак.Аммиак определяют при помощи увлажненной розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Посевы инкубируют в термостате 1-5 суток. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Идентификация бактерий по разным признакам: неферментирующие, грамотрицательные

Главная › Всё о бактериях › Разновидности

Изучение микроорганизмов невозможно без распознавания принадлежности отдельных их колоний к тем или иным биологическим видам, типам, родам и т.д. Процесс аутентификации организмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований. В бактериологии (раздел микробиологии) эта процедура носит название идентификация бактерий.

Методы проведения исследований по распознаванию микробов

Метод познания того или иного предмета представляет собой комплекс мер по решению определенной задачи.

Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались микробиологами и бактериологами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно используются в науке, медицине, фармацевтике и даже в промышленном производстве (в том числе и продуктов питания). Основными методами распознавания бактерий являются:

  • метод прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почв и осадков;
  • прямые методы оценки метаболической активности клетки;
  • метод молекулярного анализа;
  • метод обратной транскрипции.

Перечисленные методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом для большого количества методик, которые позволяют определять такие свойства бактерий, как:

  • морфологические (особенности и индивидуальные свойства строения клеток);
  • культуральные свойства (питание, дыхание, условия для роста бактериальной культуры);
  • ферментативные (биохимические свойства, связанные со способностью бактериальной культуры расщеплять сахара, белки, разрушать эритроциты);
  • антигенные (свойства, связанные с особенностями антигенов чистой бактериальной культуры).

Установление специфических свойств дает возможность исследователю составить максимально полное представление о выделенной культуре бактерий.

Стадии идентификации

Несмотря на вековую историю изучения микроорганизмов, микробиология и сегодня испытывает сложности в изучении бактерий. Причина тому – микроскопические размеры самих организмов и продуктов их жизнедеятельности. Трудности присутствуют на всех стадиях. Всего основных стадий пять:

  1. Выделение чистой культуры.
  2. Приготовление суспензии и инокуляция лунок.
  3. Инкубационный период.
  4. Фиксация результатов.
  5. Выводы и интерпретация результатов.

Порядок реализации каждой стадии зависит от того, идентификация на какие бактерии должна быть выполнена исследователем (аэробные, неферментирующие, грамотрицательные и т.д.).

Выделение чистой культуры

Идентификация любых бактерий невозможна без выделения чистой культуры.

Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие микробов других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь производит неверные заключения. Для выделения чистой культуры используются различные методы, большинство из которых основано на бактериальных чашечных посевах:

  • в чашки с различными питательными средами рассевают отобранные из собранных проб образцы;
  • выращенные отдельные колонии (культуры) высевают на специально подобранных средах, чтобы по продуктам жизнедеятельности колонии в питательной среде изучать биохимические реакции, протекающие внутри бактериальной клетки и вне ее.

Так, например, для выделения чистой аэробной (кислородозависимой) культуры практикуется следующая методика:

  • исследователь производит механическое дробление исследуемой пробы;
  • одну каплю изучаемого материала растирают по поверхности мясо-пептонного агар-агара (МПА);
  • тем же шпателем (только без нового материала) производят посев еще на нескольких чашках с таким же МПА.

Полученные образцы с аэробными сообществами могут изучаться в свете идентификации на бактерии определенных родов.

Проверка по Граму

Практически при каждом бактериологическом исследовании в микробиологии бактериолог проводит проверку культуры по Граму (так называемое окрашивание по Граму). Это исследование дает возможность выявить наличие в образце грамотрицательных микроорганизмов.

Грамотрицательные бактерии имеют особым образом устроенную клеточную стенку, которая состоит из нескольких белковых слоев (белок муреин).

Вследствие такого устройства клеточной стенки, в грамотрицательных бактериальных клетках транспорт веществ внутрь клетки и за ее пределы имеет свои специфические черты. Это обстоятельство является важным при изучении биохимической активности грамотрицательных микроорганизмов.

Без изначального определения особенностей строения клеточной стенки невозможно правильно подобрать питательную среду для дальнейшего культивирования и изучения грамотрицательных бактерий.

