Иммуноблотинг. Техника иммуноблотинга. Методика выполнения иммуноблотинга. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Иммуноблот на ВИЧ позволяет обнаружить антитела к вирусным белкам, помещенным на специальную нитроцеллюлозную мембрану. Это высокоточное исследование, устанавливающее наличие фракций, в которых основные белки располагаются в виде небольших полос.

Оболочка вируса ВИЧ-1 содержит гликопротеины с молекулярной массой от 41 кд до 160 кд (килодальтона). Большое значение для проведения иммунного блоттинга имеет гликопротеин ВИЧ-2 с молекулярным весом от 32 кд до 140 кд. Белки сердцевины ВИЧ-1 и ферменты вируса представлены протеинами р17, р24, р55.

Возбудитель ВИЧ-2 состоит из белков, обозначаемых как р16, р25, р56. Они образуют его внутреннюю оболочку. В состав генома входят 6 регуляторных и 3 структурных гена. Нередко при делении клеток возникают генетические неточности и появляется несколько подтипов возбудителя.

Положительные пробы

Для исключения ошибок при лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции пациенту назначают дополнительное исследование. Его результаты интегрируются как положительные, если обнаружены антитела к 2 или 3 белкам ВИЧ-1 или ВИЧ-2.

Иммуноблот подтверждает все хорошие результаты ИФА. В этом случае обнаруживают антитела к gp120/160, gp41 или р24, которые являются структурными единицами трех основных генов СПИДа — gag, pol, and env.

У некоторых пациентов, имеющих отрицательные результаты ИФА и ПЦР, иммуноблот показывает несколько положительных полосок.

Врач назначает дополнительное исследование р24 для постановки правильного диагноза и исключения ранней фазы ВИЧ-инфекции.

Если полученные результаты подвергаются сомнению, больному предлагают повторять сдачу анализа в течение последующих 3 месяцев. Почти все случаи заболевания ВИЧ подтверждают с помощью системы для проведения иммуноблота — прибора Sanofi.

В большинстве случаев обнаруживают антигены ВИЧ, белки р25, gp110/120 и gp160, указывающие на инфицирование вирусом.

Ложноположительная проба регистрируется у пациентов, страдающих заболеваниями соединительной ткани, имеющих повышенный уровень билирубина, при взаимодействии с различными вирусными антигенами.

Негативный результат

В случае недостатка положительных линий, соответствующих белкам вируса СПИДа, иммуноблот расшифровывают как отрицательный результат. Анализ однозначно подтверждает отсутствие заражения вирусом иммунодефицита или указывает на «период окна». Если иммуноблот дает отрицательный результат, человек не является носителем вируса СПИДа.

Для исследования берут образцы сыворотки крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Их хранят в замороженном виде при температуре -20°С. Анализ проводят с помощью тест-систем:

  • Антиген;
  • Рекомбинат-ВИЧ;
  • Пептоскрин.

Регистрация отрицательного результата указывает на отсутствие в сыворотке антител к оболочечным гликопротеинам ВИЧ gp120, gp160, Sp41.

Нередко больного интересует вопрос, может ли быть отрицательный результат иммуноблота на ВИЧ у пациента, имеющего инфицированного сексуального партнера.

После проведенного исследования нередко получают сомнительный результат или фиксируются антитела к белкам gp120 и gp160, что указывает на полное отсутствие отрицательных данных.

Иногда сомнительный ответ регистрируют у пациентов с бессимптомно протекающей инфекцией.

Неинтерпретируемые результаты

Анализ, проведенный с помощью различных тестов на антитела к ВИЧ-инфекции, иногда не соответствует отрицательным данным и не отвечает критериям серопозитивности. Врачу трудно установить причину появления сомнительного результата.

Некоторые больные не входят в группу риска по инфицированию ВИЧ. Врач может ошибаться в интерпретации результатов исследования в том случае, если инфицирование вызвано другим серотипом.

Сыворотку крови пациента необходимо исследовать в динамике. Если в течение 6 месяцев не наблюдают клинических проявлений СПИДа и отсутствуют факторы риска, у больного регистрируют отсутствие инфекции.

Сомнительные результаты анализа получают у пациентов, имеющих низкий риск инфицирования. В некоторых случаях появление неясных данных вызывают содержащиеся в сыворотке крови иммунные комплексы и аутоантитела.

У некоторых больных возникновение сомнительных результатов вызвано развитием патологических процессов:

  • инфекционных заболеваний;
  • раковой опухоли;
  • аллергической реакции.

У больного появляются изменения в клиническом анализе крови, наблюдают рост С-реактивного белка или повышение СОЭ. У людей, страдающих инфекционными заболеваниями, часто выявляют сомнительную реакцию иммуноблота на ВИЧ.

Пациенты с неопределенными результатами не могут являться донорами крови и биологических материалов.

Линейный метод

Принцип иммуноблоттинга включает:

  1. Использование нативного вирусного вещества ВИЧ-формат или антигенов в формате Western -Blot.
  2. Соединение белков ВИЧ с отдельными антителами, выявленными в сыворотке крови.
  3. Процесс инкубации, происходящий с добавлением меченных антител к человеческим Ig.
  4. Расшифровку окрашенных полос.

Анализ позволяет врачу своевременно провести интерпретацию результатов исследования. Положительный блот расшифровывают как 2ENV+/- GAG+/POL, неопределенный — 1 ENV+/- GAG+/POL. Отрицательный результат предусматривает отсутствие полос.

Для выполнения анализа применяют рекомбинантный и лизатный иммуноблот. Исследование является специфичным и составляет 99,5%.

Может ли результат анализа быть расшифрован как ложный, интересуются больные. Полученные данные могут быть сформированы в результате стимуляции защитных сил организма (беременности, гемодиализа).

При подозрении на острый ретровирусный синдром и контакт с больным ВИЧ-инфекцией пациенту рекомендуют сдать сыворотку на реакцию ПЦР.

Повторное серологическое исследование подтверждается путем измерения вирусной нагрузки в представленном образе биологического материала.

Диагностика ВИЧ у новорожденных

Анализ на СПИД у ребенка раннего возраста проводят в том случае, если установлен контакт с ВИЧ-инфицированной матерью. Серологические реакции могут быть положительными в течение 1,5 лет. Антитела в сыворотке крови новорожденного обнаруживают с помощью реакций ИФА, РИФ и иммунного блоттинга.

В течение 9 месяцев жизни ребенка положительный результат появляется в связи с наличием в сыворотке крови антител матери. Антиген р24 имеет специфичность около 65%.

В некоторых случаях не удается обнаружить антитела у больного ребенка, если у него диагностировано врожденное низкое содержание глобулинов в крови.

Установленный отрицательный результат иммуноблота не является гарантией отсутствия инфекции.

Тестирование проводят в несколько этапов:

  • на 1-2 сутки после рождения;
  • в 1-2 месяца;
  • в полугодовалом возрасте.

Дальнейшее изучение антител проводят до тех пор, пока не будут получены 2 отрицательных результата иммуноблота. Установление диагноза СПИД у ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной женщины, возможно на основании 2 положительных результатов реакции ПЦР. Передача новорожденному возбудителя ВИЧ-инфекции исключена, если женщина не кормит ребенка грудью.

Исследование при беременности

Будущей матери назначают иммунный и линейный блоттинг, если получен положительный результат на ВИЧ методом ИФА. Если блот подтвержден, пациентка больна СПИДом. В этом случае начиная с 14 недели беременности назначают терапию, предупреждающую инфицирование ребенка.

Может ли ошибиться специалист при выполнении исследования сыворотки крови во время беременности, спрашивают пациентки у лечащего врача. Он обязан выдать на руки беременной женщине копии анализов ПЦР, ИФА для устранения сомнений в их достоверности.

При постановке иммуноблота иногда возникают проблемы, но если ИФА, блот и ПЦР — положительные, диагноз ВИЧ-инфекции подтверждается окончательно. Вероятность получения ложноположительного анализа при беременности велика. В случае если ИФА (+), а иммуноблот (-), женщине предлагают пересдать сыворотку крови.

В обменной карте беременной указывают результат исследования. При его положительном значении женщине запрещают кормить ребенка после родов, чтобы не заразить вирусом СПИДа. Окончательные выводы делают на основании лабораторных, клинических и эпидемиологических исследований. Только после их расшифровки больному ставят диагноз «ВИЧ-инфекция».

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) — сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» — как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.».

Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа.

Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу.

Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

  • Полоска А — Положительный контроль
  • Полоска В — Слабоположительный контроль
  • Полоска С — Отрицательный контроль
  • Полоска D — Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)
Читайте также:  Тимолол капли глазные 0,25% и 0,5% - инструкция по применению, формы выпуска, принцип действия, аналоги и отзывы

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА.

При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции.

Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата.

При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам — структурным белкам оболочки (env) — gp160, gp120, gp41; ядра (gag) — p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) — p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env — gp140, gp105, gp36; gag — p16, p25, p56; pol — p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 — gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ.

Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми.

В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Исследование эффективности метода иммуноблоттинга (тест-система линейного иммуноферментного анализа «INNO- LIA™ SYPHILIS SCORE») у больных ранними формами сифилиса и у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом

Фриго Н.В., Дударева Л.А., Ротанов С.В., Топоровский Л.М., Иванов А.М.

ФГУ ЦНИКВИ Росмедтехнологий, ГКБ №14 им. В. Г. Короленко, ВМА им. С. М. Кирова.

Цель: сравнительноеизучение чувствительности метода иммуноблоттинга (ИБ) и других серологических реакций (РМП, РСК, РПГА, ИФА, РИФ) при диагностике начальных периодов сифилитической инфекции и у лиц, находящихся в возмож-ном инкубационном периоде. Исследование проведено на базе референсной серологической лаборатории ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий».

Материалы и методы: протестированы сыворотки крови 210 пациентов.

Часть из них (110 человек) составила опытную груп-пу, в которую вошли больные первичным (46 человек), вторичным (25 человек) и скрытым ранним сифилисом (25 человек), а также лица, бывшие в половом контакте с больными заразными формами сифилиса (ЛБПК, 14 человек).

Группу контроля (100 человек) составили лица, свободные от сифилитической инфекции: 50 больных дерматозами и 50 доноров.

Диагноз сифилиса был подтвержден результатами клинического обследования, положительным результатом комплекса серологических реакций (РМП, РСК, РПГА, РИФ, ИФА) и данными темнопольной микроскопии (ТПМ). Параллельно проводились исследования методом иммуноблоттинга (коммерческая тест-система «ИННО-Лиа Сифилис усовершенствованный» «INNO — Lia™ Syphilis Score» производства фирмы «Innogenetics N.V.», Бельгия).

Результаты: при обследовании больных первичным сифилисом стандартными серологическими методами наименее чувс-твительной оказалась РСК с кардиолипиновым антигеном (положительный результат получен в 65±7,6% случаев).

Несколько более чувствительными оказались другие реакции комплекса серологических реакций: РСКт (87,5±5,3%) и РМП (88,6±4,9%). Наиболее чувствительными из серологических тестов оказались трепонемные тесты: РИФабс — 100%, ИФА — 97,7±2,3 % и РПГА — 97,4±2,6%.

Чувствительность иммуноблоттинга при первичном сифилисе первоначально была определена как 97,8 %.

При этом у 1 пациента с отрицательным результатом ИБ был выявлен факт неправильного хранения материала перед иссле-дованием, при повторном обследовании больного с исследованием новой порции крови был получен положительный результат ИБ, что позволило сделать вывод о 100%-ной чувствительности метода ИБ.

У больных вторичным сифилисом результаты всех серологических методов (РСК, РМП, РПГА, РИФабс, ИФА, а также иммуноблоттинга оказались положительными (100%-ная чувствительность),что соответствовало современным представлениям о развитии на вторичной стадии сифилитической инфек-ции максимального иммунного ответа организма больных к T.

pallidum и свидетельствовало о нецелесообразности использовать метод иммуноблоттинга для диагностики этой стадии инфекции. При скрытом раннем сифилисе чувствительность РМП и РСКк составила 92,0±5,5%, РСКт -96,0±4,0 %. Чувствительность РПГА, РИФабс и ИФА составила 96,0±4,0%.

При обследовании больных скрытым ранним сифилисом методом иммуноблоттинга положительные результаты были получены у всех пациентов (100%- ная чувствительность). При обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом, положительный ре-зультат в иммуноблоте был получен у 36 % пациентов (5 человек). Кроме ИБ положительный результат был выявлен также в РМП (7% — 1 чел.

) и ИФА (21% — 3 чел.), в то время как другие реакции (РСКТ, РСКК РИФабс и РПГА) оказались отрицательными. Таким образом, иммуноблоттинг оказался наиболее чувствительной реакцией, позволяющей устанавливать инфицированность у лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом.

При тестировании сывороток крови лиц без указаний на наличие сифилитической инфекции (100) все 50 сывороток крови от больных кожными заболеваниями и 48 сывороток крови, взятых от доноров крови, показали отрицательные результаты.

У двух доноров были зарегистрированы положительные результаты имуноблоттинга с невысокими уровнями позитивности реакции с отдельными рекомбинантными белками (на уровне 1-2+).

Последующее обследование этих пациентов с помощью иммуноблот-тинга и других специфических реакций (ИФА, РИФабс), проведенное через 2 недели после первого обследования, позволило установить ложный характер серопозитивности. Таким образом, специфичность линейного иммуноблоттинга при использовании диагностикума «INNO-LiaTM Syphilis Score» составила 98%.

Выводы: результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать применение иммуноблоттинга на ранних стадиях сифилитической инфекции в качестве дополнения к общепринятым методам диагностики в следующих клинических ситуациях: на ранних стадиях инфекции при обследовании лиц, бывших в половом контакте с больными сифилисом; при обследовании пациентов с подозрением на первичный сифилис при отрицательных результатах стандартных серологических реакций (РМП, РСК) и высоком риске заражения сифилисом; для подтверждения диагноза сифилиса скрытого раннего при противоречивых результатах классических серологических методов и необходимости проведения дифференциальной диагностики с ложнопо-ложительными результатами серологических реакций на сифилис.

Иммуноблот антифосфолипидных антител, IgG и IgM

  • Иммуноблот антифосфолипидных антител – иммунологическое исследование, позволяющее в одном лабораторном тесте провести анализ на несколько аутоантител, ассоциированных с развитием антифосфолипидного синдрома.
  • Синонимы русские
  • Иммуноблотинг.
  • Синонимы английские
  • APS Immunoblotting, Antiphospholipid Antibodies Assay, Western Blot Analysis for the detection of Antiphospholipid Syndrome.
  • Какой биоматериал можно использовать для исследования?
  • Венозную кровь.
  • Как правильно подготовиться к исследованию?
  • Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Антифосфолипидный синдром – аутоиммунное заболевание, клинически характеризующееся артериальными и венозными тромбозами, акушерской патологией (прежде всего – привычное невынашивание беременности в I и II триместрах и преждевременные роды), тромбоцитопенией и связанное с циркуляцией в крови антифисфолипидных антител.

Антифосфолипидные антитела не только являются лабораторным маркером АФС, но и играют ведущую роль в патогенезе его клинических проявлений. АФЛА обладают способностью воздействовать на процессы, составляющие основу регуляции системы свертывания крови, сдвигая равновесие в ней в сторону гиперкоагуляции – то есть тромбообразования.

Процесс тромбообразования включает взаимодействие АФЛА с фосфолипидами мембран тромбоцитов, эндотелия (клеток, выстилающих изнутри кровеносные сосуды) и связанными с фосфолипидами плазменными белками.

При АФС потенциально могут поражаться сосуды любого калибра – от капиллярного русла до крупных артерий, что обуславливает чрезвычайно разнообразный спектр клинических проявлений заболевания.

Антифосфолипидные антитела представляют собой семейство иммуноглобулинов разных классов (IgA, IgM и IgG), которые распознают определенные участки молекул фосфолипидов.

Читайте также:  Характеристика движения крови по сосудам. Гидродинамические характеристики сосудистого русла. Линейная скорость кровотока. Что такое сердечный выброс?

Однако, согласно последним исследованиям, выяснилось, что главными мишенями АФЛА являются не сами фосфолипиды, а связывающиеся с ними белки плазмы, так называемые кофакторы.

Комплекс кофактор-фосфолипид формирует новую молекулярную последовательность, к которой вырабатываются специфические антитела.

Таким образом, АФЛА реагируют с гетерогенной группой фосфолипидов и белковых антигенов плазмы крови, к которым относятся:

  • фосфолипиды – кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин и фосфатидиловая кислота;
  • плазменные белки – «кофакторы» – β2-гликопротеин I, протромбин, тромбин, протеин S, протеин С, аннексин V.

Повышенный риск развития инфаркта миокарда на фоне АФС был подтвержден после обнаружения в спектре АФЛА антител к окисленным липопротеинам низкой плотности, играющих ведущую роль в патогенезе атеросклероза.

Используемые в настоящее время диагностические критерии антифосфолипидного синдрома, принятые в 2006 году в Сиднее, помимо двух клинических параметров (тромбозы и акушерская патология), включают также три лабораторных признака – волчаночный антикоагулянт (определяется в фосфолипид-зависимых тестах на свертывание крови), а также антитела к кардиолипину и антитела к β2-гликопротеину I классов IgM и IgG, определяемые методом иммуноферментного анализа.

  • Антитела к кардиолипину являются основной фракцией АФЛА, их присутствие обычно ассоциировано с развитием тромбозов и тромбоцитопений. Выявление повышенного титра антител к кардиолипину на фоне клинической картины тромбозов является основанием для постановки диагноза «АФС».
  • Антитела к β2-гликопротеину I. β2-гликопротеин I – белок сыворотки, обладающий естественной антикоагулянтной активностью. Циркулирующие АФЛА распознают антигенные структуры, формирующиеся при взаимодействии β2-гликопротеина I и кардиолипина. Антитела к кардиолипину и β2-гликопротеину I чаще обнаруживаются у пациентов с первичной формой АФС, а в клинической картине у них преобладают тромбозы глубоких вен и эмболия легочной артерии.

Несмотря на высокую специфичность, применение для диагностики АФС только этих лабораторных критериев не всегда достаточно – тесты могут быть отрицательными при наличии клинических проявлений антифосфолипидного синдрома. Поэтому при наличии у пациента симптомов АФС и отрицательных результатах критериальных лабораторных параметров дополнительно используют определение антител к другим фосфолипидам) и кофакторным белкам.

  • Антитела к аннексину V. Роль аннексина V особенно важна для предотвращения тромбообразования в сосудах плаценты. Этот блок представлен во многих тканях, но в основном на эндотелиальных клетках и в плаценте. Аннексин V играет роль в предотвращении свертывания крови, конкурируя с протромбином (фактор свертывания крови) за связывание с фосфатидилсерином на оболочке клеток эндотелия и трофобласта. Молекулы аннексина V формируют блокирующий слой, и на поверхности трофобласта не происходит тромбообразования. У больных АФС антитела к этому белку вытесняют его с поверхности эндотелиоцитов и клеток трофобласта, что приводит к тромбозам сосудов плаценты и потере беременности. Антитела к аннексину V чаще выявляют при вторичном антифосфолипидном синдроме (возникающем на фоне других аутоиммунных заболеваний), соответственно, в клинической картине таких пациенток чаще встречается синдром привычного невынашивания беременности.
  • Антитела к протромбину. Наличие этих антител является одной из основных причин тромбозов, прежде всего венозных. У пациентов с АФС повышенный уровень антител класса IgM к протромбину выявляют примерно в 30 %, а  IgG — в 18 % случаев заболевания.
  • Антитела к тромбину – один из наиболее чувствительных тестов для диагностики антифосфолипидного синдрома. Наличие этих антител ассоциировано с развитием тромбоэмболических осложнений примерно в 70 % случаев – это самый высокий показатель среди всех маркеров АФС.

Для исследования широкого спектра антифосфолипидных антител используется метод иммунного блотинга. В его основе лежит иммунологическое взаимодействие антитела со специфичным антигеном.

Выпускаемые производителем тест-системы для иммуноблота содержат нитроцеллюлозные полоски, на которых фиксированы антигены фосфолипидов и кофакторных белков. На полоску наносят исследуемую сыворотку, при наличии в ней АФЛА они связываются каждый со своим антигеном.

Визуализацию образованных иммунных комплексов проводят путем добавления специального фермента и красителя. При наличии в сыворотке антифосфолипидных антител на полоске в зонах, соответствующих отдельным антигенам, появятся окрашенные полосы – так фиксируется положительный результат.

Интенсивность окраски полосы можно дополнительно описывать количеством плюсов – это косвенно отражает концентрацию и аффинность (степень сродства) антител.

Для чего используется исследование?

  • Для выявления в крови пациента аутоантител, входящих в семейство АФЛА.

Когда назначается исследование?

  • При несоответствии клинической картины отрицательным результатам тестов, рекомендованных сиднеевскими лабораторными критериями АФС (волчаночный антикоагулянт, антитела классов IgM и IgG к кардиолипину и β2-гликопротеину I).

Что означают результаты?

Референсные значения

Компонент Референсные значения, Ед.ОП
Антитела кардиолипину класса IgG 0 — 30
Антитела к кардиолипину класса IgM 0 — 30
Антитела к фосфатидной кислоте класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидной кислоте класса IgM 0 — 30
Антитела к фосфатидилхолину класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидилхолину класса IgM 0 — 30
Антитела к фосфатидилэтаноламину класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидилэтаноламину класса IgM 0 — 30
Антитела к фосфатидилглицеролу класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидилглицеролу класса IgM 0 — 30
Антитела фосфатидилинозитолу класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидилинозитолу класса IgM 0 — 30
Антитела к фосфатидилсерину класса IgG 0 — 30
Антитела к фосфатидилсерину класса IgM 0 — 30
Антитела к аннексину V класса IgG 0 — 30
Антитела к аннексину V класса IgM 0 — 30
Антитела к бета-2 гликопротеину класса IgG 0 — 30
Антитела к бета-2 гликопротеину класса IgM 0 — 30
Антитела к протромбину класса IgG 0 — 30
Антитела к протромбину класса IgM 0 — 30

Иммунный блотинг — это качественный тест, он дает ответ в формате «обнаружено» или «не обнаружено». Выявление АФЛА свидетельствует в пользу диагноза «антифосфолипидный синдром», однако положительные результаты должны оцениваться только вместе с клинической картиной.

Что может влиять на результат?

Около 5 % здоровых людей имеют повышенный титр АФЛА, чаще это лица пожилого возраста – с возрастом процент АФЛА-позитивных людей, не страдающих АФС, увеличивается.

Частота выявления антифосфолипидных антител увеличивается также у больных воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (сифилис, ВИЧ-инфекция, вирусный гепатит С, герпес-вирусная инфекция), злокачественными новообразованиями, а также на фоне приема некоторых лекарственных препаратов (психотропные средства, оральные контрацептивы). Таким образом, любой из лабораторных признаков при отсутствии клинических симптомов не является достаточным условием для постановки диагноза «АФС».

Важные замечания

Помимо первичного антифосфолипидного синдрома, существует также вторичный, возникающий на фоне других заболеваний соединительной ткани.

При этом у некоторых пациентов появление признаков АФС может предшествовать появлению симптомов первичного соединительнотканного заболевания (системная красная волчанка, узелковый периартериит, системная склеродермия, ревматоидный артрит).

Поэтому при обследовании пациентов с предполагаемым АФС в программу диагностики следует включать определение антинуклеарного фактора в качестве скринингового теста.

Также рекомендуется

  • Антитела к кардиолипину, IgG и IgM
  • Антитела к β2-гликопротеину I, IgG и IgM
  • Волчаночный антикоагулянт
  • Антинуклеарный фактор
  1. Кто назначает исследование?
  2. Гематолог, ревматолог, акушер-гинеколог, ангиохирург, пульмонолог, терапевт, врач общей практики.
  3. Литература
  1. A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, 9th Edition, by Frances Fischbach, Marshall B. Dunning III. Wolters Kluwer Health, 2015. Page 609.
  2. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2016. Page1014.
  3. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. – T. II / Под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. С. 96-99, 150-154.

Антинуклеарные антитела — иммуноблот

Антинуклеарные антитела — иммуноблот (Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1) — тест, использующийся в диагностике аутоиммунных заболеваний соединительной ткани. (системная красная волчанка/СКВ, склеродермия и другие заболевания, синдром Фелти, люпоидный гепатит и и другие заболевания).

Лабораторная диагностика аутоиммуных болезней соединительной ткани

Антинуклеарные антитела — антитела (аутоантитела), образуются против собственных белков, входящих в состав ядра клетки человека. Мишенью для аутоантител являются молекулы ядер — ядерные нуклеопротеиды, ДНК и РНК, гистоны, белки ядрышек, центромеры.

Механизмы и стимулы образования таких антител до конца не выяснены. Образующиеся комплексы антиген-антитела обладают негативным влиянием на структуры различных органов и тканей.

Откладываясь на мембранах клеток почек, кожи, суставов и других органов они повреждают структуру тканей и нарушают их функцию.

Иммуноблот — высокочувствительный метод в диагностике аутоиммунных заболеваний

Применение иммуноблота позволяет одновременно провести обнаружение основных видов антиядерных (антинуклеарных) антител. Это позволяет, с определенной долею вероятности, установить наличие какого-либо из заболеваний соединительной ткани (системных ревматических заболеваний).

  1. Анти- Scl-70 — выявляются при диффузной форме системной склеродермии с частотой встречаемости 25—75%.
  2. Анти- Sm — маркер системной красной волчанки.
  3. Анти- PCNA — высоко специфичны для системной красной волчанки, но встречаются лишь в 3% случаев заболевания.
  4. Анти-АМА-М2 — антитела к антигенам митохондрий используются для диагностики первичного билиарного цирроза. Частота встречаемости достигает 98%.
  5. Анти-CENР-B — присутствие антител к центромерам с высокой специфичностью свидетельствует об ограниченной форме системной склеродермии. Частота встречаемости достигает 80—95%.
  6. SS-A/SS-B — характерны при наличии синдрома Шегрена, системной красной волчанки и лекарственной волчанки новорожденных.
  7. Анти-Jo-1 — Антитела к Jo-1 обнаруживаются у больных полимиозитом (25—35% случаев), а также и при других аутоиммунных заболеваниях — системной красной волчанке, системной склеродермии, интерстициальном фиброзе легких, синдроме Рейно и полисиновите.
  8. Анти-dsDNA (антитела к 2-х спиральной ДНК) — диагностика и мониторинг системной красной волчанки.
  9. Анти-Rib P (рибосомальные Р-белки) — антитела, характерные при системной красной волчанке. Встречаются в 10% случаев.
  10. Анти-Histone (гистоны) — антитела к гистонам характерны для системной красной волчанки, склеродермии, лекарственной волчанки.
  11. Анти- PM-Scl — антитела, характерные при склеродермии в сочетании с полимиозитом.
  12. Анти-Nucleosome (нуклеосомы) — антитела, характерные для системной красной волчанки с высоким риском развития гломерулонефрита.
Читайте также:  Показания к срочным операциям и частота срочных операций при сочетанной травме.

Основные показания для назначения

Дифференциальная диагностика заболеваний соединительной ткани и заболеваний печени аутоиммунной природы (аутоиммунный гепатит, билиарный цирроз, холангит печени). Для повышения качества диагностики рекомендуется проводить комплексные исследования (см. профиль «Ревматологический», «Боли в суставах», «Скрининг болезней соединительной ткани»).

Ана (антинуклеарные антитела)

Синонимы: АНА, антинуклеарные антитела, антинуклеарный фактор, АНФ, антиядерные антитела, antinuclear antibodies, ANAs, Fluorescent Antinuclear Antibody, Antinuclear factor, ANF

Научный редактор: М. Меркушева, ПСПбГМУ им. акад. Павлова, лечебное дело.

Аутоиммунные заболевания, когда иммунная система атакует собственные ткани организма, считаются одними из самых опасных. Большинство аутоиммунных патологий относятся к хроническим и могут вызывать серьезные нарушения в работе внутренних органов и систем.

Одним из наиболее распространенных тестов, применяемых в диагностике аутоиммунных состояний, является обследование на антинуклеарные антитела (АНА), который проводится тремя способами: 

  • методом иммуноферментного анализа ИФА (определяется общий уровень ANA), 
  • методом реакции непрямой иммунофлуоресценции РНИФ (выявляется до 15 разновидностей ANA)
  • методом иммуноблоттинга.

Общие сведения

Антинуклеарные (антиядерные) антитела представляют собой группу аутоантител, которые, вступая в реакцию с ядрами собственных клеток организма, разрушают их.

Поэтому анализ на АНА считается достаточно чувствительным маркером в диагностике именно аутоиммунных нарушений, большая часть из которых сопровождается поражением соединительной ткани.

Однако некоторые из видов антинуклеарных антител обнаруживаются и при заболеваниях не иммунной этиологии: воспалительных, инфекционных, злокачественных и пр.

Наиболее специфичны антинуклеарные антитела к следующим заболеваниям:

  • системная красная волчанка (СКВ) – заболевание кожи и соединительной ткани;
  • дерматомиозит – поражение кожи, мышц, скелетной ткани и т.д.;
  • узелковый периартериит – воспаление артериальной сосудистой стенки;
  • склеродермия – уплотнение и затвердение соединительной ткани;
  • ревматоидный артрит – поражение соединительной ткани суставов;
  • болезнь Шегрена – поражение ткани с железистыми проявлениями (снижение секрета слезных и слюнных желез).

Антинуклеарные антитела могут обнаруживаться более чем у 1/3 больных хроническим рецидивирующим гепатитом. Также уровень АНА может возрастать в случае:

  • инфекционного мононуклеоза (вирусное заболевание, сопровождается массовым поражением внутренних органов);
  • лейкоза (злокачественное заболевание крови) в острой и хронической форме;
  • гемолитической анемии (малокровие в результате разрушения эритроцитов);
  • болезни Вальденстрема (поражение костного мозга);
  • цирроза печени (хроническое заболевание, связанное с изменением структуры печеночной ткани);
  • малярии;
  • лепры (инфекционное поражение кожи);
  • хронической почечной недостаточности;
  • тромбоцитопении (снижение выработки тромбоцитов);
  • лимфопролиферативных патологий (опухоли лимфатической системы);
  • миастении (патологическая утомляемость мышц);
  • тимомы (опухоль из вилочковой железы).

Одновременно с определением антинуклеарных антител в процессе иммуноферментного анализа оценивается концентрация иммуноглобулинов: IgA, IgM, IgG. Обнаружение этих компонентов в крови может свидетельствовать о высокой вероятности развития ревматических заболеваний и коллагенозов.

В случае, когда связь между концентрацией антител и симптоматикой у больного не обнаруживается, само присутствие антиядерных антител в крови является диагностическим критерием и может повлиять на выбор лечения.

Сохранение высокого уровня антинуклеарных антител при продолжительном курсе терапии свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания.

Снижение значений АНА на фоне проводимого лечения может указывать на ремиссию (чаще) или приближающийся летальный исход (реже).

Также антинуклеарные антитела могут быть обнаружены у здоровых людей до 65 лет (3-5% случаев), после 65 (до 37%).

Показания

Исследовать антинуклеарный фактор целесообразно в следующих случаях:

  • Диагностика аутоиммунных и некоторых других системных заболеваний без ярко выраженной симптоматики;
  • Комплексная диагностика системной красной волчанки, ее формы и стадии, а также выбор тактики лечения и составление прогноза;
  • Диагностика лекарственной волчанки;
  • Профилактическое обследование пациентов с диагнозом красная волчанка;
  • Наличие специфических симптомов: продолжительная лихорадка без установленной причины, боли и ломота в суставах, мышцах, кожные высыпания, повышенная утомляемость и т.д.;
  • Наличие симптомов системных заболеваний: поражение кожи или внутренних органов (почки, сердце), артрит, эпилептические припадки и судороги, лихорадка, беспричинное повышение температуры и т.д.;
  • Назначение лекарственной терапии дизопирамидом, гидралазином, пропафеноном, прокаинамидом, ингибиторами АПФ, бета-блокаторами, пропилтиоурацилом, хлорпромазином, литием, карбамазепином, фенитоином, изониазидом, миноциклином, гидрохлортиазидом, статинами, поскольку есть риск развития лекарственной красной волчанки.

Кто дает направление

Помимо врача общей практики, направляют на анализ такие узкие специалисты, как 

  • ревматолог, 
  • дерматовенеролог, 
  • нефролог, 
  • педиатр.

Норма для АНА и факторы влияния

В норме антинуклеарные антител в плазме отсутствуют или определяются в небольшом количестве. Результат зависит от способа выполнения теста:

1. Тест делался методом ИФА

  • менее 0,9 пунктов – отрицательно (норма);
  • от 0,9 до 1,1 пунктов – сомнительно (рекомендуется сделать повторный тест через 7-14 дней);
  • более 1,1 пункта – положительно.

2. Для количественного анализа РНИФ нормой считается титр менее 1:160.
3. Иммуноблоттинг – норма «не обнаружено» (общее заключение / напротив каждого вида антител).

Что может повлиять на результат

  • нарушение правил подготовки пациентом или алгоритма венепункции медработником;
  • прием лекарственных препаратов (карбамазепин, метилдопа, пеницилламин, токаинид, нифедилин и др.);
  • наличие у пациента уремии (отравление продуктами белкового обмена) может дать ложноотрицательный результат.

Важно! Интерпретация результатов всегда проводится комплексно.

Поставить точный диагноз на основании только одного анализа невозможно.

Антинуклеарные антитела в крови (результат положительный)

Обнаружение антинуклеарных антител может указывать на следующие заболевания:

  • системная красная волчанка;
  • панкреатит (воспаление поджелудочной железы) аутоиммунной природы;
  • сахарный диабет I типа;
  • аутоиммунные поражения щитовидной железы;
  • злокачественные поражения внутренних органов;
  • дерматомиозит;
  • аутоиммунный гепатит;
  • заболевания соединительной ткани;
  • болезнь Шегрена;
  • миастения;
  • склеродермия;
  • ревматоидный артрит;
  • диффузный интерстициальный фиброз (поражение легочной ткани в хронической форме);
  • синдром Рейно (ишемия мелких концевых артерий) и т.д.

Повышение титра АНА при количественном иммуноферментном анализе (РНИФ) говорит о:

  • Системной красной волчанке в активной стадии – титр повышен до 98%;
  • Болезни Крона (гранулематозное поражение пищеварительного тракта) – около 15%;
  • язвенном колите (воспаление слизистой толстой кишки) – от 50 до 80%;
  • склеродермии;
  • болезни Шегрена;
  • Болезни Рейно – до 20%;
  • синдроме Шарпа (смешанное заболевание соединительной ткани);
  • лекарственной волчанке.

Важно! При расшифровке анализа важно понимать, что отрицательный результат не исключает наличия аутоиммунных нарушений у пациентов с характерной симптоматикой. Положительный результат без клинической картины аутоиммунного процесса необходимо интерпретировать с учетом данных других лабораторных анализов.

Подготовка

Биоматериал для проведения ИФА на антинуклеарный фактор – сыворотка венозной крови.

  • Венепункция выполняется в утреннее время и натощак (с момента последнего приема пищи должно пройти минимум 8 часов). Пить чистую негазированную воду можно;
  • Непосредственно перед забором крови (за 2-3 часа) не рекомендуется курить и пользоваться никотинозаменителями (пластырь, спрей, жевательная резинка);
  • Накануне и в день процедуры нельзя употреблять алкогольные и энергетические напитки, волноваться и заниматься тяжелой физической работой;
  • За 15 дней до теста по согласованию с лечащим врачом отменяется прием лекарственных препаратов (антибиотики, противовирусные, гормоны и др.);
  • Для получения достоверного результата анализ желательно повторить через 2 недели.

Ответ ИФА можно ожидать в течение 1 суток после венепункции, а в экстренных ситуациях, когда обследование проводится по «cito» – около 3 часов.

Источники: 

  • Информация с сайтов лаборатории Инвитро и Хеликс;
  • Данные Национальной медицинской библиотеки США  PubMed.

Другие анализы ревматологического скрининга

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector