Нейтрализирующие антигенные участки вируса. Гликопротеины вируса.

• Оглавление
• Что такое антитела к коронавирусу?
• Методы определения антител к коронавирусу
• Что выбрать – качественный или полуколичественный анализ?
• Показания к проведению исследования
• Как проводится тест
• Расшифровка результатов теста на антитела к коронавирусу
• Ig G – расшифровка анализа на антитела к коронавирусу
• BAU/мл – новая расшифровка анализа на антитела к коронавирусу

Что такое антитела к коронавирусу?

Антитела (другое название – иммуноглобулины) – это специальные белки, которые вырабатываются и (или) продуцируются плазматическими клетками.

Что делают иммуноглобулины?

Иммуноглобулины образуются в ответ на попадание в организм чужеродных бактерий или вирусов. Они взаимодействуют с антигеном (специфическим участком вредителя) и обезвреживают его.

Таким образом наш иммунитет стоит на страже нашего здоровья.

Какие классы иммуноглобулинов существует?

Выделяют 5 классов иммуноглобулинов, некоторые из которых содержат подклассы.

IgA – секретируются на поверхности эпителия и присутствуют в слюне, слезе, на поверхности слизистых.

IgM – обнаруживается при первичном попадании антигена. Указывает на острый инфекционный процесс у человека.

IgG – основной класс иммуноглобулинов, защищающий от вирусов, бактерий, токсинов.

IgD – обнаруживают на поверхности развивающихся B-лимфоцитов. Функция не установлена.

IgE – секретируются при аллергической реакции немедленного типа.

Методы определения антител к коронавирусу

Существуют два метода определения иммуноглобулинов к коронавирусу в организме человека – ИФА и ИХА.

Иммуннохроматографический анализ – это качественный метод определения иммуноглобулинов классов М и G.

Качественный метод – это метод, позволяющий только определить наличие антител в организме. Иными словами, ответить на вопрос – есть они или нет.

1. Иммуноферментный анализ – это количественный метод определения иммуноглобулинов.
2. Количественный метол – не просто говорит о наличии антител, но и показывает их количество в единице объема крови.
3. Для анализов проводят забор венозной крови, следовательно, подготовка к процедуре стандартная:

1. Проводить исследование на пустой желудок (не есть за 8 часов до процедуры).

2. Воздержаться от питья воды за час до забора крови.

3. Для курильщиков – не курить за 2 часа до процедуры.

Что выбрать – качественный или полуколичественный анализ?

Для чего проводится качественный и количественный анализ?

Качественный анализ позволяет ответ на 2 вопроса:

1. Болел или нет?

2. Как давно болел?

Полуколичественный тест позволяет ответить на эти вопросы, а также определить количество иммуноглобулинов в организме.

Для чего определять количество иммуноглобулинов?

Определение количества антител позволяет определить, сформирован ли долговременный иммунитет. Именно он защищает на организм от повторного заболевания коронавирусом.

Показания к проведению исследования

Показаниями к проведению анализа является:

1. Наличие симптомов общего недомогания. В этом случае тестирование проводится для подтверждения диагноза.

2. При контакте с носителем или больным коронавирусной инфекцией.

3. По желанию – для лабораторной оценке иммунного статуса.

Как проводится тест

1. Необходимо прийти в Клинику МЕДЕЛ по предварительной записи.

2. Процедура проводится путем забора крови.

3. В Клинике МЕДЕЛ результаты изготавливаются в течение 1 дня.

Расшифровка результатов теста на антитела к коронавирусу 

Как расшифровать качественный тест на антитела к коронавирусу

Есть/Нет	Ig G (Есть)	Ig G (Нет)
Ig M (Есть)	1 вариант	2 вариант
С момента заражения прошло 5-10 недель. В крови еще присутствуют IgM, но уже образуются IgG	Острая фаза заболевания. С момента заражения  прошло 1-3 недели
Ig M (Нет)	3 вариант	4 вариант
С момента болезни прошло несколько месяцев. Вы могли перенести заболевание в бессимптомной форме	Вы не сталкивались с вирусов или с момента заражения прошло не более 7-ми дней

• Антитела к коронавирусу – таблица с расшифровкой результатов
• Во 2-м и 4-м варианте (при наличии подозрительных симптомов) рекомендуется сдать ПЦР тест на коронавирус для выявления вредителя.
• Полное отсутствие иммуноглобулинов может также означать, что:
• 1)     Не были соблюдены условия подготовки и результат искажен
• 2)     Симптомы гриппа или ОРВИ были похожи на симптомы коронавируса,
• 3)     Пациент перенес заболевание в легкой форме, и антитела не выработались.
• 4)     Пациент перенес заболевание в тяжелой форме, и антитела быстро исчезли. 

Ig G – расшифровка анализа на антитела к коронавирусу

Для определения иммуноглобулинов класса G в крови используют качественный и количественный метод определения антител. Ниже представлена таблица с расшифровкой иммуноферментного анализа на коронавирус (показатель igG при коронавирусе).

Индекс антител к коронавирусу – расшифровка титров

Результат	Индекс	Значение
Отрицательный	Меньше   0,8	Пациент либо не сталкивался с заболеванием, либо проходил процедуру в острой фазе.
Пограничный	0,8-1,1	Нужно сделать повторный тест через 14 дней. Возможно, тест был сделан в начале заболевания или в процессе выздоровления.
Положительный	Больше 1,1	Данный уровень антител к коронавирусу у взрослых является нормой. Человек переболел  коронавирусной инфекцией несколько месяцев назад, и гуморальный иммунитет успел сформироваться.

   Антитела класса G к коронавирусу – расшифровка результатов

1 800 титр антител к коронавирусу (положительный результат) является нормой. При этом иммуноглобулины класса A и M в крови должны отсутствовать. Их наличие свидетельствует о стадии выздоровления. 

BAU/мл – новая расшифровка анализа на антитела к коронавирусу

Всемирная Организация Здравоохранения утвердила новый международный стандарт для определения иммуноглобулинов к коронавирусу, с единицей измерения BAU (переводится как «коэффициент связывающих антител»).

Расшифровка количественного анализа на антитела к коронавирусу

Лабораторная диагностикауровня защиты иммунитета от коронавируса проводится при исследовании иммуноглобулинов к S-белку вируса. Для облегчения интерпретация результатов исследования было предложено использовать универсальную систему измерения.

Таблица пересчета результатов анализов на антитела от разных производителей в BAU/мл

Производитель	Коэффициент    пересчета в BAU/мл
Abbott ARCHITECT	0,142
Roche	1

Расшифровка количественного анализа на антитела к коронавирусу

BAU/мл	Результат	Значение
0-10	Отрицательный	Антител нет, требуется вакцинация
11-79	Отрицательный	Антител мало, принятие решения о вакцинации
80-149,9	Пограничный	Среднее количество антител
150 и более	Положительный	Вакцинация не требуется
500 и более	Положительный	Вакцинация не требуется

 BAU/мл – расшифровка анализа на антитела к коронавирусу

1. Сделать тест на коронавирус, быстро, безопасно и точно, вы можете в Клинике МЕДЕЛ. 
2. Для записи позвоните по номеру 
3. 8 (843) 207-18-00.
4. 

Нейтрализующие антитела к коронавирусу SARS‑CoV‑2, спайковый (S) белок, IgG, количественно ( Тест анти-RBD)

В настоящее время известно, что оболочка каждого вируса SARS-CoV-2 состоит из 4 структурных  и неструктурных  (протеаза, репликаза) белков:

1. S белок (spike), или белок-шип;
2. N белок, или нуклеокапсидный белок:
3. М белок, или мембранный белок и
4. Е белок оболочки.

Именно S-белок (spike) придает вирусу узнаваемый вид «вируса с короной». Одним из свойств S белка, точнее его рецептор-связывающего домена (RBD) является способность объединять оболочку (мембрану)  вируса с клеткой человека, тем самым обеспечивая проникновение в клетку и дальнейшее заражение организма.

 

В ответ на заражение организм начинает реагировать выработкой антител различных классов. Именно их обнаружение позволяет установить факт инфицирования даже у бессимптомных пациентов. IgG начинают выявляться в среднем на 3-й неделе заболевания,  перемещаясь по сосудистому руслу пациентов длительно время.

 При лабораторном тестировании возможно определение IgG к различным белкам вируса. Наличие антител класса IgG к нуклеокапсидному белку является показателем перенесенной инфекции.

Выявление IgG к рецептору связывающего домена (RDB) – позволяет судить о наличии защитного иммунитета, который мог сформироваться после перенесенного заболевания, так и после вакцинации.

Антитела к рецептору связывающего домена S белка обладают нейтрализующими свойствами и препятствуют связыванию вируса с клетками человека, тем самым обеспечивая важную роль в определении индивидуального протективного (защитного) иммунного ответа к SARS-CoV-2.

Что такое рецептор-связывающий домен (RBD) ?

RBD — рецептор-связывающий домен, отвечающий за соединение коронавируса с клеткой человека, а точнее, с рецептором ACE2, который находится на мембране клеток человека, через который вирус проникает в клетку, где в дальнейшем размножается, вызывает заболевание и, выделяясь в окружающую среду, вызывает появление все новых и новых случаев новой коронавирусной инфекции COVID-19. В первую очередь анализ на определение нейтрализующих антител класса  g ( АНТИ RBD) показан лицам переболевшим новой коронавирусной инфекцией и лицам, после вакцинации препаратом «Спутник V» (Центр Гамалеи), а также другими  вакцинами, разрешенными к применению на территории РФ.  Рекомендуемый срок сдачи анализа на антитела после вакцины «Спутник V» 35-42 дня с момента постановки первого компонента. Для выявления антител после вакцины ЭпиваКкорона необходимы специальные тест системы «Вектор».

Чувствительность теста  в диапазоне  80-99 %, специфичность 95-99%

•  Иммунный ответ выше у пациентов старше 40 лет.
• Лица старшего (60–85 лет) и среднего возраста (40–59 лет) имели значительно более высокие титры нейтрализующих SARS-CoV-2 антител, чем у более молодых пациентов (15–39 лет). 
•  Уровень антител выше у госпитализированных больных. Имеется корреляция со степенью тяжести заболевания. 
• Уровни антител ниже у женщин. 
• Нейтрализующая способность антител выше у мужчин. 
• Уровни антител ниже у курильщиков. ( Курение не защищает от ковид-19 вопреки популярному мнению)
• Уровни антител ниже у лиц, получающих противовоспалительные препараты.
• Чем больше масса тела, тем выше будут титры антител.

•   50  АЕмл — результат положительный (Эббот)

Наша лаборатория указывает референсные значения в пределах 50 АЕмл. Если показатели выше 50 АЕмл- антитела обнаружены, если ниже-тест отрицательный. с 09.07.2021 данное исследование будет будет предоставляться в условных единицах ВОЗ-BAU (единицы связывающих антител) на мл — BAU/ml.

• Меньше 1 BAU – контакта с коронавирусом не было 
• Меньше 10 BAU – исчезающе-малое количество антител, рекомендована ревакцинация.
• 10-100 BAU – средняя и слабая степень защиты организма
• 100-500 BAU – выраженный  иммунитет к коронавирусу
• Больше 500 BAU – мощное количество антител, высокий уровень иммунной защиты ( Максимальный уровень защиты)

По заявлению руководителя «Национального  исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи»  Александра Гинцбурга, для полноценной защиты от новой коронавирусной инфекции достаточно иметь титры нейтрализующих антител класса g от 300 BAUml и выше.   

Некоторые регионы планируют выдачу QR-кода при высоком уровне нейтрализующих антител даже у неофициально переболевших лиц ( Лица переболевшие дома  с отрицательным тестом ПЦР). Анализ нужно будет сдать в специальных аккредитованных лабораториях. 

Ниже представлен обезличенный результат пациента нашего медицинского центра (Мужчина, 35 лет)  после вакцинации «Спутником — V».  Анализ сдан через месяц после получения второго компонента. Результат 2510,4 BAUml, что соответствует результату 17 678,8 АЕ/ml по технологии Abbot. По результату данного анализа можно констатировать, что у пациента сформировался сверхмаксимальный уровень антител к S-белку новой коронавирусной инфекции.

Тест компании Abbot ( доступный в нашем медицинском центре) имеет шкалу  от 50 до 40 тысяч. Если показатель превышает 1,3 тысячи, значит, иммунитет хороший, если от 500 до 1,3 тысячи — есть риск заразиться инфекцией, если меньше 500 — нужно вакцинироваться или ревакцинироваться.

На данный момент нужно ориентироваться на уровень антител в международных едbницах ВОЗ — BAUml.

Обращаем ваше внимание, что по последним сообщения оперштаба по борьбе с распространение  новой коронавирусной инфекции, справка о наличии антител не является основанием для посещения массовых мероприятий и мест общественного питания. 

По последним данным наблюдений, пациентов с положительными антителами g нельзя приравнивать к лицам, у которых можно полностью исключить вероятность выделения вируса в окружающую среду. То есть, они в данном случае имеют инфекционный статус. Нейтрализующие антитела к вирусу ( АНТИ RBD) не могут полностью блокировать активное выделение вируса и свести к нулю опасность заражения окружающих через выделяемый секрет.  Антитела могут сохранятся и определятся в сыворотке в течении 5-7 месяцев после начала заболевания. Уровень антител зависит от нескольких факторов, перечисленных выше. (Вес, пол, влияние вредных факторов, степень тяжести перенесенного заболевания и тд.). Все чаще и чаще высказывается в научных кругах мнение, что в связи с появлением нового штамма «Дельта» ( Индийский штамм) необходим более высокий уровень антител, поэтому рекомендуем периодически сдавать анализ, с целью отслеживания динамики титров антител. В случае снижения титров до низких показателей, следует рассмотреть вопрос о ревакцинации. 

 По последним  исследованиям, (статья опубликована 12.10.2021 ) проведенного в Швеции и Италии, показали, что у большинства переболевших COVID-19 в первые полгода количество антител снижалось постепенно, после чего показатель ( в течении 8-9 месяцев) до 15 месяцев был стабильным. 

Авторы собрали 188 анализов крови у 136 пациентов, у которых заболевание сопровождалось характерными симптомами и протекало в различной форме, от легкой до тяжелой. В качестве контрольной выборки использовали плазму 108 человек с подтвержденным отрицательным ПЦР-тестом.

Ученые измеряли титры анти-S и анти-RBD антител в плазме. Первые специфически направлены на спайковый белок, или S-белок вируса целиком, а вторые — на рецептор-связывающий домен (RBD) S-белка, играющий ключевую роль в связывании вируса с клетками. Известно, что со временем в структуре S-белка и RBD-домена накапливаются мутации, которые снижают нейтрализующую способность антител. Задачей ученых было определить время, в течение которого антитела плазматических клеток сохраняют активность. Результаты показали, что на пике иммунного ответа у выздоравливающих пациентов уровни анти-RBD иммуноглобулинов IgM и IgG были увеличены на 77 и 85 процентов соответственно, но затем в течение шести-пятнадцати месяцев упали до 4,5 и 11 процентов. Антитела IgM и IgG к S-белку показали значения чуть выше — соответственно 88 и 90 процентов в первые один-три месяца и вполовину меньше через 55-56 дней.

Титры специфических антител IgG к RBD и S-белку у 94 процентов пациентов достигли максимума через 15-28 дней после появления симптомов, потом, после прохождения пика ответа антител, они постепенно уменьшились примерно в четыре раза к концу шестого месяца, а затем оставались стабильными до 15 месяцев. Дольше сохранялся высокий уровень антител у тех, кто переболел COVID-19 в тяжелой форме.

Для сравнения ученые оценили уровень специфических IgG антител в плазме вакцинированных. Оказалось, что через 14-35 дней после введения первой дозы вакцины титры антител были аналогичны таковым у переболевших через шесть месяцев после заражения, а после второй соответствовали максимальному уровню естественного ответа у выздоравливающих пациентов.

Помимо основного штамма SARS-CoV-2, авторы проверили эффективность антител в отношении бета, гамма и дельта-вариантов (мутировавшие штаммы) в течение 15 месяцев после заражения и подтвердили, что нейтрализующая активность антител, хоть и в меньшей степени, сохраняется и для этих вариантов коронавируса.

Кроме того, ученые определяли уровень Т-клеточного ответа, пик которого был отмечен между третьим и шестым месяцами после заражения, за которым последовало значительное снижение через 12-15 месяцев. Однако интенсивность и продолжительность ответа при этом не зависели от тяжести заболевания.

Авторы исследования уточняют, что для оценки длительного иммунитета, сохраняющегося в В-клетках памяти, 15 месяцев, в течение которых проводили исследование, недостаточно, но очевидно, что у большинства перенесших COVID-19 пациентов циркулирующие В- и Т-клетки памяти и нейтрализующие антитела присутствуют в плазме крови до 15 месяцев после заражения.  На данный момент информация в отношении нового штамма анализируется, но считается что он более заразен и содержит до 32 мутаций в S-белке вируса( Один из структурных белков). В связи с этим вводятся особые меры в отношении транспортного сообщения со странами, где он уже обнаружен штамм и карантинные меры в отношении прибывших.Информация пока по новому штамму анализируется. Известно, что он уже выявлен в 63 странах, зафиксирован один летальный исход в Лондоне и в целом вирус распространяется более стремительно, по сравнению с версией  «дельта». Омикрон может обходить защитные антитела и может заражать вакцинированных, но течение более мягкое и часть научного сообщества считает, что в случае занятия доминирующего положения, омикрон может в силу своей мягкости ( по информации на 14.12.2021г) завершить острую фазу пандемии COVID-19. Вирус может обнаруживаться при выполнении стандартного ПЦР теста, но уже в России появились тесты, выявляющие вирус с учетом его «штаммовой» принадлежности. 

Рекомбинантный вирус осповакцины, перспективный для лечения меланомы

Введение

Во всем мире ежегодно возрастает заболеваемость меланомой, по аналитическим данным, прогнозируемый ежегодный прирост новых случаев заболевания составляет более 87 тыс. [1]. При этом в последнее десятилетие наблюдается положительная динамика по увеличению средней выживаемости пациентов больных меланомой — в 2011 г.

данный показатель составлял 9 мес, в 2018 г. прогнозируемый показатель — 2 года [2]. Данное явление в значительной степени обусловлено введением в клиническую практику средств иммунотерапии [3]: с 2011 г.

FDA и EMA одобрили новые препараты для лечения меланомы, в том числе антитела против CTLA-4 ipilimumab (Yervoy), антитела против PD-1 nivolumab (Opdivo), пембролизумаб (Keytruda), онколитический генетически модифицированный вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) Talimogenelaherparepvec (T-VEC, Imlygic), онколитический рекомбинантный вирус осповакцины (OncoVex), что стало большим достижением в области терапии злокачественных новообразований при меланоме.

Среди активно развивающихся методов иммунотерапии выделяют онколитическую иммунотерапию, заключающуюся в применении вирусов, обладающих естественным тропизмом к неопластическим клеткам, либо с генетическими модификациями, приводящими к повышению антиканцерогенных свойств самого вируса и регуляции иммунной системы пациента [4]. Опухолевые клетки не имеют мощного противовирусного ответа, что делает их чувствительными к вирусной инфекции, которая приводит к регрессии опухоли через 2 разных механизма: лизис опухолевых клеток и стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа [5].

Была показана эффективность онколитических вирусов не только в качестве литического агента, но и в качестве мощного стимулятора противоопухолевых процессов, опосредованных иммунной системой [6]. Онколитический реовирус способен устранять метастазы в лимфатическом узле и селезенке.

На примере линии клеток мышиной меланомы B16Ova показано, что именно иммунные ответы, вызванные вирусом, а не опосредованный вирусом онколиз, имеют решающее значение для противоопухолевой эффективности реовируса.

Также обнаружено, что локальное введение онколитического вируса болезни Ньюкасла у иммунокомпетентных мышей может значительно замедлить рост опухолей.

Важно отметить, что в некоторых случаях введение инактивированного вируса приводит к регрессии опухолей в иммунокомпетентных моделях животных, подчеркивая влияние иммунной системы на опосредованный вирусом противоопухолевый эффект [7, 8]. Поэтому онколитические вирусы рассматриваются не только в качестве агента, лизирующего опухолевые клетки, но и в качестве иммуномодулирующего препарата, либо способа доставки иммунотерапевтических молекул.

Цель исследования — получение онколитического вируса на основе вируса осповакцины (ВОВ) штамм L-IVP, в геном которого дополнительно введены гены, кодирующие гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и искусственный полиэпитопный иммуноген, а также изучение свойств полученного вируса in vitro и in vivo.

Материал и методы

• Штамм Л-ИВП ВОВ получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
• Эукариотические культуры клеток 4647 и CV-1 получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
• Культуры клеток SW 620, A 431, OVCAR-3, C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 получены из коллекции Института цитологии и генетики СО РАН.
• Предсказание эпитопов проводили на сервере IEDB с использованием метода ANN.

Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ проводили в соответствии со стандартным протоколом [9].

Осуществляли электроперенос исследуемых белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью прибора фирмы «Bio-Rad» (США). Центры неспецифического связывания блокировали инкубацией нитроцеллюлозной мембраны в растворе 0,5% бычьего сывороточного альбумина в PBST-буфере.

В качестве первичных антител использовали иммунную сыворотку, полученную иммунизацией кроликов целевыми рекомбинантными белками, полученными в прокариотической системе экспрессии E. coli (GM-CSF, полиэпитопный иммуноген). Конъюгат пероксидазы хрена с антикроличьим иммуноглобулином козы (BioRad, США) использовали в разведении 1:5000.

Детекцию иммунных комплексов проводили окрашиванием свежеприготовленным раствором 4-хлор-1-нафтол («Aldrich», США) в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 4,7 с концентрацией 500 мкг/мл, содержащем 0,0015% перекиси водорода.

МТТ-тест. Сравнительное изучение цитолитических свойств вариантов ВОВ проводили, используя МТТ-тест. 50% монослой клеток заражали изучаемыми вирусами с множественностью заражения 0,001 БОЕ/кл, 0,01 БОЕ/кл, 0,1 БОЕ/кл, 1 БОЕ/кл, 10 БОЕ/кл.

Через 72 ч добавляли 5 мг/мл МТТ (Sigma, США), и инкубировали 4 ч при 37 °С, после чего добавляли 200 мкл диметилсульфоксида и инкубировали в течение 1 ч.

Затем измеряли оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 540 нм на приборе Multiskan FC (Thermo Scientific, США) и определяли дозы исследуемых вирусов, при которых жизнеспособными остаются 50% клеток (ЦПД50).

Оценка ростовых свойств L-IVP _oncoM.

Для изучения динамики роста L-IVP_oncoM 90% монослой клеток линий 4647 и CV-1, полученный на 6-луночных планшетах, инфицировали с множественностью заражения 1 БОЕ/клетка в трех повторах с инкубацией 0, 24, 48, 72 ч при 37 °С в условиях 5% CO2.

После трехкратного замораживания-оттаивания содержащие вирус препараты титровали методом бляшек в монослое клеток CV-1. Помимо линии клеток CV-1 использовали линию 4647, которая аттестована для производства иммунобиологических препаратов.

Изучение онколитических свойств L-IVP_oncoM in vivo. Для получения солидных подкожных опухолей суспензию клеток SK-Mel-28 в количестве 1·107 клетка/мышь (объем 100 мкл) вводили самкам линии SCID (всего 26 животных) подкожно в область правой лопатки и вычисляли объем опухоли (V) по формуле: V=(a×b2)/2, где a — наибольший диаметр опухоли, b — наименьший диаметр опухоли [10].

Для оценки онколитического эффекта L-IVP_oncoM по достижению объема опухоли 200 мм3 вводили вирусный материал интротуморально в дозе 1·107 БОЕ/мышь в 100 мкл физиологического раствора («Биолот», Россия), в качестве контроля вводили 100 мкл физиологического раствора.

Сравнительную оценку изменения объема опухоли проводили каждые 3 сут от даты инъекции вирусного материала.

Забой мышей в количестве 2 головы на точку проводили на 4, 8, 12, 16 и 32-е сутки после введения препаратов и производили забор органов (селезенка, печень, легкие, почки, яичники, кровь) для оценки распределения вируса по жизненно важным органам. На 47-е сутки выводили всех оставшихся животных из эксперимента.

Гистологические исследования проводили согласно протоколу [11].

Результаты и обсуждение

Получение рекомбинантного вируса L-IVP_oncoM.

При помощи биоинформатического анализа была проведена оптимизация и конструирование полиэпитопного иммуногена, состоящего из эпитопов ОАА, для которых согласно литературным данным показан высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках при меланоме.

На первом этапе работы была проведена оптимизация состава эпитопов полиэпитопного имуногена и подобраны спейсерные последовательности, обеспечивающие доставку целевой конструкции в клетки организма для последующей эффективной презентации иммунной системе.

Оптимизацию состава полиэпитопного иммуногена проводили при использовании данных, опубликованных в реферируемых журналах и базах данных.

В ходе работы были выбраны аллельные варианты молекул MHC I класса HLA-A*0201 — как наиболее распространенные и изученные в человеческой популяции [12].

Были отобраны пептиды, для которых предсказанное значение pIC50 (характеристика аффинности взаимодействия пептида с молекулой MHC) выше, чем 6,8. Согласно литературным данным значение IC50

Уровни антител после COVID-19 — качество иммунитета, расшифровка анализа | Университетская клиника

С начала пандемии ученые всего мира ищут ответ на вопрос, как долго сохраняется иммунитет у выздоровевших людей. Исследования подтверждают теорию о том, что антитела после COVID-19 сохраняются до нескольких месяцев, а их количество индивидуально и зависит от многих факторов.

Кого можно считать выздоровевшим от КОВИД?

Выздоровевшим считается человек, у которого COVID-19 был диагностирован на основе клинических критериев или подтвержден в лаборатории, и у которого больше нет симптомов этого заболевания и он не заразен.

Как работает иммунитет к COVID-19 у выздоровевших людей?

Чтобы получить ответ на этот вопрос, рассмотрим механизм иммунитета к коронавирусу. Иммунитет, защищающий организм от заражения COVID-19, связан с наличием в организме антител, специфичных к вирусу SARS-CoV-2 и специализированных клеток иммунной системы. Они запрограммированы на уничтожение вируса при новом контакте.

Антитела – это специфические белки, выработка которых обусловлена клетками иммунной системы. Антитела распознают отдельные структурные элементы патогенов, вызвавших их образование. Они имеют общие фрагменты и небольшие «центры», отвечающие за специфическую реакцию. По общей структурной схеме антитела, присутствующие в организме, делятся на классы.

Таблица 1. Классы антител

Специфические физиологические функции связаны с классом антител. Антитела — часть механизма приобретенного, т.е. адаптивного иммунитета.

Для эффективной борьбы с коронавирусом организму необходим именно адаптивный иммунитет, поскольку он позволяет вырабатывать таргетные антитела и Т-лимфоциты, атакующие клетки, инфицированные вирусом. Если адаптивная реакция достаточно сильна, она оставляет постоянную память об инфекции в организме, обеспечивая защиту от вируса в будущем.

Как проверить уровень иммунитета при COVID-19?

Метод мониторинга уровня иммунитета, полученного после COVID-19 или после вакцинации против SARS-COV-2 — измерение концентрации антител против SARS-CoV-2. Известно, что иммунитет  пропорционален концентрации антител. 

Некоторые тесты адаптированы для измерения антител, особенно важных в механизмах противовирусного гуморального иммунитета – антител, нейтрализующих IgG anti-S. Результат теста выражается в BAU/мл. Измерение концентрации антител дважды позволяет уловить скорость изменения концентрации с течением времени.

Сроки измерений антител жестко не фиксированы, но их однозначно не следует делать в первые 2 недели после вакцинации. Лучше дождаться второй бустерной дозы и сдать анализы через пару недель.

Зная уровень ранних антител – IgM и поздних – IgG можно оценить эффективность иммунной системы, т.е. справилась ли она с коронавирусом SARS CoV-2 после заражения или после вакцинации. Тестирование уровня антител к COVID-19 также позволяет оценить время, прошедшее с момента заражения или последнего контакта с вирусом.

Можно ли отличить антитела после COVID-19 от антител после вакцинации?

Выработка антител стимулирует контакт иммунной системы с частицами (антигенами) вируса. Такой контакт может происходить по-разному. Наиболее распространенные — болезни или вакцинация, стимулирующие организм вырабатывать антитела против COVID-19 — сначала в классе IgM, а затем и в антителах IgG. 

Вакцина содержит только модифицированный антиген, полученный из шипа на поверхности вируса, так называемый белок S. Поэтому после вакцинации антитела к COVID образуются только против этого белка. При заболевании COVID, организм контактирует с различными антигенами вируса, а не только с белком S, например, с белком N.

Следовательно после болезни образуются различные антитела. На этом основании можно отличить антитела после заболевания (направленные против нуклеокапсидного N-белка) от образовавшихся после вакцинации (направленных только против белка S). Для выявления специфических антител следует проводить только соответствующий тест.

Какой уровень антител защищает от болезни?

Каждый организм по-разному реагирует на болезнь и введение вакцины, поэтому уровень вырабатываемых антител не одинаков. Их количество может варьироваться от нескольких десятков до нескольких тысяч связывающих антител, т.е. BAU (Binding Antibody Units) на миллилитр (/мл).

Пока ученым не удалось определить уровень (титр) антител к COVID, являющихся нормой, защищающей от заболевания. Однако известно, что их уровень отражает реакцию иммунной системы на вакцинацию.

При интерпретации результата на уровне антител необходимо учитывать принимаемые препараты. Некоторые из них, например, глюкокортикостероиды, иммуносупрессивные и противоопухолевые препараты, ухудшают иммунный ответ. У принимающих их людей обычно вырабатывается меньше антител. 

С другой стороны, даже очень высокий результат (порядка нескольких тысяч антител/мл) не гарантирует иммунитет от болезни, но безусловно, позволяет избежать тяжелого и опасного для жизни течения заболевания.

Со временем на основании результатов научных исследований и статистических данных, уровень антител, выше которого защита от болезни будет почти стопроцентной, будет установлен.

Виды тестов на уровни антител при COVID-19 – от чего зависит интерпретация результатов анализов

Чтобы диагностировать COVID-19, используются разные виды тестов – генетические и антигенные, требующие мазка из носоглотки и анализы крови на наличие антител.

• Генетическое тестирование. Основано на методах молекулярной биологии, поэтому наиболее чувствительно. То есть COVID-положительные результаты обычно являются истинными (достоверными).
• Антигенные тесты. Это популярные кассетные тесты на SARS-CoV-2. Они менее чувствительны, но просты в использовании и результат получается быстро. Результат теста на COVID может быть положительным (была инфекция), отрицательным (вирус не обнаружен) или неубедительным (тест нужно повторить).
• Анализы на антитела. Обнаруживают COVID-специфические антитела IgG и антитела IgM. Это могут быть качественные тесты, т.е. оценка того, существуют ли вообще данные антитела. При интерпретации результатов тестов IgG и IgM результаты интерпретируются с использованием готовых, простых для понимания инструкций. Также доступны количественные тесты. В них уровень антител к COVID определяется числовым значением, выраженным в единице BAU/ml.

Интерпретация результатов на уровне антител IgG

Тесты на IgG SARS-CoV-2 интерпретируются только с точки зрения их наличия и/или уровня в крови. Можно получить отрицательный или положительный результат. Реактивным (положительным) результатом считается >/= 30 БАУ/мл, нереактивным (отрицательным) результатом —

Коронавирус COVID‑19 (SARS‑CoV‑2, антиген возбудителя, количественно, ИХЛА)

Исследование предназначено для количественного определения антигена нуклеокапсидного белка (N) вируса SARS-CoV-2 в образце биоматериала. Тест является эффективной альтернативой ПЦР-тестированию и предназначен для диагностики COVID-19 у людей любого возраста без признаков ОРВИ.

Анализ позволяет выявить специфический вирусный белок – нуклеокапсидный антиген SARS‑CoV‑2 в мазке биоматериала. Актуален для тех, кто беспокоится о своем здоровье и хочет быстро узнать свой COVID‑статус.

Выполняется на полностью автоматизированном высокотехнологичном оборудовании и имеет очень высокую чувствительность и специфичность.

• Результат теста выдается в количественном формате, позволяющем дополнительно к COVID-статусу определить вирусную нагрузку.
• Синонимы русские
• Антиген N вируса SARS-CoV-2, быстрый тест на ковид, антигенная детекция вируса SARS-CoV-2, определение антигена N вируса SARS-CoV-2, диагностика коронавирусной инфекции (COVID-19).
• Синонимы английские
• SARS-CoV-2 Antigen, SARS-CoV-2 Ag, Ag-RDTs (diagnostics tests) for COVID-19.
• Метод исследования
• Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА).
• Какой биоматериал можно использовать для исследования?
• Мазок из ротоглотки и носоглотки.
• Как правильно подготовиться к исследованию?

• Минимум за 1 час до взятия мазков из ротоглотки (зева) не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не жевать жевательную резинку, не курить.
• За 3-4 часа до взятия мазков из носа/носоглотки не закапывать капли/спреи и не промывать нос.
• Исследование не выполняется анонимно, необходимо предъявить паспорт.

Общая информация об исследовании

Коронавирусная инфекция (COVID-19) — это острая респираторная инфекция, вызываемая РНК-содержащим вирусом SARS-Cov-2.

Коронавирус SARS-CoV-2 появился в 2019 году, при этом первоначальный источник распространения вируса по-прежнему не установлен. Коронавирус SARS-Cov-2 представляет собой одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относится к линии Beta-CoV B семейства Coronaviridae и имеет II группу патогенности.

Вирион коронавируса состоит из 4 структурных белков — спайкового (S), оболочки (E), мембранного (M), нуклеокапсидного (N), — 16 неструктурных белков репликативно-транскрипционного комплекса и 5-10 регуляторных белков.

 Spike протеины (S белки) — это белки, образующие «шипы» на поверхности вирусной частицы, которые связываются с клетками человека и обеспечивают проникновение вируса. Именно к S-белку вырабатываются нейтрализующие антитела при проникновении коронавируса в организм, а также после вакцинации.

 Нуклеокапсидный белок (N-белок) — основной РНК-связывающий белок, который образует вирусный капсид (оболочку ядра вируса), играет важную роль в механизме развития COVID-19 и провоцирует интенсивный иммунный ответ.

Коронавирус SARS-CoV-2 попадает в организм человека через клетки-мишени, имеющие на своей поверхности рецепторы ангиотензинпревращающего фермента II типа (ACE2).

Такие рецепторы располагаются на клетках эпителия дыхательного тракта, почек, пищевода, мочевого пузыря, подвздошной кишки, сердца, ЦНС.

Однако основной и быстродостижимой мишенью являются альвеолярные клетки II типа (AT2) легких, что определяет развитие пневмоний.

Основной источник COVID-19 — больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания, и бессимптомный носитель SARS-CoV-2. Наибольшую опасность для окружающих представляет больной человек в последние два дня инкубационного периода и в первые дни болезни. Инкубационный период COVID-19 составляет до 14 дней, в среднем симптомы появляются на 5-6-е сутки.

Ведущий путь передачи SARS-CoV-2 — воздушно-капельный, реализуется при кашле, чихании и разговоре на близком (менее 2 метров) расстоянии. Контактный путь передачи реализуется во время рукопожатий и при других видах непосредственного контакта с инфицированным человеком, а также через поверхности и предметы, контаминированные вирусом. Возможен фекально-оральный механизм передачи вируса.

Большинство людей с COVID-19 переносят заболевание в легкой и неосложненной форме, однако примерно у 14 % зараженных развивается тяжелая форма болезни, требующая госпитализации и кислородной поддержки. Около 5 % пациентов нуждается в лечении в условиях палаты интенсивной терапии.

При тяжелом течении заболевание может быть осложнено острым респираторным дистресс-синдромом, сепсисом, полиорганной недостаточностью (острое поражение почек и сердца). Распространение SARS-CoV-2 из системного кровотока или через пластинку решетчатой кости может привести к поражению головного мозга.

Изменение обоняния (гипосмия) на ранней стадии заболевания может свидетельствовать о поражении ЦНС. Пожилые пациенты и пациенты с сопутствующими состояниями (сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет и др.) имеют повышенный риск развития тяжелой формы COVID-19 и летального исхода.

Молодые люди и дети часто могут переносить инфекцию бессимптомно, что способствует распространению COVID-19 среди населения.

К основным симптомам COVID-19 относятся:

• повышение температуры тела;
• кашель (сухой или с небольшим количеством мокроты);
• одышка;
• ощущение сдавленности в грудной клетке;
• выраженная утомляемость;
• утрата обоняния или вкусовых ощущений;
• заложенность носа;
• покраснение глаз;
• головная боль;
• боль в мышцах или суставах.

Реже заболевание проявляется диареей, тошнотой и рвотой.

Лабораторная диагностика коронавирусной инфекции проводится с использованием молекулярно-генетических и серологических методов, которые позволяют выявить генетический материал вируса, специфические антитела к SARS-CoV-2 и антигенные структуры вируса.

Согласно рекомендациям ВОЗ и управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, США), количественное определение антигена нуклеокапсидного белка (N) вируса SARS-CoV-2 методом иммунохемилюминесцентного анализа является высокоэффективным тестом для диагностики коронавирусной инфекции. Показатели диагностической чувствительности и специфичности данного метода не уступают таковым при проведении ПЦР-анализа на РНК вируса SARS-CoV-2. Антигенная детекция вируса SARS-CoV-2 позволяет в сжатые сроки подтвердить/исключить наличие коронавирусной инфекции.

Тест на антиген может определить наличие COVID-19, если вирусная нагрузка высокая, т.е. в носоглотке находятся сотни тысяч и миллионы копий вируса, что чаще бывает в самом начале заболевания или в период пика коронавирусной болезни. При средней или низкой вирусной нагрузке результат теста может быть ложноотрицательным.

Положительный результат теста на антиген, если имеются симптомы заболевания, свидетельствует о том, что человек болен COVID-19. Однако если результат положительный, а симптомов нет, необходимо в течение ближайших двух дней выполнить ПЦР-анализ для подтверждения результатов.

Отрицательный результат теста на антиген не исключает инфицирования COVID-19:

• в странах/местах с высоким процентом заболеваемости;
• при семейном контакте с инфицированными;
• при клинической картине ОРВИ, пневмонии, тяжелом остром респираторном синдроме.

Тест на антиген не рекомендуется лицам с подозрением на COVID-19 без клинических проявлений, у которых количество вируса в носоглотке может быть небольшим и тест не сможет его выявить.

Отрицательный результат теста на антиген не является свидетельством о выздоровлении от коронавирусной инфекции, документом для снятия самоизоляции в случае прибытия из стран «красной зоны». В этих случаях требуется результат ПЦР.

Для чего используется исследование?

• Для раннего выявления вируса SARS-CoV-2 и в случае положительного результата проведения соответствующих изоляционных мероприятий.
• Для дифференциальной диагностики коронавирусной инфекции с другими респираторными вирусными инфекциями.

Когда назначается исследование?

• При скрининге условно здорового населения (выявление бессимптомных носителей инфекции).
• При наличии симптомов коронавирусной инфекции, особенно в течение первых 10 дней.
• При наличии контактов с людьми, у которых лабораторно подтвержден COVID-19, или с теми, кто прибыл из стран с высоким уровнем распространения COVID-19.
• Прибывшим из стран с опасной эпидемиологической ситуацией по коронавирусной инфекции.
• При наличии сомнительных (недостоверных) результатов ПЦР-анализа РНК вируса SARS-CoV-2 и отсутствии клинических симптомов COVID-19.
• При отсутствии возможности выполнения ПЦР-анализа РНК вируса SARS-CoV-2.

Что означают результаты?

Референсные значения

Концентрация вирусной нагрузки: 0.0 — 200.0.

Причины положительного результата:

Причины отрицательного результата:

• отсутствие коронавирусной инфекции;
• длительность коронавирусной инфекции более 3 недель;
• период выздоровления после перенесенной коронавирусной инфекции.

1. Кто назначает исследование?
2. Инфекционист, педиатр, врач общей практики, анестезиолог-реаниматолог.
3. Литература

• Möckel M, Corman VM, Stegemann MS, Hofmann J, Stein A, Jones TC, Gastmeier P, Seybold J, Offermann R, Bachmann U, Lindner T, Bauer W, Drosten C, Rosen A, Somasundaram R. SARS-CoV-2 antigen rapid immunoassay for diagnosis of COVID-19 in the emergency department. Biomarkers. 2021 May;26(3):213-220.
• U.S. Food & Drug Administration. In Vitro Diagnostics EUAs 2020 [Available from: https://www.fda.gov/medicaldevices/ coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-useauthorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas].
• WHO Interim Guidance September 11th 2020 Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays.
• Weitzel, Thomas et al. “SARS-CoV-2 rapid antigen detection tests.” The Lancet. Infectious diseases, S1473-3099(21)00249-8. 4 May. 2021.