Идентификация по ферментативной активности

В результате изучения ферментативной активности бактерии (синтез определенных ферментов) исследователи могут давать достоверные заключения о принадлежности микроорганизмов к тем или иным биологическим родам, семействам и даже видам. Ферментативная активность исследуется по пяти основным направлениям:

  1. Изучение изменения уровня кислотности питательной среды.
  2. Изучение конститутивных ферментов (постоянно синтезируемых в бактериальной клетке). Этот метод позволяет идентифицировать микроорганизмы без создания специализированных условий для их роста. Так, например, производится идентификация на бактерии рода Bacillus, которые требуют особых условий для культивирования, поскольку являются анаэробами (среди представителей рода Bacillus есть также аэробные виды).
  3. Использование меченых источников углерода.
  4. Исследование конечных продуктов жизнедеятельности (метаболизма) бактерий в питательной среде.
  5. Идентификация на бактерии по визуальному выявлению признаков роста колонии (степень помутнения).

Интерпретация результатов проведенных исследований и тестов производится с соблюдением следующих трех принципов:

  1. Должно быть выявлено и изучено максимальное количество признаков.
  2. Ни один из признаков не является заведомо более весомым.
  3. Идентификация результируется как коэффициент соответствия признаков выделенной исследователем культуры свойствам эталонного штамма.

Эталонные штаммы чаще всего представлены на планшетах тест-систем, которые позволяют завершить идентификацию бактерий определенного рода по исследованным биохимическим признакам.

Идентификация неферментирующих аэробных грамотрицательных микроорганизмов

Для родов бактерий этого типа (НГОБ) разработаны специализированные тест-системы, позволяющие определить принадлежность микроорганизмов к определенным группам. Определяется присутствие НГОБ по биохимическому составу питательных сред, на которых выращивались исследуемые бактериальные колонии.

Особенность неферментирующих микробов состоит в том, что они не разлагают молекулы глюкозы, а используют ее в качестве окислителя (гликолиз). К основным родам неферментирующих бактерий относятся аэробные Pseudomonas, аэробные Acinetobacter, аэробные Burkholderia, аэробные Stenotrophomonas.

Идентификация на НГОБ позволяет определить наличие патогенных микроорганизмов в собранных образцах и вовремя предпринять меры по предотвращению распространения инфекции.

Серологическая идентификация

Этот вид распознавания микроорганизмов применяется для идентификации антигенов бактериальной культуры. Серологические исследования проводятся с использованием иммунной диагностической сыворотки, по которой изучаются иммунные реакции исследуемых микроорганизмов:

  • агглютинации;
  • преципитации;
  • нейтрализации;
  • с использованием меченых антител.

Реакция агглютинации заключается в констатации выпадения осадка (агглютината), который появляется в результате взаимодействия бактериальной клетки с определенными антителами. Серологическая реакция преципитации заключается в выявлении антигенов, вырабатываемых определенными микробами на антитела, с образованием характерного мелкозернистого осадка.

Опасность неидентифицированного многообразия

Колоссальное количество неидентифицированных микроорганизмов, которые постоянно окружают человека в быту, может нести потенциальную угрозу для здоровья и даже для жизни.

 Так, микробиологами было исследовано наличие представителей рода спорообразующих бактерий Bacillus в колбасных и мясных продуктах, которые реализуются с полок магазинов.

Как выяснилось, патогенные Bacillus присутствуют во всех видах колбас и в обработанных мясных продуктах:

  1. В сырокопченых колбасах содержится более миллиарда представителей рода Bacillus на 1 г продукта.
  2. В фарше также присутствует восьмизначное количество Bacillus, возбудителя сибирской язвы.
  3. В сосисках и вареных колбасах Bacillus представлен только тысячей КОЕ на 1 г продукта.
  4. Более всего представителей рода Bacillus было обнаружено в ферментированных колбасах. Исследователи отмечают не только многочисленность бактерий рода Bacillus в этих продуктах, но и видовое разнообразие.

При этом не стоит упускать из виду, что спорообразующие аэробные Bacillus при возникновении благоприятных условий для роста и размножения являются самыми опасными возбудителями инфекционных заболеваний, а при неблагоприятных – образуют термоустойчивые споры и готовы ждать своего часа сколь угодно долго.  

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector